PLD1作为评估肿瘤患者对于化疗药物敏感性的分子标志物的用途

技术领域

本发明涉及预估肿瘤对于化疗药物治疗敏感性的分子标志物，尤其涉及用于预估胰腺癌对于吉西他滨治疗敏感性的分子标志物，本发明进一步涉及用于胰腺癌疗效预测或预后的检测试剂盒，属于胰腺癌对于化疗药物治疗敏感性的分子标志物领域。

背景技术

胰腺癌是一种高度恶性的消化道肿瘤，在全世界癌症死因中排名第四，仅次于结直肠癌，其五年生存率仅为10％。近年来也由于人们吸烟饮酒。生活及饮食的不规律发病率逐年增高，且死亡率也高达8％。由于胰腺癌早期发病隐匿，无明显的症状，故超过80％的患者就诊时已为晚期，失去根治性手术机会。因此不论胰腺癌的新辅助治疗、术后辅助治疗以及姑息治疗中，以化疗为核心的药物治疗都发挥着不可或缺的作用。

胰腺癌被认为是免疫治疗的“黑洞”，现有的免疫检查点抑制剂药物对胰腺癌的治疗并未取得太多成功。且由于胰腺癌组织周围缺乏血液供应，存在着明显的缺氧微环境等原因导致胰腺癌耐药频发。目前未有有效的预估吉西他滨耐药程度的评价手段。

进入21世纪以来，随着分子生物学技术的发展，各种基因或蛋白都被列为影响各种化疗药物代谢与发挥作用的因素。其中吉西他滨现有的与其敏感性相关的因素有核糖核苷酸还原酶M1(RRM1)以及胞嘧啶核苷脱氨酶(CDA),多种研究证实其多态性会影响吉西他滨的药代动力学，但仍未应用到临床。而临床上评价化疗药物的方法还有临床受益反应CBR(Clinical Benefit Response)的评估,是指化疗后与肿瘤相关的症状：例如疼痛，体力状况等，但是由于受到主观因素影响太显著，并且在研究中发现CBR没有包括与疾病和治疗相关的全部症状且未能反映与预后相关的一些重要因素故而未能在临床上广泛应用。除此之外应用较多的即为影像学方法根据化疗前后肿瘤的大小，血供，病灶密度等因素的改变程度来评估肿瘤的化疗疗效，其主要方法有CT,MRI,放射性核素扫描和血管造影等常与上文中提到的CBR一同作为实体瘤化疗疗效的评价手段。

传统的影像学评价手段具有灵敏性，但是特异性较差。由于必须在给药以后评估，故不能及时且准确地反应化疗疗效，特别在微转移的概念提出以后，使得利用影像学评价用药敏感性指导临床用药大大受限。虽然PETCT比一般的形态学检查能够提够更丰富的信息，比如糖代谢，细胞增殖和血流灌注。但是其由于价格昂贵不易在临床上推广。

吉西他滨(Gemcitabine)作为胰腺癌一线化疗方案的基石用药。目前在临床中使用的胰腺癌化疗方案也都是与吉西他滨相配伍。虽然一定程度改善了目前胰腺癌的临床治疗效果，但在治疗过程中也常面临吉西他滨的原发性或获得性耐药。这种耐药的发生很大程度上限制了其在临床中的广泛应用及其作用效果。因此，寻找关键的耐药分子标志物并制定逆转吉西他滨耐药的治疗策略从而实现胰腺癌患者的精准治疗是目前改善胰腺癌预后的主要措施。

磷脂酶D1(PLD1)是磷脂酶D家族中的一员,其蛋白结构包括PH结构域、PX结构域和磷脂酰肌醇4,5-磷酸二酯反应结构域，后者与其细胞膜信号活性相关。既往研究认为PLD1的作用主要在于催化细胞膜上的磷脂酰胆碱分解，生成产物磷脂酸(PA)、胆碱和水，而代谢产物PA是绝大多数报道PLD1发挥生物学功能的主要形式，包括激活mTOR通路引起细胞自噬、调控Hippo通路、调控MAPK和PI3K/AKT通路和引起细胞膜分裂、融合和负向弯曲。研究报道PLD1可通过PA激活AKT通路提高细胞存活、控制细胞极化、激活RAS通路促进细胞增殖和通过调控MMP2和MMP9增强细胞的迁移能力促进转移。

迄今为止，未见有磷脂酶D1在胰腺癌患者中的表达高低与其对化疗药物的敏感度或疗效或预后相关联的任何报道。

发明内容

本发明的一方面是提供PLD1作为分子标志物在制备预估胰腺癌对于吉西他滨治疗敏感性的试剂中的用途。

本发明的另一方面是提供PLD1作为分子标志物在制备预估胰腺癌疗效或预后的检测试剂中的用途。

本发明的在一方面是提供PLD1作为分子标志物在制备检测或评估肿瘤的分化程度或T分期的检测试剂中的用途。

本发明首次发现胰腺导管腺癌中PLD1表达水平与对吉西他滨的敏感程度相关，即，PLD1在胰腺导管腺癌中的表达程度与胰腺癌患者的无复发生存期、对化疗药物响应程度等耐药指标密切相关，PLD1高表达者对吉西他滨耐药程度更高，因此，本发明可指导胰腺导管腺癌的临床治疗以及逆转吉西他滨耐药。

具体的，本发明通过试验发现，PLD1在胰腺癌肿瘤细胞核中高表达时，胰腺癌患者对吉西他滨的敏感性差，促使肿瘤组织对于吉西他滨的耐药发生，因此，本发明确定PLD1能够作为分子标志物诊断或预估胰腺癌对于吉西他滨治疗的敏感性，即如果PLD1在胰腺癌肿瘤细胞核中高表达时，表明胰腺癌患者对于吉西他滨治疗敏感性较差，存在耐药性。

本发明根据临床病理参数与PLD1评分进行单和多因素分析发现PLD1在胰腺癌导管细胞中的表达量与肿瘤的分化程度、T分期相关，与患者的全生存期OS(OverallSurviva)呈负相关，因此，可以将PLD1作为分子标志物来预估胰腺癌疗效或预后，即，如果PLD1在患者的胰腺癌导管细胞的表达量较高，则胰腺癌患者的生存期较短，疗效或预后较差。

本发明的再一方面是提供一种检测胰腺癌导管细胞核中PLD1表达量的检测试剂盒，其中，该检测试剂盒中包含检测PLD1表达的试剂，所述用于检测PLD1表达的试剂可以为PLD1的抗体或其片段，譬如为PLD1单克隆抗体或为PLD1多克隆抗体，最优选为PLD1单克隆抗体。

本领域技术人员可以按照常规方法(参见《抗体制备与使用实验指南》，科学出版社，2010年)制备PLD1单克隆抗体体，譬如可以采用外源表达的PLD1蛋白或化学合成的PLD1蛋白多肽作为抗原免疫动物试验制备的抗体。

作为本发明一种优选的实施方案，所述的检测胰腺癌导管细胞核中PLD1表达量的检测试剂盒可以是免疫组化试剂盒，包含一抗，酶标二抗，抗体稀释液，显色液和磷酸盐缓冲液。其中，所述的一抗是PLD1单克隆抗体。

作为本发明一种优选的具体实施方案，优选的，本发明免疫组化试剂盒中所述的二抗可以是酶标羊抗鼠/兔Ig G聚合物；所述显色液可以是DAB显色液。

将待测组织切片进行预处理后，应用所述的免疫组化试剂盒进行免疫组化分析，通过染色结果判断PLD1的表达情况。

其中，所述待测组织切片的预处理包括脱蜡和水化。

优选地，所述免疫组化分析包括：

(a)、将脱蜡水化后的待测组织切片浸入EDTA抗原修复缓冲液中进行组织抗原修复；

(b)、灭活内源性过氧化物酶活性；

(c)、非特异性封闭；

(d)、将PLD1抗体用抗体稀释液稀释后滴加到待测组织切片进行孵育；

(e)、加酶标二抗进行孵育；

(f)、加显色液进行显色；

(g)、复染；

(h)、脱水、透明、封片；

在对胰腺导管腺癌组织免疫组化中，所述的PLD1高表达的判定包括：切片无杂染，以抗体正常着色部位出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞，在20×10倍的光镜下随机选取5个视野对组织中癌导管细胞阳性着色部分进行观察评分。按照阳性细胞所占比例及分布情况进行评分：0％-≤5％＝0分，5％-25％为1分，26％-59％＝2分，50％-75％为3分，＞75％为4分；目的蛋白染色强度：阴性为0分，弱阳性为1分，中等阳性为2分，强阳性为3分。每个视野中阳性细胞百分数得分和目的蛋白染色强度得分乘积并求总和，染色异构时可独立评分(弱阳与强阳分开计算后求和)。

本发明通过研究发现PLD1在胰腺癌细胞中表达，且其核内表达量与患者对吉西他滨的耐药程度相关。本发明利用分子生物学技术，具体为胰腺癌组织中PLD1的表达量涉及胰腺癌对于吉西他滨耐药程度，并且提供了相关的分子试剂、诊断模型、测试试剂盒和临床分析。首次发现胰腺癌导管细胞中PLD1的表达量高低决定了其对于吉西他滨的敏感性，胰腺癌导管细胞中PLD1的表达量高低与患者预后密切相关。

本发明的主要有益效果包括：PLD1在胰腺癌肿瘤细胞核中的表达与肿瘤的分化程度、T分期相关，并且癌导管细胞核中高表达PLD1的患者，其总生存期短，表明胰腺癌癌导管细胞中高表达PLD1者与术后复发转移相关，是预估胰腺癌患者预后，肿瘤的复发转移以及肿瘤分化程度的生物标记物。在胰腺癌患者的组织标本中寻找与病人预后相关的PLD1生物标记物，更能直接地客观且及时准确地评价患者对预吉西他滨的耐药程度，经济快捷更利于实际操作。

附图说明

图1为胰腺癌组织免疫组化染色PLD1在肿瘤导管细胞核中存在高低表达；PDAC患者进展过程中，正常腺泡组织，ADM胰腺导管细胞化生，以及PDAC患者三者PLD1表达量差异，随着胰腺癌发生发展，PLD1的表达量逐渐升高。

图2为胰腺癌导管细胞核中PLD1高低表达水平与OS-生存曲线；核内PLD1的表达量高的患者组，术后经吉西他滨治疗后预后相比PLD1表达量低的患者预后更差，全生存期更短。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验例1胰腺癌组织中的PLD1表达和对应的临床胰腺癌患者疗效预测或预后之间的相关性分析

1样本收集

本实验收集了天津市肿瘤医院2012年至2015年胰腺癌初次诊断手术切除组织80例，病人在手术之前未进行任何相关针对性化疗方案(病人术前不进行化疗，术后进行吉西他滨治疗。比较术前组织中PLD1表达高低与术后吉西他滨反应敏感程度的关系)，并且邀请医院病理科完成切片工作。另外，根据病历统计年龄、性别、分化程度、TNM分期、肿瘤相对胰腺解剖位置以及被膜侵犯情况，同时统计首次诊断时间、手术时间、死亡时间。此外，对病人进行长时间随访，随访时间为2年。随访数据来源于天津市肿瘤医院随访中心。

2免疫组化

2.1实验试剂

抗体：Anti-PLD1抗体(CST)，快捷型酶标羊抗鼠/兔Ig G聚合物(迈新生物技术公司)，

试剂耗材：抗体稀释液(北京索莱宝科技有限公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉金桥公司)，中性树胶(北京中杉金桥公司)，免疫组化液体蜡笔(北京索莱宝科技有限公司)。

2.2实验步骤

(1)切片使用前，65℃干燥箱烤片至少2h，随后进行脱蜡水化。

(2)石蜡切片脱蜡水化：二甲苯①30min.；二甲苯②30min；无水乙醇①10min；无水乙醇②10min；浓度为95％，85％，75％,60％的乙醇各5min；之后置入蒸馏水5min。

(3)将脱蜡水化后的切片浸入EDTA抗原修复缓冲液中，微波抗原修复，待修复液沸腾后，开始计时2min。

(4)计时结束后停止加热，待修复液冷却至室温后，取出切片。

(5)清水清洗玻片数次后置入3％过氧化氢中(30％过氧化氢，清水稀释配置)，室温避光20min灭活内源性过氧化物酶活性。

(6)PBS缓冲液浸洗切片3次，每次5min。

(7)一抗使用抗体稀释液稀释。PLD1抗体工作液浓度为1:100，擦去组织周围的PBS，组化专用蜡笔圈住组织片后滴加一抗，每片覆盖抗体工作液50μL。将切片放置于湿盒内，4℃过夜孵育抗体。

(8)第二天取出湿盒，置于37℃烤箱中复温1h，之后用PBS浸洗3次每次5min。

(9)孵育二抗，孵育一抗同样的方法滴加二抗，在37℃孵箱中孵育1h，然后用PBS浸洗3次，每次5min。

(10)配制DAB显色液：以试剂2稀释50×试剂1，每片准备50μL。

(11)显色：拭去玻片组织周围PBS，显微镜下观察，在组织区域滴加DAB显色液50μL，显色完毕后放入自来水中停止反应。之后以苏木素染核，染色时间45s，之后清水清洗5min。

(12)梯度酒精脱水：60％，75％，85％，95％梯度乙醇溶液各5min，无水乙醇①与无水乙醇②各10min，二甲苯①②各10min。

(13)取出晾干，中性树胶封片，封片注意排除气泡。

2.3组化结果判定

切片无杂染，以抗体正常着色部位出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞，在20×10倍的光镜下随机选取5个视野对组织中癌导管细胞阳性着色部分进行观察评分。

按照阳性细胞所占比例及分布情况进行评分：

0％-≤5％＝0分，5％-25％为1分，26％-59％＝2分，50％-75％为3分，＞75％为4分；

目的蛋白染色强度：阴性为0分，弱阳性为1分，中等阳性为2分，强阳性为3分。

每个视野中阳性细胞百分数得分和目的蛋白染色强度得分乘积并求总和，染色异构时可独立评分(弱阳与强阳分开计算后求和)。

3数据统计

3.1计算生存期限：

总生存期OS为初次诊断到死亡的时间(除去与疾病无关死因的病人信息)。

3.2截断值

在获得80例病人的组化评分后绘制ROC曲线，并选取约登指数最大的点的间质评分为截断值，截断值评分为4分，高于此截断值为高表达，低于此截断值为低表达。

3.3统计学分析

利用SPSS 23.0对数据进行二分类计数方法并通过卡方检验计算相关性；根据PLD1肿瘤细胞核着色评分高低表达与病人生存时间OS做生存分析，绘制KM生存曲线。

检验水准α＝0.05，P＜0.05考虑有统计学差异。其中“*”代表P<0.05，“**”代表P<0.01“***”代表P<0.0001。

4实验结果

表1胰腺癌组织中的PLD1和对应的临床化疗患者资料之间的相关性分析

表2胰腺癌导管细胞中PLD1表达评分单及多因素分析(*：P<0.05)

根据表1，表2中以及图1和图2中可以看到，PLD1与术后经吉西他滨治疗的患者相关性分析中，TNM分期，组织学分级，淋巴结转移等与肿瘤恶性程度和预后相关的指标与PLD1存在相关性(P＜0.01)，故随着PLD1表达量增高，TNMII III期，G2/3期组织学分级及有淋巴结转移的病历数均增高。