一种治疗急性肺损伤的中药组合物及制备方法和应用

技术领域

本发明属于中药复方制剂技术领域，具体涉及一种治疗急性肺损伤的中药组合物及制备方法和应用。

背景技术

急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)是由各种肺内、外致病因素导致的急性、弥漫性炎症性肺损伤，进而引起急性呼吸衰竭的临床综合征。ALI是常见的呼吸危重症之一，在重症监护病房，其病死率高达40％～50％。

ALI的本质是失控的炎症反应，其发病机制尚未完全阐明，目前仍缺乏有效治疗方法，治疗策略仅在减少细菌负荷量和降低因过度炎症引起的器官损伤等方面，死亡率依旧较高。目前在世界范围内，各种感染性疾病呈现出趋势明确且势头强大的复燃过程，此过程中耐药性的出现与抗生素治疗相依相伴，不可避免，具有高度的必然性，而大量既往治疗中高效稳定的抗生素均遭遇到敏感度下降，甚至治疗失败的困境，特别是近年来“超级细菌”的出现，使得传统抗感染治疗策略和药物研发思路面临重大挑战。

发明内容

针对肠缺血再灌注致急性肺损伤大鼠肠道微生物菌群失调引发免疫性肺损伤的问题，本发明提供了一种治疗急性肺损伤的中药组合物及制备方法和应用。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种治疗急性肺损伤的中药组合物，由以下重量份的原料药制成：生麻黄5～20份、升麻5～20份、当归5～30份、知母5～30份、玉竹5～40份、黄芩5～30份、白芍5～30份、天冬5～40份、青蒿5～40份、鳖甲5～40份、草果5～20份、厚朴5～30份、生石膏5～50份、苍术5～40份、甘草5～20份。

进一步，所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：生麻黄5～10份、升麻5～10份、当归5～30份、知母5～20份、玉竹5～40份、黄芩5～30份、白芍5～30份、天冬5～40份、青蒿5～40份、鳖甲5～40份、草果5～20份、厚朴5～30份、生石膏5～50份、苍术5～40份、甘草5～20份。

进一步，所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：生麻黄10份、升麻10份、当归15份、知母15份、玉竹30份、黄芩15份、白芍15份、天冬30份、青蒿30份、鳖甲30份、草果10份、厚朴15份、生石膏30份、苍术30份、甘草10份。

一种治疗急性肺损伤的中药组合物的制备方法，取用所需重量份的生麻黄、升麻、当归、知母、玉竹、黄芩、白芍、天冬、青蒿、鳖甲、草果、厚朴、生石膏、苍术、甘草，粉碎成细粉，然后混合浸泡30min，煎煮2次，将两次煎煮后过滤物混合，浓缩至终浓度为2g/mL。

一种上述中药组合物在制备治疗急性肺损伤的药物中的用途。

进一步，所述中药组合物的药物剂型包括液体剂型、固体剂型、半固体剂型和气体剂型。

进一步，所述液体剂型包括：芳香水剂、溶液剂、注射剂、合剂、洗剂、涂剂；所述固体剂型包括散剂、丸剂、片剂、膜剂、胶囊剂、颗粒剂；所述半固体剂型包括：软膏剂、糊剂、凝胶剂；所述气体剂型包括：气雾剂、喷雾剂。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

本发明的中药组合物能够有效减轻肠缺血再灌注引起的肺损伤，抑制肺小动脉管腔扩张及血栓形成，保护肺泡及细支气管组织结构，而且能够维持肠粘膜肌层及浆膜的正常结构。本发明通过调节肠道菌群的结构分布及组成，并通过上调机体的免疫反应，防止病原菌定殖。改善肠道菌群的失调，增加可产生短链脂肪酸的有益菌群、抑制有害菌群，起到调整菌群的积极作用。对急性肺损伤有具有明显的治疗效果，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1为肠缺血再灌注肺损伤W/D变化图；

图2为肠缺血再灌注肺损伤病理形态学图；

图3为TLR4、My D88、TRAF6蛋白表达图；

图4为Illumina测序结果的物种分类图；

图5为肠缺血再灌注肺损伤大鼠肠道菌群组成改变(门水平相对丰度)图；

图6为肠缺血再灌注肺损伤大鼠肠道菌群组成改变(属水平相对丰度)图；

图7为肠道菌群物种热图；

图8为大鼠血清中差异代谢物的相对含量图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例提供一种中药组合物，其原料药组成为：生麻黄10g，升麻10g，当归15g，知母15g，玉竹30g，黄芩15g，白芍15g，天冬30g，青蒿30g，鳖甲30g，草果10g，厚朴15g，生石膏30g，苍术30g，甘草10g。

将上述原料药粉碎成细粉，然后混合浸泡30min，煎煮2次，将两次煎煮后过滤物混合，浓缩至终浓度为2g/mL。按常规方法制成芳香水剂。

实施例2

生麻黄14g、升麻8g、当归10g、知母20g、玉竹35g、黄芩25g、白芍10g、天冬8g、青蒿26g、鳖甲14g、草果18g、厚朴24g、生石膏12g、苍术22g、甘草15g。

将上述原料药粉碎成细粉，然后混合浸泡30min，煎煮2次，将两次煎煮后过滤物混合，浓缩至终浓度为2g/mL。按常规方法制成散剂。

实施例3

生麻黄18g、升麻12g、当归24g、知母14g、玉竹15g、黄芩15g、白芍12g、天冬36g、青蒿26g、鳖甲30g、草果15g、厚朴18g、生石膏8g、苍术8g、甘草8g。

将上述原料药粉碎成细粉，然后混合浸泡30min，煎煮2次，将两次煎煮后过滤物混合，浓缩至终浓度为2g/mL。按常规方法制成软膏剂。

实施例4

生麻黄18g、升麻18g、当归20g、知母8g、玉竹15g、黄芩15g、白芍12g、天冬12g、青蒿20g、鳖甲5g、草果20g、厚朴30g、生石膏35g、苍术35g、甘草15g。

将上述原料药粉碎成细粉，然后混合浸泡30min，煎煮2次，将两次煎煮后过滤物混合，浓缩至终浓度为2g/mL。按常规方法制成气雾剂。

实施例5

生麻黄8g、升麻15g、当归5g、知母12g、玉竹25g、黄芩25g、白芍20g、天冬20g、青蒿25g、鳖甲25g、草果10g、厚朴15g、生石膏25g、苍术15g、甘草10g。

将上述原料药粉碎成细粉，然后混合浸泡30min，煎煮2次，将两次煎煮后过滤物混合，浓缩至终浓度为2g/mL。按常规方法制成溶液剂。

实施例6

生麻黄5g、升麻5g、当归5g、知母5g、玉竹5g、黄芩5g、白芍5g、天冬5g、青蒿5g、鳖甲5g、草果5g、厚朴5g、生石膏5g、苍术5g、甘草5g。

将上述原料药粉碎成细粉，然后混合浸泡30min，煎煮2次，将两次煎煮后过滤物混合，浓缩至终浓度为2g/mL。按常规方法制成丸剂。

实施例7

生麻黄6g、升麻12g、当归12g、知母6g、玉竹6g、黄芩24g、白芍24g、天冬36g、青蒿36g、鳖甲12g、草果16g、厚朴24g、生石膏48g、苍术6g、甘草12g。

将上述原料药粉碎成细粉，然后混合浸泡30min，煎煮2次，将两次煎煮后过滤物混合，浓缩至终浓度为2g/mL。按常规方法制成喷雾剂。

实施例8

生麻黄12g、升麻12g、当归22g、知母16g、玉竹32g、黄芩16g、白芍16g、天冬16g、青蒿22g、鳖甲8g、草果16g、厚朴16g、生石膏32g、苍术32g、甘草12g。

将上述原料药粉碎成细粉，然后混合浸泡30min，煎煮2次，将两次煎煮后过滤物混合，浓缩至终浓度为2g/mL。按常规方法制成注射剂。

实施例9

生麻黄10g、升麻10g、当归30g、知母20g、玉竹40g、黄芩30g、白芍30g、天冬40g、青蒿40g、鳖甲40g、草果20g、厚朴30g、生石膏50g、苍术40g、甘草20g。

将上述原料药粉碎成细粉，然后混合浸泡30min，煎煮2次，将两次煎煮后过滤物混合，浓缩至终浓度为2g/mL。按常规方法制成胶囊剂。

实施例10

生麻黄20g、升麻20g、当归30g、知母30g、玉竹40g、黄芩30g、白芍30g、天冬40g、青蒿40g、鳖甲40g、草果20g、厚朴30g、生石膏50g、苍术40g、甘草20g。

将上述原料药粉碎成细粉，然后混合浸泡30min，煎煮2次，将两次煎煮后过滤物混合，浓缩至终浓度为2g/mL。按常规方法制成凝胶剂。

实施例11

一、组合物对肠缺血再灌注诱导急性肺损伤大鼠组织病理损伤的影响

(1)动物、药品与仪器：Wistar雄性大鼠24只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006，体重180g～220g。并经山西中医药大学实验动物伦理委员会批准。

(2)实验仪器：无创动脉夹(北京冀诺泰科技发展有限公司)，粪便DNA提取试剂盒(OMEGA-R6828，美国Omega Bio-Tek公司)，低速离心机(科大创新股份有限公司，KDC-1044)，ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(中科院兰州化学物理研究所，AT.PEG-20M)，高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司，UltiMate3000)，四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(赛默飞世尔科技有限公司，UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS)。

(3)动物模型建立与给药：将大鼠随机分为3组：假手术组(Sham)、模型组(ALI)、实施例1(实施例1)组(28g·kg

腹腔注射10％水合氯醛0.2mL/100gb.w.，仰卧位固定，酒精消毒，取腹部正中切口约3cm入腹，肠管向右拨向体外，0.9％生理盐水浸润的纱布湿润暴露肠管，暴露并游离肠系膜上动脉(superior mesenteric artery，SMA)，以无创动脉夹夹闭SMA造成小肠完全缺血后将小肠还纳回腹腔，闭合腹部手术切口。持续缺血1h后，去除无创动脉夹，组织恢复供血2h，结束实验。假手术组仅游离SMA不做夹闭。

(4)动物处理及样本留取：离断右肺，取右上肺，小心剔除肺外组织，生理盐水漂洗，滤纸吸干肺表面液体，立即置于电子天平上称湿重，后放入60℃烘箱内烘干48h至恒重，计算(W/D)比值。冰上取肺组织和结肠远端，冰生理盐水冲洗后，置4％多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片HE染色。观察肺内出血、肺泡内炎性渗出及中性粒细胞浸润、肺泡壁的增厚程度、肺透明膜形成等情况以0-4量化积分(PI)。采集动物粪便，利用高通量测序方法对样本肠道微生物细菌基因组进行解析。

离断右肺，取右上肺，小心剔除肺外组织，生理盐水漂洗，滤纸吸干肺表面液体，立即置于电子天平上称湿重，后放入60℃烘箱内烘干48h至恒重，计算(W/D)比值。

(5)实施例1对肺组织湿/干重比的影响(如图1为肠缺血再灌注肺损伤W/D变化图所示)：与Sham组相比，ALI组W/D增加(P<0.01)，而实施例1干预后W/D显著降低(P<0.01)，提示实施例1可以有效减轻肠缺血再灌注引起的肺损伤。

(6)实施例1对肺组织病理学的影响(如图2肠缺血再灌注肺损伤病理形态学图所示)：对大鼠肺、结肠远端组织进行HE染色发现，ALI组可见广泛的肺的组织坏死；实施例1组小动脉管腔扩张，血栓形成，肺泡及细支气管未见异常。

结肠远端组织病理结果显示，ALI组小肠粘膜、粘膜下，肌层广泛的坏死，炎细胞浸润，脂肪坏死；实施例1组粘膜未见著变，粘膜下可见血管扩张，充血，间质疏松水肿，肌层及浆膜结构正常。

(7)实施例1对TLR4、My D88、TRAF6蛋白表达含量的影响(如图3所示，图3为TLR4、My D88、TRAF6蛋白表达图(A:Sham组；B:ALI组；C:QYF组))：与Sham组相比，ALI组的大鼠肺组织中的TLR4、MyD88、TRAF6表达水平显著升高，而在给予实施例1治疗后，大鼠肺组织中的TLR4、My D88、TRAF6表达呈现不同程度地降低(P<0.05)。

二、实施例1通过肠道菌群调节发挥抑制肠缺血再灌注致急性肺损伤的作用机制

由微生物群代谢状态驱动的双向对话对于维持个体宿主的健康和稳态至关重要，而这些动态的失调是许多疾病的关键驱动因素，因此针对菌群代谢途径的研究可能为治疗ALI提供新的策略。研究表明，肠道菌群失调通过肠-肺轴影响肺部疾病。肠道菌群失调可能通过破坏肠道屏障的完整性，增加菌群移位的风险。如果离开肠道的菌群向肺部迁移，则会激活肺部的免疫系统，从而加重对肺部的免疫损伤。

(1)肠缺血再灌注致急性肺损伤动物实验及测序分析：构建急性肺损伤模型，分组，喂药，处死，取血清和结肠组织方法同前。参照NEB

(2)实施例1对物种分类及肠道微生物菌群组成的影响：使用Bowtie2将各样本Clean Reads与非冗余基因集进行比对，利用Samtools得到每个基因在样品中的丰度，我们可以获得界(Kingdom)、门(Phylum)、纲(Class)、目(Order)、科(Family)、属(Genus)、种(Species)水平上获得菌群的相对丰度(relative abundance)；对样本内物种进行Alpha多样性计算、Beta多样性分析、比较组间菌群相对丰度的差异、热图热图分析、差异物种筛选。

使用DIAMOND软件，将基因蛋白序列和NCBI-Nr数据库进行蛋白质序列比对，获得物种分类注释信息。对样本的测序序列在物种水平进行比较发现(如图4Illumina测序结果的物种分类图所示(K:界；P:门；C:纲；O:目；F:科；G:属；S:种))，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)在门水平占绝对优势；目水平，Firmicutes下的梭菌目(Clostridiales)、乳酸菌目(Lactobacillales)；科水平，拟杆菌科(Bacteroidaceae)、普雷沃菌科(Prevotellaceae)丰度较高。

肠缺血再灌注致急性肺损伤后大鼠肠道微生物在门、属水平上的组成与假手术假手术组比较有明显差异(如图5、6所示，图5为肠缺血再灌注肺损伤大鼠肠道菌群组成改变(门水平相对丰度)图，图6为肠缺血再灌注肺损伤大鼠肠道菌群组成改变(属水平相对丰度)图)。肠缺血再灌注导致肠道微生物组成发生变化，物种多样性总体下降，且肠道功能障碍的程度与肺损伤程度呈正相关，并对微生物群变化至关重要。而实施例1干预后大鼠肠道厚壁菌门增加，拟杆菌门减少，厚壁菌门与拟杆菌门比值增加；普雷沃菌属相对减少，乳酸菌属，双歧杆菌属相对丰度增高，梭状芽孢杆菌增加，实施例1可以在一定程度上恢复ALI大鼠肠道微生物多样性。

厚壁菌门能够产生机体直接利用吸收的SCFAs，为主要产丁酸盐菌群。乳杆菌作为益生菌，可以预防呼吸道合胞病毒感染引起的气道炎症，和梭状芽胞杆菌可通过Nod2和GM-CSF增强对肺部感染的抵抗力。Prevotella菌种对肺部感染具有公认的致病性可以促进病毒感染，诱导IL-6的产生。梭菌属是产丁酸盐的肠道益生菌，可以抑制有害胃肠道细菌的生长。本实验急性肺损伤组厚壁菌门和拟杆菌门减少，拟杆菌属、普雷沃属、乳酸菌属都相对减少，香农指数减少，辛普森指数增加，表明肠缺血再灌注处理后的急性肺损伤组相对菌群多样性降低。而实施例1可以在一定程度上恢复肠道菌群的多样性，实施例1可能通过调节肠道菌群的结构分布及组成，并通过上调机体的免疫反应，防止病原菌定植。聚类树和PCoA分析中进一步发现Sham组和实施例1组样本中的菌群结构组成较相似。实施例1可以一定程度上改善肠道菌群的失调，增加可产生短链脂肪酸的有益菌群、抑制有害菌群，起到调整菌群的积极作用。

根据每个样品的物种组成和相对丰度进行物种热图分析(如图7所示)。选取丰度前20的属，利用R语言进行聚类分析。从图中可以看出，实施例1药物治疗后与假手术组样品各样本间距离较近，相似度较高，微生物组成和丰度相似性较高，与模型组样品分开。

(3)利用KEGG、GO、COG等数据库进行比对，获得基因的物种注释信息和功能注释信息、功能和物种丰度。从KEGG功能注释的结果来看，急性肺损伤大鼠的肠道菌群功能与Carbohydrate metabolism、Amino acid metabolism、Energy metabolism、Nucleotidemetabolism、catalytic activity和metabolic process等基本代谢途径的失调密切相关。肠道微生物群除了从膳食碳水化合物中获取营养外，还具有代谢活性，如戊糖链球菌能够增加发酵乳的抗氧化活性，通过产生SCFAs，结肠中厌氧的微生物如拟杆菌、罗氏杆菌、双歧杆菌等发酵难消化的碳水化合物，对肠上皮细胞的分化和增殖产生积极影响。COG数据库表明肠道微生物群的改变可能通过代谢途径改善急性肺损伤的症状。实施例1治疗组促进了基础代谢(包括Carbohydrate transport and metabolism、Amino acid transport andmetabolism)，实施例1治疗的急性肺损伤大鼠的改善与这些代谢途径密切相关。

肠道微生物还可以通过细胞因子信号影响宿主免疫系统。共生微生物群刺激TLR4信号，通过髓细胞分化初级反应蛋白(MyD88)激活活化B细胞(NF-κB)的转录因子核因子kappa轻链增强子以诱导促炎基因表达。宿主的先天免疫系统(即TLR4、2、5受体和NLRP3)影响微生物群的组成，而继发于肠道菌群失调或肠道屏障功能障碍的肠道炎症和免疫激活也可能通过多种潜在机制进一步导致肠道、全身免疫炎症反应。微生物来源的刺激是炎症反应的关键介质，参与肠-肺信号沟通。肠道微生物群通过其结构成分和代谢物，限制微生物群从肠腔到循环系统的易位，阻止全身免疫反应。肠道微生物群作为TLR4信号传导的触发因素，在小肠缺血期间诱导TLR信号，进一步激活复杂的信号级联反应，招募衔接分子MyD88)，引起急性肠、肺损伤、炎症和内皮损伤。TRAF6是TLR/IL-1R超家族的下游信号，进一步调控免疫反应。

(4)实施例1对代谢的影响(如图8大鼠血清中差异代谢物的相对含量示意图所示)：使用基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的方法对大鼠血清样本进行代谢谱分析，然后进行多变量分析，以确定关键的生物标志物，获得了ALI组与实施例1治疗后的19种潜在特征代谢物。宿主体内的胆碱代谢物三甲胺(TMA)、二级BA、脱氧胆酸(DCA)以及SCFA等代谢物在没有细菌发酵的情况下无法产生。醚脂质能够调节细胞分化、影响细胞信号传导和通过减少氧化应激作为潜在的内源性抗氧化剂，缩醛磷脂对氧化损伤具有保护作用。肠道微生物组释放的Pan是细胞内CoA合成的限制性前体，在许多慢性炎症性疾病中，Pan和半胱胺对组织持续的代谢、氧化或缺氧应激有很好的调控作用，限制ROS诱导的细胞损伤。实施例1可能通过下调Platelet-activating factor、上调d-pantothenic acid，影响醚脂质代谢及泛酸和辅酶A代谢途径，发挥抗炎、免疫调节的作用。

实施例12

以实施例2～10替换实施例1进行实施例11的试验，同样能达到有效减轻肠缺血再灌注引起的肺损伤，抑制肺小动脉管腔扩张及血栓形成，保护肺泡及细支气管组织结构，而且能够维持肠粘膜肌层及浆膜的正常结构的效果。

综上，本发明通过调节肠道菌群的结构分布及组成，并通过上调机体的免疫反应，防止病原菌定殖。改善肠道菌群的失调，增加可产生短链脂肪酸的有益菌群、抑制有害菌群，起到调整菌群的积极作用。对急性肺损伤有具有明显的治疗效果，具有良好的临床应用前景。

本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。