一种发酵海藻精及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于饲料添加剂领域，尤其涉及一种发酵海藻精及其制备方法和应用。

背景技术

我国海域面积辽阔，海洋经济动物产品养殖业发展迅速，品种及数量均居世界前列。寻找并开发提高免疫力的天然绿色安全的功能性添加剂是目前水产经济动物养殖业最为重要的研究方向。

随着饲料添加剂向高效、安全、环保、多功能方向发展，采用现代生物技术等高新技术研制出具有特定生物活性和功能的新型饲料添加剂—包括饲用活性肽、饲用氨基酸、饲用酶制剂、微生态制剂和植物提取物等五大类已成为当前水产经济动物饲料添加剂行业发展的主要趋势。我国海藻资源丰富，市场广阔，开发潜力大。深入分析海藻的营养成分、研究有效成分的提取工艺对开发海藻类天然生物制品，实现海藻的高值化综合利用具有重要意义。海藻作为饲料添加剂的研究始于20世纪50年代，目前海藻粉相关生物制品作为畜禽饲料添加剂在英国、法国、美国等一些发达国家得到了广泛应用，相关的机构和生产厂家也都已建立。然而，现有技术主要是对海藻多糖的酶解提取，制备得到的海藻饲料添加剂的适口性和消化吸收率不佳，使得动物对海藻中的活性营养物质利用率不高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种发酵海藻精，通过酶解-发酵双重处理相结合的手段，可以提高产物中多糖类物质的含量，应用于饲料中可以提高养殖动物的防病抗病能力，提高饲料的适口性和动物对营养物质的消化吸收。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种发酵海藻精的制备方法，包括以下步骤：采用复合酶对海藻进行酶解，酶解产物中接种EM复合菌液和酿酒酵母菌液进行发酵，发酵产物高温灭活处理后，进行浓缩、干燥，即得发酵海藻精。

优选的，所述海藻由裙带菜、海带和龙须菜按质量比 0.8～1.1:0.8～1.2:0.9～1.1组成。

优选的，所述复合酶包括纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和木瓜蛋白酶，所述纤维素酶的添加量为0.8～1.3％，果胶酶的添加量为0.4～0.6％，木聚糖酶的添加量为0.6～0.85％，木瓜蛋白酶的添加量为0.6～0.85％。

优选的，所述酶解pH值为4.6～5.2，酶解时间为2.5～3.5h，酶解温度为 43～57℃。

优选的，所述EM复合菌液和酿酒酵母菌液的体积比为0.7～1.2:0.8～1.2； EM复合菌液的有效活菌数为1～5×10

优选的，所述菌液总接种量为8.6～11.2％，发酵温度为26～34℃，发酵 pH值为6～7，发酵时间为45～50h。

优选的，在发酵第18～24h期间加入1～2次甲醇进行诱导，每次添加量为发酵液体积的0.4～0.6％。

优选的，所述高温灭活温度为120～130℃，所述浓缩为浓缩至原体积的 45～55％。

本发明还提供了上述制备方法制备得到的发酵海藻精。

本发明还提供了上述发酵海藻精在饲料中的应用。

本发明的有益效果：

本发明克服了现有我国海洋资源大型海藻高值化利用不高的问题，采用酶解-发酵双重处理相结合的手段，研发基于微生物工程、酶工程的新型海藻精生产工艺，获得一种集营养物质、生物活性物质、抗逆因子于一体的发酵海藻精生物制品，所含的物质成分特别是海藻多糖的含量显著提高，并且由于海藻多糖等成分是天然存在的，对环境友好，动物摄取后不存在药物残留问题，是一种绿色环保的饲料添加剂。

本发明制备的发酵海藻精添加于饲料中，可以提高饲料的适口性，提高动物对饲料的消化吸收性能，同时还可以有效提高动物的抗病能力，增加感染病毒后的成活率，特别是可以提高卵形鲳鲹和大口黑鲈抗虹彩病毒的感染能力。

具体实施方式

本发明提供了一种发酵海藻精的制备方法，包括以下步骤：采用复合酶对海藻进行酶解，酶解产物中接种EM复合菌液和酿酒酵母菌液进行发酵，发酵产物高温灭活处理后，进行浓缩、干燥，即得发酵海藻精。

本发明采用酶解-发酵双重处理相结合的手段。先通过酶解过程对大型海藻蛋白的多肽链进行水解切割，释放出具有生物活性的肽片段和大型海藻所独有的抗病害功能的硫酸酯化多糖类结构单元，提高养殖动物的防病抗病能力。然后再通过发酵工艺降解酶解产物中的大分子物质，分解海藻胶质，降低海藻纤维素含量，释放海藻特有的免疫活性物质，将大分子物质降解为分子量相对较小的且有利于动物吸收利用的水溶性物质，提高营养物质的消化吸收性能。

在本发明中，所述海藻选用大型海藻，优选为裙带菜、海带和龙须菜按质量比0.8～1.1:0.8～1.2:0.9～1.1组成，更优选为裙带菜、海带和龙须菜按质量比1:1:1组成。

在本发明中，所述海藻在酶解处理前优选的进行清洗，去除泥沙。

本发明采用复合酶对海藻进行酶解，所述复合酶包括纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和木瓜蛋白酶。作为一种可选的实施方式，本发明将裙带菜、海带和龙须菜分别清洗、去除泥沙，配比混合后进行粉碎、加水，再加入复合酶 (纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和木瓜蛋白酶按添加量混合)进行酶解。

在本发明中，所述纤维素酶的添加量为海藻质量的0.8～1.3％，优选为 0.9～1.1％，更优选为1％；所述果胶酶的添加量为海藻质量的0.4～0.6％，优选为0.45～0.5％；所述木聚糖酶的添加量为海藻质量的0.6～0.85％，优选为 0.7～0.8％，更优选为0.75％；所述木瓜蛋白酶的添加量为海藻质量的 0.6～0.85％，优选为0.7～0.8％，更优选为0.75％。

本发明采用复合酶对海藻进行酶解，所述酶解pH值为4.6～5.2，优选为 5；酶解时间为2.5～3.5h，优选为3h；酶解温度为43～57℃，优选为48～51℃，更优选为50℃。

在本发明中，所述酶解产物直接接种混合菌液进行发酵，所述混合菌液包括EM复合菌液和酿酒酵母菌液，所述EM复合菌液和酿酒酵母菌液的体积比为0.7～1.2:0.8～1.2，优选为0.8～1.1:0.9～1.1，更优选为1:1。

在本发明中，所述EM复合菌液的有效活菌数为1～5×10

作为一种可选的实施方式，本发明先将EM复合菌和酿酒酵母菌分别接种于装有灭菌培养液的种子罐中进行培养15～30h，所述种子罐培养液的成分优选为酵母粉5份、蛋白胨5份、复合微量元素2份(复合维生素和复合矿物盐各1份)、腐质酸钾3份、复合海藻酶解液22份、普通去皮豆粕10份、糖蜜3份、玉米淀粉5份，蒸馏水45份。本发明通过种子罐培养活化菌种，对所述种子罐培养液的具体成分不做限定。优选的，本发明将培养得到的菌液接种于发酵罐中进行发酵处理。

本发明所述混合菌液的接种量为8.6～11.2％，优选为9～10.5％，更优选为10％。

在本发明中，所述发酵温度为26～34℃，优选为29～30℃；所述发酵pH 值为6～7，优选为6.5；所述发酵时间为45～50h，优选为46～48h。

本发明在发酵过程中可添加甲醇进行诱导，促进菌种的高效表达。优选的，本发明在发酵第18～24h期间加入1～2次甲醇进行诱导，甲醇每次的添加量均为发酵液体积的0.4～0.6％，更优选为0.5％。本发明在甲醇诱导后可继续进行培养至发酵结束。

本发明在发酵结束后对发酵产物进行高温灭活。作为一种可选的实施方式，本发明将发酵产物移入灭活罐中，120～130℃高温灭活，所述温度优选为125℃。

本发明将灭活后的产物送入浓缩设备中进行浓缩，优选为浓缩至原体积的45～55％，更优选为50％。

本发明将浓缩产物送入喷雾干燥设备中进行干燥处理，最终获得发酵海藻精微粒制品。优选的，浓缩产物可先送入标配罐中完成标配，随后再进行干燥处理。

本发明对制备得到的发酵海藻精进行产品检测，其多糖得率最高可达到 45％以上，其中海藻低聚糖含量≥28％，海藻硫酸基多糖含量≥8％。

本发明将上述发酵海藻精应用于饲料中，作为饲料功能性添加剂使用，所述饲料优选为水产饲料。

在鱼类养殖中，高温季节投喂含0.05～0.2％发酵海藻精的饲料，可以有效的提高鱼类抗病毒感染能力，增加感染病毒后的成活率。同时，添加海藻精的饲料适口性好，海藻精属于大型海藻的天然组分，鱼体摄取后不存在药物残留问题，符合绿色健康水产品的要求。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

在具体实施例中，纤维素酶购自Sigma公司，产品编号为C1184-100KU， 0.3U/mg；果胶酶购自Sigma公司，产品编号为P4716-100KU，5U/mg；木聚糖酶购自Sigma公司，产品编号为X2753-50g，2500U/g；木瓜蛋白酶购自Sigma公司，产品编号为76216-250MG，10U/mg。EM复合菌购自郑州农盛乐生物科技有限公司；酿酒酵母菌购自安琪酵母股份有限公司。

实施例所述的增重率、饲料系数和成活率分别按以下公式计算：

增重率(％)＝100×(饲养后平均体重-初始平均体重)/初始平均体重饲料系数＝养殖期所投喂饲料重/(饲养后总重-初始总重)

成活率(％)＝(实验结束时的条数/实验开始时的条数)×100％。

实施例1

本实施例提供了一种发酵海藻精的制备方法，包括以下步骤：

(1)将裙带菜、海带和龙须菜分别清洗、去除泥沙，将裙带菜、海带和龙须菜按质量比1:1:1混合，粉碎，按料液比1g/mL加水；

(2)调节底物pH至5，然后加入复合酶，其中纤维素酶的添加量为 1.1％，果胶酶的添加量为0.5％，木聚糖酶的添加量为0.7％，木瓜蛋白酶的添加量为0.75％；

(3)控制酶解温度为50℃，酶解3h；

(4)酶解产物调节pH至6.5，加入10％混合菌液，其中EM复合菌液和酿酒酵母菌液的体积比为1:1，EM复合菌液的有效活菌数为2.4×10

(5)控制发酵温度为30℃，连续发酵48h；

(6)将发酵产物移入灭活罐中，125℃高温灭活；

(7)灭活后的产物送入浓缩设备中浓缩至原体积的50％，随后送入喷雾干燥设备中进行干燥处理，得发酵海藻精微粒制品。

实施例2

本实施例提供了一种发酵海藻精的制备方法，包括以下步骤：

(1)将裙带菜、海带和龙须菜分别清洗、去除泥沙，将裙带菜、海带和龙须菜按质量比0.9:1.1:0.9混合，粉碎，按料液比1g/mL加水；

(2)调节底物pH至4.8，然后加入复合酶，其中纤维素酶的添加量为 1％，果胶酶的添加量为0.6％，木聚糖酶的添加量为0.8％，木瓜蛋白酶的添加量为0.7％；

(3)控制酶解温度为48℃，酶解3.5h；

(4)酶解产物调节pH至6，加入9％混合菌液，其中EM复合菌液和酿酒酵母菌液的体积比为0.9:1.1，EM复合菌液的有效活菌数为3×10

(5)控制发酵温度为32℃，连续发酵47h；

(6)将发酵产物移入灭活罐中，120℃高温灭活；

(7)灭活后的产物送入浓缩设备中浓缩至原体积的48％，随后送入喷雾干燥设备中进行干燥处理，得发酵海藻精微粒制品。

实施例3

本实施例提供了一种发酵海藻精的制备方法，包括以下步骤：

(1)将裙带菜、海带和龙须菜分别清洗、去除泥沙，将裙带菜、海带和龙须菜按质量比1:1:1混合，粉碎，按料液比1g/mL加水；

(2)调节底物pH至5，然后加入复合酶，其中纤维素酶的添加量为 1.1％，果胶酶的添加量为0.5％，木聚糖酶的添加量为0.7％，木瓜蛋白酶的添加量为0.75％；

(3)控制酶解温度为50℃，酶解3h；

(4)配制种子罐培养液：酵母粉5份、蛋白胨5份、复合微量元素2 份(复合维生素和复合矿物盐各1份)、腐质酸钾3份、复合海藻酶解液22 份、普通去皮豆粕10份、糖蜜3份、玉米淀粉5份，蒸馏水45份；分别将 EM复合菌和酿酒酵母菌接种于种子罐中，30℃培养24h；

(5)酶解产物调节pH至6.5，加入10％混合菌种子液，其中EM复合菌种子液和酿酒酵母菌种子液的体积比为1:1，EM复合菌液的有效活菌数为 2.42×10

(6)控制发酵温度为30℃，连续发酵48h；

(7)将发酵产物移入灭活罐中，125℃高温灭活；

(8)灭活后的产物送入浓缩设备中浓缩至原体积的50％，随后送入喷雾干燥设备中进行干燥处理，得发酵海藻精微粒制品。

实施例4

本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤(5)中，控制发酵温度为30℃，在发酵第18h时加入0.5％(V/V)甲醇进行诱导，在发酵第24h再次加入 0.5％(V/V)甲醇进行诱导，共发酵48h。

实施例5

本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤(5)中，控制发酵温度为30℃，在发酵第20h时加入0.5％(V/V)甲醇进行诱导，共发酵48h。

实施例6

本实施例提供了一种发酵海藻精的制备方法，包括以下步骤：

(1)将裙带菜、海带和龙须菜分别清洗、去除泥沙，将裙带菜、海带和龙须菜按质量比1:1:1混合，粉碎，按料液比1g/mL加水；

(2)调节底物pH至5，然后加入复合酶，其中纤维素酶的添加量为1.1％，果胶酶的添加量为0.5％，木聚糖酶的添加量为0.7％，木瓜蛋白酶的添加量为0.75％；

(3)控制酶解温度为50℃，酶解3h；

(4)配制种子罐培养液：酵母粉5份、蛋白胨5份、复合微量元素2 份(复合维生素和复合矿物盐各1份)、腐质酸钾3份、复合海藻酶解液22 份、普通去皮豆粕10份、糖蜜3份、玉米淀粉5份，蒸馏水45份；分别将 EM复合菌和酿酒酵母菌接种于种子罐中，30℃培养24h；

(5)酶解产物调节pH至6.5，加入10％混合菌种子液，其中EM复合菌种子液和酿酒酵母菌种子液的体积比为1:1，EM复合菌液的有效活菌数为 2.42×10

(6)控制发酵温度为30℃，在发酵第19h时加入0.5％(V/V)甲醇进行诱导，在发酵第24h再次加入0.5％(V/V)甲醇进行诱导，共发酵50h；

(7)将发酵产物移入灭活罐中，125℃高温灭活；

(8)灭活后的产物送入浓缩设备中浓缩至原体积的50％，随后送入喷雾干燥设备中进行干燥处理，得发酵海藻精微粒制品。

对比例1

本对比例与实施例6的区别仅在于：步骤(2)中，调节底物pH至5，然后加入复合酶，其中纤维素酶的添加量为1.3％，果胶酶的添加量为0.7％，木瓜蛋白酶的添加量为1.05％。

对比例2

本对比例与实施例6的区别仅在于：步骤(2)中，调节底物pH至5，然后加入复合酶，其中纤维素酶的添加量为1.3％，木聚糖酶的添加量为 0.9％，木瓜蛋白酶的添加量为0.85％。

对比例3

本对比例与实施例6的区别仅在于：步骤(5)中，酶解产物调节pH至 6.5，加入10％EM复合菌种子液。

对比例4

本对比例与实施例6的区别仅在于：步骤(5)中，酶解产物调节pH至 6.5，加入10％酿酒酵母菌种子液。

对比例5

本对比例与实施例6的区别仅在于：

步骤(4)中，分别将乳酸菌和酵母菌接种于种子罐中，30℃培养24h；

步骤(5)中，加入10％混合菌种子液，其中乳酸菌种子液和酵母菌种子液的体积比为1:1。

实施例7

分别对实施例6和对比例1～5制备得到的发酵海藻精产品进行检测，产品主要成分检测结果如下：

实施例6所得发酵海藻精产品中，海藻多糖≥42％，其中硫酸基多糖≥ 17％；诱食物质DMPT≥1.1；灰分≤25％；葡萄糖≤22％；半乳糖≤3.2％；钙1.52％；镁1.2％；钾1.8％；

对比例1～5所得发酵海藻精产品中，海藻多糖含量显著降低，仅为实施例6产品中海藻多糖含量的20～45％，且硫酸基多糖含量极低。

实施例8

本实施例提供了卵形鲳鲹实验研究。

购买市售某知名公司卵形鲳鲹专用商业饲料，经粉碎后加入0.1％的海藻精制品(实施例6制备得到)，重新用制粒机制成颗粒饲料，放置于阴凉处风干后，-20℃冰箱中保存备用。在卵形鲳鲹养殖实验中，除饲料的选择不同外，其他均保持相同(采用单因素对比方法)。

通过56天养殖实验验证比较，市售饲料和海藻精添加饲料生长效果如表1所示。

表1不同饲料条件下卵形鲳鲹的饲养效果

由表1可知，市售商业饲料喂养的平均末体重为97.57g，本发明海藻精制品添加饲料喂养的平均末体重为110.54g，卵形鲳鲹体重增大13.29％；市售商业饲料喂养的WG是1105，本发明海藻精制品添加饲料喂养的WG是 1265，增重率(WG)增大14.48％；市售商业饲料喂养的FCR为1.55，本发明海藻精制品添加饲料喂养的FCR为1.26，饲料系数(FCR)减小18.71％；市售商业饲料喂养的成活率为81.67％，本发明海藻精制品添加饲料喂养的成活率为93.33％，成活率提高11.66％；攻毒后，市售商业饲料喂养的成活率为40％，本发明海藻精制品添加饲料喂养的成活率为65％，成活率提高 25％。

表明本发明制备的发酵海藻精添加于饲料中，可以提高饲料的适口性，提高动物对饲料的消化吸收性能，达到增重功效；同时还可以有效提高动物的抗病能力，增加感染病毒后的成活率，可以提高卵形鲳鲹抗虹彩病毒的感染能力。

实施例9

本实施例提供了大口黑鲈实验研究。

购买市售某知名公司大口黑鲈专用商业饲料，经粉碎后加入0.1％的海藻精制品(实施例6制备得到)，重新用制粒机制成颗粒饲料，放置于阴凉处风干后，-20℃冰箱中保存备用。在大口黑鲈养殖实验中，除饲料的选择不同外，其他均保持相同(采用单因素对比方法)。

通过56天养殖实验验证比较，市售饲料和海藻精添加饲料生长效果如表2所示。

表2不同饲料条件下大口黑鲈的饲养效果

由表2可知，市售商业饲料喂养的平均末体重为75.32g，本发明海藻精制品添加饲料喂养的平均末体重为89.87g，大口黑鲈体重增大19.31％；市售商业饲料喂养的WG是645.7，本发明海藻精制品添加饲料喂养的WG是789.8，增重率(WG)增大22.32％；市售商业饲料喂养的FCR为1.45，本发明海藻精制品添加饲料喂养的FCR为1.06，饲料系数(FCR)减小26.90％；市售商业饲料喂养的成活率为90％，本发明海藻精制品添加饲料喂养的成活率为100％，成活率提高10％；攻毒后，市售商业饲料喂养的成活率为25％，本发明海藻精制品添加饲料喂养的成活率为75％，成活率提高50％。

表明本发明制备的发酵海藻精添加于饲料中，可以提高饲料的适口性，提高动物对饲料的消化吸收性能，达到增重功效；同时还可以有效提高动物的抗病能力，增加感染病毒后的成活率，可以提高大口黑鲈抗虹彩病毒的感染能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。