一种利用大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌共培养合成圣草酚的方法

技术领域

本发明属于代谢工程及合成生物学领域，具体涉及一种利用大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌共培养合成圣草酚的方法。

背景技术

圣草酚(eriodictyol)是一种二羟基黄烷酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、神经保护等生理活性，在食品、医药及化妆品等行业中广泛应用。

利用生物合成法生产圣草酚具有绿色环保、操作简便、条件可控等优势。目前，已经在大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)、酿酒酵母菌、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum，C.glutamicum)、解脂耶氏酵母等微生物细胞工厂中实现了圣草酚的生物合成。其中，谷氨酸棒杆菌是一种食品级安全菌株(GRAS)，与传统的底盘微生物大肠杆菌相比，它具有不存在内毒素的污染以及不易被噬菌体攻击等特性，被广泛应用于谷氨酸、赖氨酸等氨基酸产品和有机酸的工业生产中。

在现有技术中，已有研究成功地在谷氨酸棒杆菌中实现了从L-酪氨酸到圣草酚的转化。然而为了进一步降低成本，提高经济效益，从头合成圣草酚是一种有效的方法。但如若在单一菌株中利用葡萄糖生物合成圣草酚，存在着途径复杂、容易增加细胞代谢负担、导致细胞生长损伤等问题。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌共培养合成圣草酚的方法，以葡萄糖为底物，通过谷氨酸棒杆菌与大肠杆菌共培养的方式可减少每个组成菌株的代谢负担，从而有助于提高整体生物生产转化效率。

本发明通过以下技术方案实现：

一种利用大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌共培养合成圣草酚的方法，包括：

步骤1，将大肠杆菌进行种子培养，得到大肠杆菌种子培养液；

步骤2，将大肠杆菌种子培养液转接至AMM液体培养基中进行培养，得到发酵培养体系1；

步骤3，在发酵培养体系1中加入IPTG诱导继续培养，得到发酵培养体系2；

步骤4，将重组谷氨酸棒杆菌进行种子培养，得到重组谷氨酸棒杆菌种子培养液；所述重组谷氨酸棒杆菌是在谷氨酸棒杆菌宿主菌中引入酪氨酸解氨酶基因、4-香豆酸辅酶A连接酶基因、查尔酮合成酶基因、查尔酮异构酶基因、丙二酰辅酶A合成酶基因、二羧酸转运蛋白基因和羟化酶基因hpaBC得到；

步骤5，将重组谷氨酸棒杆菌种子培养液接入发酵培养体系2中继续培养，得到发酵培养体系3；

步骤6，在发酵培养体系3中加入IPTG进行诱导，同时加入丙二酸钠继续培养以生产圣草酚。

优选的，步骤1中，所述大肠杆菌为E.coli BAK10。

优选的，步骤4中，所述谷氨酸棒杆菌宿主菌为C.glutamicum ATCC13032_DE3。

优选的，步骤4中，所述重组谷氨酸棒杆菌的制备方法，包括：

(1)构建含有酪氨酸解氨酶基因、4-香豆酸辅酶A连接酶基因、查尔酮合成酶基因、查尔酮异构酶基因的穿梭质粒pZM1-RgTAL-Pc4CL-PhCHS-MsCHI，并转入谷氨酸棒杆菌宿主菌中获得重组菌株；

(2)通过PCR反应将羟化酶基因hpaBC与丙二酰辅酶A合成酶基因和二羧酸转运蛋白基因整合，获得质粒pEKEx3-MatBC-HpaBC，转入重组菌株中，获得重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum NE1。

进一步的，步骤(2)中，所述羟化酶基因hpaBC是从大肠杆菌基因组中扩增获得。

优选的，在步骤5之前，去除发酵培养体系2中的绝大部分大肠杆菌。

优选的，步骤5中，在接入重组谷氨酸棒杆菌种子培养液的同时，向发酵培养体系2中补充2～5倍浓缩的新鲜AMM培养基和30％～50％(m/v)葡萄糖。

优选的，步骤6中，每间隔18-30h向发酵培养体系3中补充30％～50％(m/v)葡萄糖。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明构建了一株重组谷氨酸棒杆菌，引入酪氨酸解氨酶基因、4-香豆酸辅酶A连接酶基因、查尔酮合成酶基因、查尔酮异构酶基因使得重组菌株可生产柚皮素，引入丙二酰辅酶A合成酶基因、二羧酸转运蛋白基因可以实现丙二酸钠盐到丙二酰辅酶A的转化，提高丙二酰辅酶A的供给，从而提高柚皮素的产量，引入羟化酶基因hpaBC表达的羟化酶能将柚皮素转化为圣草酚，从而避开了原核生物中P450酶表达的限制，使其能以L-酪氨酸为底物合成圣草酚。本发明采用构建的谷氨酸棒杆菌与大肠杆菌通过分段式共培养的方式实现了圣草酚以葡萄糖为底物的从头合成。首先，以大肠杆菌作为上游菌株以葡萄糖为底物生产L-酪氨酸，通过培养，在培养体系中得到L-酪氨酸，然后接入下游菌株重组谷氨酸棒杆菌，将L-酪氨酸转化为圣草酚。通过谷氨酸棒杆菌与大肠杆菌共培养的方式，以葡萄糖为底物，将代谢途径模块化，可减少每个组成菌株的代谢负担，从而有助于提高整体生物生产转化效率，分段式共培养的方式降低了上游菌株对下游菌株的生长抑制，从而有利于圣草酚的生产。本发明为在谷氨酸棒杆菌中进一步构建用于生产其他黄酮类化合物的生物底盘细胞奠定了基础，同时也为构建大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的黄酮类化合物共培养体系及共培养方式提供了参考。

进一步的，在接入下游菌株之前，去除培养体系中的绝大部分上游菌，能进一步降低上游菌株对下游菌株的生长抑制。

进一步的，在接入下游菌株时补充AMM培养基，对于下游菌株生长代谢至关重要，能使其获得充足的营养供给后快速生长。

进一步的，后续补充一定量的葡萄糖有利于下游菌株的生长。

附图说明

图1为不同共培养方法C.glutamicum NE1生长情况比较；

图2为补充不同营养物质发酵过程中E.coli BAK10(A)和C.glutamicum NE1(B)生长变化。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行描述，这些描述只是进一步解释本发明的特征和优点，并非用于限制本发明的权利要求。

本发明首先构建了一株重组谷氨酸棒杆菌，并提供一种利用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌共培养从头合成圣草酚的方法，以E.coli BAK10作为上游L-酪氨酸生产菌株，为下游菌株C.glutamicum NE1提供前体物质生产圣草酚。

以C.glutamicum ATCC13032_DE3为宿主菌株，构建圣草酚生产菌株C.glutamicumNE1，具体包括以下步骤：

(1)利用基因工程及代谢工程的手段，构建含有酪氨酸解氨酶TAL(深红酵母，Rhodotorula glutinis,Rg)、4-香豆酸辅酶A连接酶4CL(欧芹，Petroselium crispum，Pc)、查尔酮合成酶CHS(矮牵牛花，Petunia hybrida，Ph)和查尔酮异构酶CHI(紫苜蓿，Medicagosativa，Ms)四种关键酶编码基因的穿梭质粒pZM1-RgTAL-Pc4CL-PhCHS-MsCHI，将其转入C.glutamicum ATCC13032_DE3中获得可生产柚皮素的重组菌株；

(2)从大肠杆菌基因组中扩增获得hpaBC基因，所用到的引物如表1，随后通过PCR反应将hpaBC基因与丙二酰辅酶A合成酶基因matB和二羧酸转运蛋白基因matC(三叶草根瘤菌，Rhizobium trifolii,Rt)整合，获得质粒pEKEx3-MatBC-HpaBC，转入上述步骤(1)获得的重组菌株中，获得从L-酪氨酸合成圣草酚的重组菌株C.glutamicum NE1。丙二酰辅酶A合成酶基因matB和二羧酸转运蛋白基因matC的引入可以实现丙二酸钠盐到丙二酰辅酶A的转化，提高丙二酰辅酶A的供给，从而提高柚皮素的产量。

表1扩增hpaBC基因用到的引物

利用E.coli BAK10和C.glutamicum NE1共培养合成圣草酚，具体包括以下步骤：

步骤1，将上游菌株E.coli BAK10进行种子培养；

步骤2，将步骤1获得的E.coli BAK10种子培养液转接至新鲜的AMM液体培养基中进行培养；

步骤3，经步骤2后，在发酵培养体系中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导继续培养；

步骤4，将下游菌株C.glutamicum NE1进行种子培养；

步骤5，将步骤4获得的种子培养液接入步骤3的发酵培养体系中继续培养；

步骤6，经步骤5后，在发酵培养体系中加入IPTG进行诱导，同时加入丙二酸钠继续培养以生产圣草酚。

所述步骤5中，在接入C.glutamicum NE1的种子培养液前先通过离心去除步骤3发酵培养体系中的绝大部分E.coli BAK10；在接入C.glutamicum NE1的种子培养液的同时，向步骤3发酵培养体系中补充2～5倍浓缩的新鲜AMM培养基和初浓度为30％～50％(m/v)葡萄糖。

步骤6中，在生产圣草酚的过程中每间隔18-30h向发酵培养体系中补充30％～50％(m/v)葡萄糖。

实施例E.coli BAK10和C.glutamicum NE1共培养发酵生产圣草酚

(1)发酵培养基

LB培养基：20g LB肉汤定容至1000mL，121℃，高压蒸汽灭菌20min，常温保存。

BHI培养基：37g脑浸心培养基定容至1000mL，121℃，高压蒸汽灭菌20min，常温保存。

AMM培养基：10×Salt Stock，40％(m/v)葡萄糖溶液，1M MgSO

(2)培养步骤

1)将E.coli BAK10接种到含有25mg/L壮观霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养14h。

2)将步骤1获得的培养物转接到含有25mg/L的壮观霉素和卡那霉素的15mL新鲜的AMM液体培养基中，30℃，200rpm条件下培养至OD600＝0.6-0.8；

3)经过步骤2)后，在发酵培养体系中加入0.1mM IPTG诱导继续培养；

4)将C.glutamicum NE1接种到含有25mg/L壮观霉素和卡那霉素的BHI液体培养基中，30℃，200rpm条件下培养14h；

5)在步骤3)诱导培养48h时将培养液在4℃、5000rpm条件下离心10min去除绝大部分E.coli BAK10，随后将步骤4)获得的培养物转接到补充有2.5倍浓缩的新鲜AMM培养基和40％(m/v)葡萄糖的发酵培养体系中，在30℃，200rpm条件下培养5h；

6)经步骤5)后，在发酵培养体系中加入0.5mM IPTG进行诱导，同时加入2g/L丙二酸钠继续培养以生产圣草酚。

7)在生产圣草酚的过程中每间隔24h向发酵培养体系中补充一次40％(m/v)葡萄糖。

(3)产物圣草酚HPLC检测方法

利用高效液相色谱HPLC对获得的发酵上清进行分析以测定圣草酚的产量。

样品处理方法：将发酵上清液在12,000rpm条件下离心10min后取上清转移至液相小瓶的内衬管中。

采用Agilent 1200系列高效液相色谱，Eclipse XDB-C18。

HPLC检测条件为：C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)；流速1mL/min的梯度洗脱，流动相为水+0.1％甲酸(A)和乙腈+0.1％甲酸(B)，洗脱程序为0-10min B(10-40％)，10-15min B(40-60％)，15-20min B(60-10％)。检测器为紫外检测器，检测波长为280nm，进样量为10μL。以圣草酚和柚皮素混合标品绘制标准曲线，标准曲线至少设置4-5个点标定，相关系数R

对比例为更好验证本发明中所采用的共培养方法有利于下游菌株C.glutamicumNE1的生长，从而有利于圣草酚的生产，本发明进行了如下的对比试验：

对比例1：在共培养发酵体系中，设置了三种不同的补料方式：①在接入C.glutamicum NE1时补充2.5倍浓缩的AMM培养基和40％葡萄糖，发酵过程中每间隔24h补充无菌水；②在接入C.glutamicum NE1时仅补充40％葡萄糖，发酵过程中每间隔24h补充40％葡萄糖；③在接入C.glutamicum NE1时补充2.5倍浓缩的新鲜AMM培养基和40％葡萄糖，发酵过程中每间隔24h时补充40％葡萄糖。

如图2所示，在共培养体系中，AMM培养基的补充对于下游菌株生长代谢至关重要，而未补充新鲜AMM培养基的实验组②在48h-60h中，由于缺少充足的营养物质，导致体系中E.coli BKA10作为优势菌株继续积累L-酪氨酸，而其它两组中C.glutamicum NE1获得充足的营养供给后快速生长，进而迅速消耗L-酪氨酸。随着发酵的进行，营养物质也在不断消耗，后续补充一定量的葡萄糖有利于菌株的生长。

对比例2：在向发酵体系中接入C.glutamicum NE1时，不通过离心去除绝大部分E.coli BAK10，将下游菌株C.glutamicum NE1直接接入E.coli BAK10的培养液中，其余步骤均同本发明实施例2。

如图1所示，本发明所采用的分段式共培养方式中，下游菌株C.glutamicum NE1的生长相较于对比例更加旺盛，表明E.coli BAK10的存在确实对C.glutamicum NE1的生长造成一定程度的抑制，从而不利于圣草酚的生物合成。分析造成这种抑制的原因可能是由于大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的生长周期不同，在发酵体系中，由于大肠杆菌的生长速度更快，获取营养的速度更快，所以作为优势菌株对谷氨酸棒杆菌产生抑制作用。

本发明构建了一种大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌组成的共培养体系，实现了黄酮类物质圣草酚的从头合成。以C.glutamicum ATCC13032_DE3为出发菌株，通过构建柚皮素合成模块、羟基化模块以及辅因子丙二酰辅酶A强化模块得到了工程菌株C.glutamicum NE1，实现了以L-酪氨酸为底物合成圣草酚；将C.glutamicum NE1与生产L-酪氨酸的工程大肠杆菌BAK10通过分段式共培养，从而实现了圣草酚的从头合成。本发明可为圣草酚合成体系的进一步优化以及其他黄酮类化合物的生物合成提供参考。