一种鸭疫里默氏杆菌噬菌体及其分离方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种鸭疫里默氏杆菌噬菌体及其分离方法和应用。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌(RA)是感染家鸭、鹅、火鸡及其他家禽和野禽的一种接触传染性疾病，又称新鸭病、鸭败血症、鸭疫败血症、鸭疫综合征和传染性浆膜炎。该病呈急性或慢性败血症经过，其特征性病变是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪型输卵管炎和脑膜炎。也可能发生无任何症状的呼吸道感染。染病鸭死亡率高、消瘦、酮体淘汰、品质下降，给养殖户带来巨大经济损失。鸭疫里默氏杆菌(RA)血清型较多，且不同血清型之间无交叉反应性，不产生交叉保护作用。国内相关的研究专家，经过多年对RA的血清型进行鉴定与分析后，认为血清1、2、6、7、10型是我国大部分地区的优势血清型，掌握流行的优势血清型，能够为RA药物的开发及综合防控提供参考依据。

鸭疫里默氏杆菌病是危害养鸭业的重要致病菌，其敏感的药物不多且易产生耐药性。所以，多种药物超剂量或超疗程应用的情况屡见不鲜。其后果，一方面导致鸭酮体中的兽药残留，摄入人体后影响人类的健康；另一方面，鸭场排泄物向周围环境排放，药物又成为环境污染物，给生态环境带来不利影响。因此，开发无污染的能替代或部分替代的抗生素药物迫在眉睫。

噬菌体是一种细菌病毒，广泛存在于土壤、污水、粪便等自然环境中，噬菌体具有天然、安全、高效、无残留等优势，作为一种抗菌剂来研发使用具有广阔的发展前景。用噬菌体治疗细菌感染早在20世纪初就已取得过可喜的成果，后来由于抗生素的迅速发展，噬菌体的研究工作几乎处于停滞状态。近些年来，人们对噬菌体疗法已产生越来越多的兴趣。与抗生素相比，噬菌体的优势首先是针对目标菌，不会破坏正常的微生态平衡，无副作用；其次，噬菌体会随着宿主的消失而死亡，不会残留在动物体内或产品中，所以噬菌体能够作为一种具有杀菌作用的高效生物消毒剂和药物。

但目前还没有出现有效的鸭疫里默氏杆菌噬菌体，能用于防治鸭疫里默氏杆菌病，因此，现有技术有待进一步改进。

发明内容

针对现有技术的种种不足，为了解决上述问题，现提出一种鸭疫里默氏杆菌噬菌体及其分离方法和应用，具体技术方案如下：

本发明提供一种鸭疫里默氏杆菌噬菌体，命名为SD-RA1Riemerellaanatipestifer phage SD-RA1，该噬菌体能同时裂解血清1型和血清7型鸭疫里默氏杆菌，于2021年8月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC M20211061。

进一步，所述鸭疫里默氏杆菌噬菌体SD-RA1，透射电镜观察，其头部为正多面体结构，直径约61nm，有尾部，尾部长约244nm，为长尾噬菌体科。

进一步，所述鸭疫里默氏杆菌噬菌体SD-RA1，该噬菌体为烈性噬菌体，其对1型和7型鸭疫里默氏杆菌具有强裂解性，裂解率达90％以上，为工业化、规模化、程序化生产噬菌体及治疗鸭疫里默氏杆菌引起的鸭浆膜炎等动物细菌病提供了噬菌体来源。

进一步，所述鸭疫里默氏杆菌噬菌体SD-RA1，经50℃处理60分钟后，效价仍保持在109PFU/ml以上。

进一步，所述鸭疫里默氏杆菌噬菌体SD-RA1，在pH为6.0～9.0范围内， 37℃培养60分钟，效价仍保持在10

本发明还提供一种如上所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体的分离方法，其中,包括以下步骤：

粪便污水处理：采集鸭场粪便和污水，加入适量的SM缓冲液沉淀过夜。取过夜沉淀后的上层液体，离心过滤，离心液保存备用；

噬菌体富集：取适量离心液加入到适量胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，加入适量分离鉴定好的血清1型或血清7型鸭疫里默氏杆菌液，37℃恒温培养箱中共培养，培养液离心过滤后得到噬菌体。

分离噬菌体验证：用双层平板点滴法分离噬菌体，有噬菌斑出现，则证明从养殖场粪便污水中分离到噬菌体，且对血清1型和7型的鸭疫里默氏杆菌有裂解作用。

进一步的，向采集的鸭场粪便和污水中加入SM缓冲液，其中，SM缓冲液与粪便污水体积比例为1:1～1:2。

进一步的，所述粪便污水处理步骤具体为：采集鸭场粪便和污水，按照1:1～ 1:2比例加入1×SM缓冲液后，于2～8℃过夜沉淀，然后取上层液体用8层或 16层纱布过滤，取纱布过滤后的液体，8000～12000rpm离心3～5分钟，最后用0.22μm的滤膜过滤除菌，于2～8℃保存备用。

进一步的，所述噬菌体富集步骤具体为：将经粪便污水处理步骤得到的离心液以1:1～1:2比例加入3％～5％胎牛血清的2×TSB培养基中，加入血清1型或血清7型鸭疫里默氏杆菌菌液，每个富集管中加入3～4株菌，每株菌占培养基的比例1:20～1:50。37℃恒温振荡器培养4～6小时，培养液经8000～12000 rpm离心3～5分钟，最后用0.22μm的滤膜过滤除菌，于2～8℃保存备用。

进一步的，将噬菌体富集步骤得到的过滤液用双层平板点滴法进行验证，其中，双层平板的下层培养基为TSA固体培养基，双层平板的上层为含3％～5％胎牛血清的TSB半固体培养基。

进一步的，双层平板的上层TSB半固体培养基的配制为：TSB培养基5g和 1.5g～2.0g琼脂粉，溶解于200ml纯化水中，调节pH值至7.2～7.4，高压灭菌后备用。所述双层平板的下层TSA固体培养基的配制为：高压灭菌好的TSA 培养基，室温冷却至50℃～55℃，每个无菌平皿中倒入10～15ml，室温冷却后备用。

进一步，所述双层平板的上层，为含3％～5％胎牛血清TSB半固体培养基。取10ml离心管，加入300～500μl菌液，半固体培养基高压灭菌后，室温冷却至50℃～55℃，加入终浓度3％～5％胎牛血清，倒5～8ml至10ml无菌离心管中，将离心管中的液体倒入平皿，即为双层平板的上层。

进一步的，所述双层平板点滴法为：将经噬菌体富集步骤后的过滤液，点滴到双层平板上，每个平板滴4～6μl，待平板表面液体干燥后，将双层平板倒置放于37℃CO

本发明还提供一种如上所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体的应用，其中，在制备预防或治疗鸭疫里默氏杆菌杆菌引起的动物疾病的药物中的应用。基于此应用，本发明可提供一种用于防治鸭疫里默氏杆菌的杀菌组合物，其有效成分包括本发明所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体SD-RA1。

本发明提供一种如上所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体的应用，其中，在制备预防或治疗鸭疫里默氏杆菌引起的动物疾病的饲料中的应用。

本发明提供一种如上所述的鸭疫里默氏杆菌噬菌体的应用，其特征在于，在制备预防或治疗鸭疫里默氏杆菌引起的动物疾病的清洁剂或消毒剂中的应用。

有益效果：

1、本发明是从山东菏泽集约化肉鸭场发生浆膜炎症状的鸭的鸭脑中分离筛选得到了2株鸭疫里默氏杆菌，经鉴定为血清1型和血清7型鸭疫里默氏杆菌，并以该2株鸭疫里默氏杆菌为宿主，从养殖场的粪便污水中分离得到了血清1 型和7型鸭疫里默氏杆菌的噬菌体SD-RA1，该噬菌体SD-RA1对禽类养殖环境中致病性血清1型和7型鸭疫里默氏杆菌具有强裂解作用，为工业化生产噬菌体用于禽类养殖环境中致病性血清1型和7型鸭疫里默氏杆菌引起的浆膜炎的防治提供了噬菌体来源。

2、本发明提供的血清1型和7型鸭疫里默氏杆菌的噬菌体SD-RA1，在pH 为6.0～9.0范围内，能保持较好的活性，噬菌体效价没有明显变化，在pH为 8.0时，噬菌体效价最高，达10

3、本发明的噬菌体是从自然界环境中获得，易于进行工业化生产，由上述噬菌体制备的药物或消毒剂不仅可降低成本，而且，该噬菌体或噬菌体组合物的治疗无需考虑药物残留问题，能够作为一种具有安全、高效生物消毒剂和药物进行广泛应用。

4、本发明的鸭疫里默氏杆菌噬菌体及其噬菌体组合物应用广泛，不仅可用于制备防治鸭疫里默氏杆菌病的药物制剂，而且通过与饲料混合及随水饮用，以及作为消毒剂使用，可广泛用于禽类养殖过程中的容易因鸭疫里默氏杆菌感染造成损失的各个环节，养殖环境的日常消毒、以及生鲜产品抑菌等方面，有益于家禽养殖业，尤其是鸭养殖业的健康发展。

附图说明

图1为本发明噬菌体SD-RA1噬菌斑照片；

图2为本发明噬菌体SD-RA1电镜照片；

图3为本发明噬菌体SD-RA1热稳定性检测结果；

图4为本发明噬菌体SD-RA1 pH值稳定性检测结果；

图5为本发明噬菌体SD-RA1一步生长曲线；

图6为本发明实施例7中肉鸭出栏前试验组和对照组正常死淘鸭剖检图。

图7为本发明实施例7中肉鸭试验组和对照组用药前后粪便对比图。

具体实施方式

下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

血清1型和血清7型鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定

于鸭场采集发浆膜炎症状的发病鸭的鸭头，无菌操作取发病鸭的鸭脑，在 TSA(含5％胎牛血清)培养基划线，37℃CO

实施例2

血清1型和血清7型鸭疫里默氏杆菌噬菌体SD-RA1的分离及鉴定

1、污水粪便处理：从鸭场采集粪便污水，1:1比例加入SM缓冲液，放于2～ 8℃静置过夜，取上层液体用8层纱布过滤，取过滤后的污水8000rpm离心5分钟，离心的上清液用0.22μm滤器过滤，置于2～8℃保存备用。

2、噬菌体富集：将1ml过滤后的污水加到1ml TSB液体培养基中，并加入适量菌液(每管可加约4种菌，每种菌加20-40μl)，37℃摇床培养2～4小时，最后用0.22μm滤器过滤后2～8℃保存。

3、制备双层平板的下层：取高压灭菌好的TSA培养基，室温冷却至50℃～ 55℃，每个无菌平皿中倒入10～15ml，室温冷却后2～8℃保存备用。

4、铺双层平板：首先将富集好的鸭疫里默氏杆菌菌液500μl分装至10ml无菌离心管中，然后将高压灭菌好的半固体培养基(加5％胎牛血清)室温冷却至50℃后倒5ml至上述10ml离心管中，倒上层平板。

5、噬菌体分离纯化：待上层平板凝固后，吸取过滤处理后的污水液体，点滴到平板上，待表面液体干燥后，将平板倒置放于37℃CO

6、噬菌体的扩繁：噬菌体扩繁采用“刮板”的方法，保证噬菌体效价均在 10

7、噬菌体的效价检测：用无菌枪头取1ml上述噬菌体悬液，加入盛有9ml SM 缓冲液的试管中，充分混匀后从中取1ml稀释后的噬菌体悬液加入另一盛有9ml SM缓冲液的离心管中，重复上述操作，将样品的浓度稀释成10

实施例3

噬菌体的电镜观察

1、噬菌体的浓缩：

将效价为2.8×10

往收集后的上清加入固体PEG8000至终浓度10％(w/v)，震荡加速溶解，4℃过夜，次日分装于50ml离心管中，12000rpm离心10分钟弃上清，将离心管倒置流干残余液体。

向每个离心管中加入SM缓冲液1ml，静置1小时使沉淀充分溶解，收集液体置于4℃保存备用。

按照实施例2中噬菌体效价检测方法检测噬菌体效价，结果为 1.6×10

采用磷钨酸负染法对噬菌体进行处理：取100μl的浓缩的噬菌体，滴在石蜡片上，将铜网有膜的一面置于噬菌体液滴上，10分钟后将铜网自液滴上取下置于干净的滤纸上，晾干3分钟，加一滴2％的磷钨酸(PTA)于铜网上对噬菌体染色10分钟，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态。

由图2可知，噬菌体其头部为正多面体结构，直径约61nm，有尾部，尾部长约244nm，根据国际病毒分类委员会第九次报告的分类标准，可确定该噬菌体为长尾噬菌体科，将其命名为SD-RA1。

实施例4

噬菌体的生物学特性

1、噬菌体SD-RA1温度稳定性测定

将盛有500μl噬菌体的离心管分别放置于温度为40℃、50℃、60℃、70℃、 80℃的恒温水浴锅中，分别在30分钟和60分钟后取样，用双层平板法分别测定噬菌体效价变化。

结果可见(图3)，噬菌体SD-RA1在40℃和50℃作用1小时后，基本保持原活性；60℃作用30分钟，效价下降2个数量级，1小时后效价下降4个数量级；70℃和80℃的高温作用下，30分钟后，噬菌体基本失活。试验结果说明，噬菌体SD-RA1 能耐受50℃以下的高温。

2、噬菌体pH稳定性的测定

用浓盐酸和NaOH溶液调整TSB液体培养基的pH值分别为3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12，每个pH值均取200μl，加入200μl 1010PFU/ml的噬菌体液混匀，37℃作用1小时。从每管中各取200μl噬菌体，测定噬菌体的效价变化。

结果可见(图4)，在pH 6～9范围内，噬菌体效价几乎没变或略有降低，均在10

3、噬菌体最佳感染复数(MOI)的测定

将宿主菌的浓度调整为1.0×10

结果可见，噬菌体SD-RA1的MOI为0.01，该条件下噬菌体感染宿主菌产生子代噬菌体的滴度为3.6×1010PFU/ml，在5个感染复数中噬菌体滴度最高。详细结果见表1。

表1噬菌体SD-RA1最佳感染复数(MOI)检测结果

4、噬菌体的一步生长曲线

将宿主菌培养7～8小时，使其浓度在1×10

从如图5所示结果可见，噬菌体感染宿主菌的潜伏期为前10分钟，裂解期为 70分钟，裂解量约为433。

实施例5

噬菌体的裂解谱试验

1、噬菌体的裂解谱测定

选择实验室已经鉴定好的30株鸭疫里默氏杆菌和10株巴氏杆菌，采用双层平板法测定噬菌体裂解谱。步骤如下：按照实施例1中的方法制备宿主菌悬液。将200μl的菌悬液与200μl的噬菌体于37℃条件下孵育5分钟，加入上层半固体培养基中(含5％胎牛血清)制备双层平板，待上层凝固后置于37℃恒温箱中倒置培养过夜观察裂解结果，统计结果见表2。

2、宿主菌的耐药性检测

对30株鸭疫里默氏杆菌和10株巴氏杆菌进行了药敏试验，详细结果见表2。

表2鸭疫里默氏杆菌噬菌体SD-RA1对不同血清型的鸭疫里默氏杆菌和巴氏杆菌的裂解谱

由表2可见，噬菌体SD-RA1能全部裂解11株血清1型和8株血清7型鸭疫里默氏杆菌，裂解率100％；对血清2型、5型、6型和10型鸭疫里默氏杆菌没有裂解性；对巴氏杆菌没有裂解性。宿主菌的耐药性检测分析，30株鸭疫里默氏杆菌和10 株巴氏杆菌表现出不同的耐药性，且具有多重耐药性的鸭疫里默氏杆菌比率达 90％以上。

3、噬菌体的体外裂解试验(OD值法)

试验设置4个试验组和一个对照组。各个试验组中，于10ml无菌离心管中分别加入500μl血清1型鸭疫里默氏杆菌菌液，菌液的终浓度为1×10

试验结果见表3和表4。由结果可见，噬菌体SD-RA1对血清1型鸭疫里默氏杆菌的裂解效果较好，上述4种不同浓度的噬菌体液对血清1型鸭疫里默氏杆菌的裂解率都可达98％以上，只是裂解时间不同。但在8小时内，噬菌体在这4个浓度对宿主菌都能达到很好的杀灭效果。

表3噬菌体SD-RA1株体外裂解试验结果

表4培养8小时后各组菌的残留量测定

实施例5

噬菌体对靶动物的安全性试验

选取7～14日龄雏鸭40只，随机分成试验组和对照组，每组20只。试验组小鼠分别腹腔注射噬菌体SD-RA1增殖液，每只500μl(10

结果如表5可见，试验组和对照组小鼠精神状态、采食和饮水等均正常，无死亡，剖检可见，试验组小鼠肝脏、肺脏、心脏、脾脏和肾脏等脏器均正常，与对照组无差异。详细结果见表5。

表5噬菌体SD-RA1对7～14日龄雏鸭的安全性结果

实施例6

噬菌体对雏鸭鸭疫里默氏杆菌攻毒后保护试验

1、口服途径给予噬菌体对雏鸭鸭疫里默氏杆菌攻毒后的保护作用

选取80只2～4日龄雏鸭，随机分为口服试验1组、口服试验2组、对照组1组和对照2组，每组20只。试验1组和对照1组雏鸭，腹腔注射血清1型鸭疫里默氏杆菌，试验2组和对照2组雏鸭，腹腔注射血清7型鸭疫里默氏杆菌，每只0.5ml (1×10

结果显示，对照1组和2组雏鸭90％死亡，口服试验1组和2组，经过噬菌体 SD-RA1口服给药后，雏鸭90％存活，由此说明，噬菌体SD-RA1经过口服给药，能较好的保护血清型和7型鸭疫里默氏杆菌的攻击，能够防治血清1型和7型鸭疫里默氏杆菌引起的雏鸭浆膜炎效果显著。具体结果见表6。

2、腹腔注射途径给予噬菌体对雏鸭鸭疫里默氏杆菌攻毒后的保护作用

选取80只2～4日龄雏鸭，随机分为腹腔注射试验1组、腹腔注射试验2组、对照组1组和对照2组，每组20只。试验1组和对照1组雏鸭，腹腔注射血清1型鸭疫里默氏杆菌，试验2组和对照2组雏鸭，腹腔注射血清7型鸭疫里默氏杆菌，每只0.5ml(1×10

结果显示，对照1组和2组雏鸭90％死亡，腹腔注射试验1组和2组，经过噬菌体SD-RA1注射给药后，雏鸭100％存活，由此说明，噬菌体SD-RA1经过注射给药，能完全保护血清型和7型鸭疫里默氏杆菌的攻击，对防治血清1型和7型鸭疫里默氏杆菌引起的雏鸭浆膜炎效果显著。具体结果见表6。

综上结果，进一步说明，噬菌体SD-RA1经注射给药对鸭疫里默氏杆菌的攻击保护效果优于口服给药途径。

表6噬菌体SD-RA1不同给药途径对雏鸭鸭疫里默氏杆菌攻毒保护试验结果

实施例7

鸭疫里默氏杆菌噬菌体对肉鸭场鸭疫里默氏杆菌的净化作用

1应用目的：评价鸭疫里默氏杆菌噬菌体对肉鸭鸭疫里默氏杆菌的净化作用及其对生产性能的影响。

2试验地点：江苏某规模化肉鸭养殖场

3试验鸭群情况等信息：全场16栋舍，1～9栋舍每栋26000鸭，10～12栋，每栋24000鸭，13～16栋，每栋11000鸭。

(1)选取4栋舍作为试验组，鸭疫里默氏杆菌噬菌体按照10000羽/瓶，饮水使用，每日1次，2～3小时饮完，连用2天。使用日龄23～24、33～34日龄。

(2)选取4栋舍作为对照组。

(3)试验组和对照组鸭苗来源相同、饲料相同、免疫程序相同，饲养管理条件基本一致。

(4)分组情况

4试验评估指标：

观察整个肉鸭饲养期，死淘情况、栋舍的粪便变化、出栏的料肉比、欧指、成活率等。

5试验结果

表7料肉比

小结：从表7料肉比统计结果看，噬菌体组平均料肉比为1.72，对照组平均料肉比为1.76，噬菌体组比对照组低0.04。

表8欧指

小结：从表8的肉鸭欧指结果看，噬菌体组平均欧指为467.7，对照组平均欧指为459.6，噬菌体组比对照组高8.1。

表9成活率

小结：从表9的平均成活率结果看，噬菌体组平均成活率为98.31，对照组平均成活率为98.55，噬菌体组比对照组低0.24％。

5.4出栏前试验组和对照组正常死淘鸭剖检

出栏前3-4天，每栋舍选同等数量的死鸭，解剖观察症状(拍照记录，如图 6所示)，记录比例

小结：噬菌体组死淘鸭剖检可见腺胃肌胃基本正常，个别出现肌胃轻微溃疡。对照组出现包心包肝，腺胃水肿，肌胃溃疡，胆汁排除障碍等病理现象。说明饲喂噬菌体可减少肉鸭大肠杆菌等条件致病菌的感染。

5.5粪便照片

试验组与对照组用前用后，前中后定点拍照。

小结：如图7所示，噬菌体组粪便在各个阶段均正常，对照组在35日龄出现血便(图7中对照1字母A所表示的椭圆框中即为血便区域)，说明噬菌体可改善肉鸭粪便，保护肠道健康。

6结论

6.1生产指标：噬菌体组比对照组料肉比低0.04，欧指高8.1；

6.2症状：有效预防包心包肝症状的发生；

6.3粪便：噬菌体组能改善粪便状态。

综上试验结果说明，鸭疫里默氏杆菌噬菌体能够减少肉鸭大肠杆菌等条件致病菌的感染，改善肉鸭粪便，保护肠道健康，提高养殖指标。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化均囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。