RNA病毒诊断测定

技术领域

本发明一般涉及涉及酶、核酸或微生物的测量或测试方法；组合物或用于其的试纸；制备此类组合物的方法；微生物或酶学方法中的条件响应性控制；以及制备用于分析的核酸，例如用于聚合酶链式反应[PCR]测定。

相关申请的交叉引用

本发明根据35 U.S.C.§119(e)要求2020年4月11日提交，标题为“大规模平行RNA病毒(COVID-19)诊断测定(A Massively Parallel RNA Virus(COVID-19)DiagnosticAssay)”的美国系列号63/008,693和2020年4月13日提交，标题为“大规模平行RNA病毒(COVID-19)诊断测定(A Massively Parallel RNA Virus(COVID-19)Diagnostic Assay)”的美国系列号63/009,165的优先权。

背景技术

COVID-19病毒(SARS-CoV-2)通过呼出的气载颗粒传播，导致严重的呼吸道疾病。活动性或先前感染的诊断测定依赖于检测病毒RNA或病毒抗体。通常对用唾液或鼻咽(NP)拭子从患者上呼吸道收集的患者样品进行诊断化验。这些来源具有相当的灵敏度，一致性为97％。

用于COVID-19诊断测定的患者样品通常由鼻咽拭子从患者身上收集，并在临床实验室中通过聚合酶链反应(PCR)进行检测。患者可在感染后三个月内检测呈阳性。该SARS-Cov-2(COVID-19)诊断测定是一项时间、试剂和劳动密集型方案，其无法满足当前需求。在许多地方，鼻咽(NP)拭子和稳定溶液等试剂限制了医疗诊所进行诊断测定的速率。

虽然上呼吸道样品含有活性病毒，但最近的临床研究表明流感病毒是被分隔开来的。上呼吸道(如鼻区)的病毒载量与下呼吸道症状(即咳嗽)无关。雾化颗粒中的病毒载量与咳嗽症状的严重程度相关。由于下呼吸道的涉及通常是更严重的COVID结果的先兆，因此生物医学领域需要一种更直接的采样方法，其重点关注呼出的气体。

发明内容

本发明提供了一种替代的、有效的RNA病毒样品收集装置。该样品收集装置可通过快速、一步方式取代鼻咽拭子、稳定化、RNA提取和逆转录。收集装置从人类呼吸采样雾化颗粒。本发明提供了用于评估传播风险的比鼻咽拭子更直接且医学相关的样品。

在第一个实施方式中，本发明提供了一种称为Bubbler

在第二个实施方式中，酶活性随后将病毒RNA转化为稳定的、分子条码化的cDNA。收集点的逆转录酶活性有利于收集与下游大规模基于测序的并行诊断兼容的样品。参见图3。或者，无需测序即可通过PCR对样品进行诊断。

在第三个实施方式中，本发明提供了一种用于将空气传播的SARs-CoV-2病毒颗粒中的RNA逆转录为样品特异性条码化cDNA的方法。该方法包括首先从患者获得深呼吸样品的步骤，例如本说明书中关于使用本发明的装置所描述的那样。接下来，使用样品特异性条码化引物将样品逆转录为病毒cDNA。任选地，然后可以将样品合并以通过大规模平行测定进行分析。

在第四个实施方式中，本发明提供用作人类呼吸中RNA病毒(例如COVID-19、SARS、其他冠状病毒、流感病毒、鼻病毒或其他RNA病毒)的筛查的装置。

在第五个实施方式中，本发明提供用作环境中RNA病毒(例如COVID-19、SARS、其他冠状病毒、流感病毒、鼻病毒或其他RNA病毒)的筛查的装置，通过将真空泵应用到安装在医院急诊室、机场、建筑供暖、通风和空调(HVAC)空气处理系统中的通风口。

在第六个实施方式中，本发明提供了用于检测呼气中的DNA病毒的装置。

在第七个实施方式中，本发明提供了用于检测呼气中的非病毒核酸(例如，来自烟草的DNA；来自大麻的DNA)的装置。

在第八个实施方式中，本发明提供了用于检测环境中雾化DNA的装置。

在第九个实施方式中，本发明提供了用于收集用于测序以鉴定病毒株的样品的装置。

在第十个实施方式中，本发明提供了用于收集样品的装置，该样品用于[大规模平行测定]。

在第十一个实施方式中，本发明提供了一种装置，其中容器(receptacle)是囊体，例如派对气球。在-20℃孵育一小时后，来自人类呼吸的RNA病毒颗粒很容易从充气派对气球的内表面沉淀。RT-PCR无需RNA提取即可轻松检测该液体中的rRNA。

在一个方面，本发明提供了一种快速、高通量的测定，其有利于实现大规模调查测序。参见图4。Bubbler

另一方面，本发明提供了一种用于确定传染性的装置和改进的方法。如果无法检测人呼吸中的SARS-CoV-2，则生物医学领域的普通技术人员无法了解COVID-19患者具有传染性的时间和情况(接种疫苗、无症状)。人们普遍认为这种情况在2020年COVID-19大流行期间加剧了公众的不确定性。

另一方面，通过测序进行的诊断可以提供附加信息，例如病毒载量和毒株特点。

在另一个方面，来自条形码赋能的Bubblers

本发明在一项临床研究中进行了测试，该研究证明了分子条码化联合下一代测序技术以334个基因组拷贝/样品的检测限在一组人工构建的样品中定量检测SARS-CoV-2的可行性。

由Bubbler

附图简要说明

出于说明目的，在下文描述的附图中示出了本发明的一些实施方式。附图中相同的标号在整个附图中指示相似的元件。本发明不限于所示出的精确布置、尺寸和仪器。

图1提供了有关Bubbler

图2是显示在人工构建的样品上起效的大规模平行RNA病毒诊断测定的图。(左侧)每个装置都包含附于逆转录(RT)引物(紫色绘制)、位于随机3聚体(NNN)附近的独特条形码、反向引物结合位点(标记的通用引物)和整合到cDNA中的噬菌体T7启动子(T7)。cDNA经处理以去除游离引物和蛋白质，然后通过T7体外转录进行扩增。所得RNA用RT引物2进行逆转录，通过PCR进行扩增，并通过下一代测序进行分析。

图3是显示条码化/平行策略的早期实施方式的图表——显示大规模平行RNA病毒诊断测定。此图显示了对数千个样品平行执行的单一诊断的工作流程。步骤(1)：各个Bubbler

图4是显示由测定返回的诊断矩阵的图。各个试剂盒都包含一组具有独特条码化的RT引物，其对至少27种不同的RNA具有特异性。这些RNA靶向具有不同丰度和不同细胞来源的呼吸道病原体和人类RNA。该测定能鉴别病原体和样品的质量。

图5显示了Bubbler

图6显示了鼓泡器样品相对于替代(舌部刮擦、唾液)采样技术的分子特征。RT-PCR证明存在细胞RNA(18S，下图)但不存在ACE2R(COVID-19病毒受体)。这一发现支持这样一种观点，即鼓泡器发出的COVID-19信号主要来自病毒颗粒，而不是受感染细胞中的病毒转录本。

图7显示了在人为设计的COVID样品组上的实现。该组由COVID标准品(ATCC、VR-1986D、批号70035624)的十个连续5倍稀释液组成，按照FDA紧急使用授权指南规定的方式排列。组图A显示了图2中描述的RT引物。组图B显示了用于计算334个病毒颗粒/呼吸的检测限的稀释方案。

具体实施方式

2019年COVID的出现表明需要改进现代应对突发大流行病的方法。要减缓或阻止COVID-19病毒和其他空气传播病毒，尤其是空气传播的RNA病毒，如流感病毒、冠状病毒和鼻病毒(见图4)的传播，必须(a)知道谁被感染，以及(b)能够同时测试很多人。在2019年COVID大流行期间，测试往往因各种原因而受到限制。最初的建立可靠诊断的问题妥协于诊断实验室能力不足，最终导致诊断测试试剂短缺。尽管2021年COVID病例有所减少，但大规模检测的需求依然强劲。如果出现疫苗耐药株，那么这种需求可能会加剧。

Bubbler

设计了几种装置来捕获呼出的呼吸冷凝物。已经开发出呼吸分析仪来对代谢物进行采样。先前的研究未能检测到肺微生物组和上呼吸道微生物组之间的差异。参见Charlson等,Am.J.Respir.Crit.Care Med.(184),957-963(2011)。然而，一些细胞基因主要在肺中表达，例如表面活性剂相关蛋白家族(例如，SP-A)。发现ACE-2表达但不限于肺。Hermans与Bernard,Am.J.Respir.Crit.Care Med.159,646-678(1999)。

本发明提供了一种与现有COVID-19测试方案正交的装置和方法。平行性可以扩展到包括多个测试或一个Bubbler

该装置和方法能够比拿鼻拭子更方便、更舒适地每天对数万人进行检测。

快速高通量测定可实现大规模调查测序。Bubbler

本说明书中描述的发明不涉及克隆人的方法、修改人类种系遗传特性的方法、将人类胚胎用于工业或商业目的的用途，或修改很可能导致动物遭受对人类或动物无实质医疗益处的痛苦的遗传特性的方法，以及此类方法产生的动物。

方便起见，下文列出了说明书、实施例和所附权利要求中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或从上下文中暗示，这些术语和短语应具有以下含义。这些定义有助于描述特定的实施方式，但并不旨在限制要求保护的发明。除非另有定义，否则所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如果在本说明书中提供的定义的含义与该术语在生物医学领域中的使用之间出现任何明显的差异，则以本说明书中提供的术语的含义为准。

除非本文另有定义，否则与本申请一起使用的科学和技术术语应具有生物医学领域普通技术人员通常理解的含义。本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，因此可以变化。

“约”具有大约的简单含义。术语“约”包含与相关测试固有相关的测量误差。当与百分比一起使用时，约表示±1％。

“通风口”的简单含义是允许空气进出密闭空间的开口。可能含有空气传播病毒的通风口被安装在医院急诊室、机场和建筑物供暖、通风和空调(HVAC)空气处理系统中。

“空气传播(的)”的简单含义是在空气中移动的粒子。对不同类型呼出气体(例如，打喷嚏、咳嗽和大声说话)的早期研究表明，空气中存在各种大小的飞沫。较小的液滴持续时间更长。较大的液滴通过蒸发缩减为较小的液滴。为相应的草绿色链球菌(Str.viridans)培养液滴，说明了病原体如何在呼气中的雾化液滴中传播。这些研究得出结论，90％的空气传播细菌可在不通风的空间中以液滴形式存在30-60分钟。较小的病毒可能会持续更长时间并传播得更远。

“警报级别”是一种既定的微生物或空气传播颗粒级别，可对正常操作条件下的潜在飘移(drift)发出预警，并触发合适检查和后续行动以解决潜在问题。参见美国食品和药物管理局，行业指南，无菌加工生产的无菌药品——现行良好生产规范(2004年9月)。

“无菌加工设施”是建筑物或其隔离部分，包含洁净室，其中的空气供应、材料和装置受到监管，以控制微生物和颗粒污染。参见美国食品和药物管理局，行业指南，无菌加工生产的无菌药品——现行良好生产规范(2004年9月)。

“清洁区域”或“清洁区”是具有限定颗粒和微生物清洁标准的区域。参见美国食品和药物管理局，行业指南，无菌加工生产的无菌药品——现行良好生产规范(2004年9月)。

“冠状病毒”具有生物医学领域公认的导致哺乳动物和鸟类疾病的相关RNA病毒组的含义。冠状病毒构成正冠状病毒(Orthocoronavirinae)亚科，属于冠状病毒(Coronaviridae)科、巢病毒(Nidovirales)目和核病毒(Riboviria)界。它们是具有正义单链RNA基因组和螺旋对称核衣壳的包膜病毒。

“COVID-19”(SARS-CoV-2)是一种冠状病毒，它通过ACE2受体进入多种细胞类型，并导致COVID-19，这是一种严重的呼吸系统疾病。COVID-19的特征是发烧、干咳和各种其他症状。虽然COVID-19可能会出现下呼吸道以外的症状，但危险的轨迹会导致肺部炎症，从而导致肺炎。由于SARS-CoV-2是一种空气传播的病原体，因此肺部和气道的感染状态不仅可以预测疾病结果，还可以预测传播风险。

“DNA病毒”具有生物医学领域公认的病毒定义，其遗传物质是脱氧核糖核酸。有六种公认的病毒类别。DNA病毒构成I类(双链DNA病毒)和II类(单链DNA病毒)。

“环境”的简单含义是人、动物或植物生活或活动的环境或条件，尤其是周围的空气。

“McNemar检验”具有统计领域公认的含义。在统计学中，McNemar检验是一种用于成对名义数据的统计检验。它应用于具有二分特征的2×2列联表，具有匹配的对象对，以确定行和列边缘频率是否相等(即是否存在“边缘同质性”)。

“核酸”和“核酸分子”在本文中可以互换使用并且指核苷酸或核苷酸类似物的聚合物或聚合物嵌段。核酸可获自天然来源或可重组产生或通过化学合成产生。核酸可以是单链、双链或多链的，并且可包含修饰或未修饰的核苷酸或非核苷酸或其各种混合物和组合。

“患者”是指接受测定的任何人。具体地，患者可以指对其进行检测的已感染或疑似感染COVID-19的人。术语“患者”、“个体”和“对象”可以互换。

“聚合酶链式反应”(PCR)具有生物医学领域公认的涵义，是一种广泛用于快速制备特定DNA样品的数百万至数十亿个拷贝的方法，其使科学家能够获取非常小的DNA样品并将其放大为足够大的数量以供详细研究。使用PCR，极少量DNA序列的拷贝在一系列温度变化循环中呈指数级扩增。PCR目前是医学实验室研究中常用且通常不可或缺的技术，其应用范围广泛，包括生物医学研究和刑事取证。PCR试剂盒是市售可得的。

“呼吸系统疾病”具有生物医学领域公认的定义。常见的病毒性呼吸道疾病是由具有相似特征并影响呼吸道的多种病毒引起的疾病。涉及的病毒可能是流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)(毛细支气管炎、肺炎、哮吼、支气管炎和中耳炎的主要原因)、副流感病毒(幼儿哮吼的主要原因，可引起支气管炎、肺炎和毛细支气管炎)或呼吸道腺病毒(可引起从咽炎到肺炎、结膜炎和腹泻的各种疾病)。其他病毒包括鼻病毒(通常会引起普通感冒)和冠状病毒。呼吸道感染病毒可引起扁桃体炎、喉炎、支气管炎、肺炎等并发症。见Boncristiani，呼吸道病毒，《微生物学大百科》(Encyclopedia of Microbiology)，500–518(2009年2月17日)。

“逆转录酶”(RT)具有生物医学领域公认的酶的含义，该酶在逆转录中催化从RNA模板形成DNA。逆转录酶是市售可得的。

“核糖核酸”(RNA)具有生物医学领域公认的含核糖核酸的含义。它的主要作用是充当信使，携带来自DNA的指令，用以控制蛋白质的合成，尽管在某些病毒中，RNA而不是DNA携带遗传信息。

“RNA病毒”具有生物医学领域公认的病毒定义，其遗传物质是核糖核酸。RNA可以是双链或单链的。有六种公认的病毒类别。DNA病毒构成I类和II类。RNA病毒构成了其余的类别。III类病毒具有双链RNA基因组。IV类病毒具有正向单链RNA基因组，基因组本身充当mRNA(信使RNA)。V类病毒具有负向单链RNA基因组，用作mRNA合成的模板。VI类病毒具有正向单链RNA基因组，但不仅在复制而且也在mRNA合成中具有DNA中间体。由RNA病毒引起的著名人类呼吸道疾病包括普通感冒、流感、SARS、MERS和COVID-19。

Cochrane-Armitage检验具有统计领域公认的意义。当目的是评估具有两个类别的变量与具有k个类别的有序变量之间是否存在关联时，Cochran-Armitage趋势性检验用于分类数据分析。它修改了Pearson卡方检验，以在第二个变量的k个类别的影响中纳入疑似的顺序。

本领域的普通技术人员在进行和使用本发明时，可以使用这些材料和方法作为指导以获得可预测的结果：

Bubbler

接受测试的人应采取以下步骤：

步骤(1).从顶部握住Bubbler

步骤(2).稍微向下倾斜并正常呼吸。

步骤(3).呼气到管子里。

被测试者或测试执行者应听到冒泡的声音。被测试者应将肺部的空气全部吹出。此过程不应超过10秒。管底的油/水混合物应该是乳状液(如油醋沙拉酱)。有时会有一点唾液进入Bubbler

使用随机9聚体，通过SuperScript

McNemar检验用于所有二分法比较。估计值以带95％ CI形式报告。然后将估计值从最不阳性到最阳性进行排序，并使用Cochrane-Armitage趋势性检验，使用单尾假设检验来检验，以确定异常胸部XR结果的发生率是否由B-PCR预测。

为了分析舌部刮取物和Bubbler

体外RNA转录。具有T7启动子的SARS-CoV-2N基因的DNA寡核苷酸由IDT公司(Integrated DNA Technologies)合成。使用Q5高保真DNA聚合酶(NEB)对该寡核苷酸进行PCR扩增，以制备用于体外转录(IVT)的模板。引物列于序列表中。通过琼脂糖凝胶电泳确认单PCR扩增子。

体外RNA转录根据制造商的建议使用

对人工构建的样品进行高通量测试。使用体外转录的N基因RNA进行五倍连续稀释，设三重复进行，以制备人工构建的样品。各重复包含十个稀释液和两个空白对照。人总RNA对照(Thermo Fisher Scientific，目录号43-072-81)用作稀释剂。在IDT的96孔板中合成条码化转录本特异性RT引物。各条码化引物均包含与人类18SrRNA或N基因结合的靶向区域、3个核苷酸的随机序列(独特分子标识符，UMI)、8个核苷酸的条形码、PCR反向引物结合的恒定区，和T7启动子。引物参见序列表。将36个人工构建的样品排列到96孔中，其中已经分配了条码化RT引物，每个孔包含两个条码化RT引物，一个用于18S rRNA，另一个用于N基因RNA。然后按照制造商的建议，通过Maxima H Minus双链cDNA合成试剂盒(Thermo FisherScientific，目录号K2561)将RNA逆转录为双链cDNA。分别用RNA酶I和核酸外切酶I去除残留的RNA和RT引物。参见图2。蛋白酶K处理后，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，目录号28004)汇集和纯化所有cDNA，然后进行体外转录反应。然后使用针对18S rRNA和N基因的特异性RT引物，通过SuperScript

序列表

hRPp1_RT-NNNNNNGAATTGGGTTA(SEQ ID NO:1).

Cv_RT1-NNNNNNCAGCACTGCTC(SEQ ID NO:2).

Cv_RT2-NNNNNNCCTGAGTTGAG(SEQ ID NO:3).

Cv_RT3-NNNNNNAGTTGAGTCAG(SEQ ID NO:4).

Cv_RT4-NNNNNNAGTCAGCACTG(SEQ ID NO:5).

Cv_RT5-NNNNNNGAGTCAGCACT(SEQ ID NO:6).

Cv_RT6-NNNNNNGTTGAGTCAGC(SEQ ID NO:7).

Cv_RT7-NNNNNNGGCCTGAGTTG(SEQ ID NO:8).

Cv_RT8-NNNNNNGTCAGCACTGC(SEQ ID NO:9).

18S_FP-TGCAATTATTCCCCATGAACGAG(SEQ ID NO:10).

18S_RP-CTAGATAGTCAAGTTCGACCGTC(SEQ ID NO:11).

ACE2_FP-TTCGGCTTCGTGGTTAAACT(SEQ ID NO:12).

ACE2_RP-CTCTTCCTGGCTCCTTCTCA(SEQ ID NO:13).

hRPp1_rtPCR_1-GGATGCCTCCTTTGCCGGAG(SEQ ID NO:14).

hRPp1_rtPCR_2-AGCCATTGAACTCACTTCGC(SEQ ID NO:15).

Cv19N_rtPCR1_1-AGTCAAGCCTCTTCTCGTTCC(SEQ ID NO:16).

Cv19N_rtPCR1_2-GCAAAGCAAGAGCAGCATCAC(SEQ ID NO:17).

Cv19N_rtPCR2_1-GGTGTTAATTGGAACGCCTTGTCCTC(SEQ ID NO:18).

Cv19N_rtPCR2_2-TCTTGGTTCACCGCTCTCACTCA(SEQ ID NO:19).

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18S-rRNA-BC19-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTTGTGGTTGNNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:74).

18S-rRNA-BC20-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTTTCCATTGNNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:75).

18S-rRNA-BC21-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTTAACGCTGNNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:76).

18S-rRNA-BC22-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTTTGGTATGNNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:77).

18S-rRNA-BC23-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTTGAACTGGNNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:78).

18S-rRNA-BC24-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTTACTTCGGNNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:79).

18S-rRNA-BC25-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTTCCAGTCGNNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:80).

18S-rRNA-BC26-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTTGTATGCGNNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:81).

18S-rRNA-BC27-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTTCATTGAGNNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:82).

18S-rRNA-BC28-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTTGGCTCAGNNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:83).

18S-rRNA-BC29-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTTATGCCAGNNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:84).

18S-rRNA-BC30-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTTCAGATTCNNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:85).

18S-rRNA-BC31-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTGGTTGGACNNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:86).

18S-rRNA-BC32-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTGACACTTANNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:87).

18S-rRNA-BC33-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTGCTATGGANNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:87).

18S-rRNA-BC34-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTGTAACCGANNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:89).

18S-rRNA-BC35-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTGGCAAGCANNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:90).

18S-rRNA-BC36-TAATACGACTCACTATAGGGCCGATATCCGACGGTAGTGTGAACGACANNNGACGGGCGGTGTGTAC(SEQ ID NO:91).

用于18S rRNA的RT引物2-GATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACG(SEQ ID NO:92).

用于N基因的RT引物2-CGTGGTCCAGAACAAACCCA(SEQ ID NO:93)。如2中的RT引物2指的是用于N基因的RT引物2。

用于18S rRNA的FP1-CAATAACAGGTCTGTGATGCCCT(SEQ ID NO:94).

用于18S rRNA的FP2-TGCAATTATTCCCCATGAACGAG(SEQ ID NO:95).

用于N基因的FP1-AGGTGCCATCAAATTGGATGACA(SEQ ID NO:97).图2中的FP1指的是用于N基因的FP1。

用于N基因的FP2-CTGAATAAGCATATTGACGCATAC(SEQ ID NO:98).图2中的FP2指的是用于N基因的FP2。

RP-CCGATATCCGACGGTAGTGT(SEQ ID NO:99).图2中的RP指的是用于N基因的RP。

IVT-PCR-FP-GTAAAACGACGGCCAGTGAATT(SEQ ID NO:100).

IVT-PCR-RP-CAGGAAACAGCTATGACCATG(SEQ ID NO:101).

提供以下实施例以说明本发明而不应限制本发明的范围。

在本发明的第十三实施方式中，来自人类呼吸的RNA病毒颗粒在-20℃下孵育一小时后很容易从充气派对气球的内表面沉淀。rRNA可以很容易地通过RT-PCR在这种液体中检测到，无需提取RNA。这种收集技术很简单。

该实施例显示了对装置和样品收集方法的功效的测试。

发明人开发了一个成功的原型，可以从呼吸中复制18S rRNA，其效率与常规采样的RNA相同。在测试此Bubbler

该人群的标准护理测试是基于NP-PCR的测定，患者除了研究测试外还接受了该测定，并用作比较的金标准。

患者负责支付除Bubbler

一项临床研究在罗德岛医院(RIH)和Miriam医院进行。

临床研究对所有测试的结果不知情，特别是由于样品是分批储存和运行的。

发明人使用生物医学领域普通技术人员已知的标准分子生物学诊断法(Western分析、PCR、测序)对Bubbler

该临床研究不需要对入院的重症患者进行密切随访。无症状患者可能尚未产生足够的COVID-19病毒负荷，无法在标准NP-PCR或Bubbler

临床研究中使用的装置是使用无菌构造方案制造的，在使用前保持无菌状态，并且对患者几乎无污染风险。该装置由戴手套的人构建，喷洒70％乙醇，并在紫外线(UV)罩中干燥过夜。乳液在无菌方案下使用前添加。

参与的患者意外吸入液体的可能性很小。通过首先向患者演示使用不同示例装置的方法，进一步降低了这种风险。观察患者对装置的使用情况，确保呼气时安全使用。所使用的玻璃Pasteur吸移器在过去一直被用于口部吸移。总体而言，该方案中样品收集干预的风险很小。

收集的每个登记患者的数据包括姓名、性别、年龄、病历号、账户标识符、出生日期、入院日期、相关入院条件、血液动力学、治疗干预、诊断(例如，培养结果、射线照相结果、血液分析、病理学总结)、处置状态和住院日期/天。这些数据可以验证COVID相关感染的诊断，对疾病的严重程度进行评分，并在需要时构建人口统计学上适当的控制措施。同样，每个患者的所有识别信息都与临床研究样品分开保存。用于分析的数据不包括患者姓名、MR编号、账户标识符、出生日期、入院日期或处置日期。

由于遵守这些和其他标准的机密性和数据安全协议，保密性遭到破坏的可能性很小。

对象ID#____________

到达日期(月/日/年)：_________________

到达时间(24小时制)：_______:________

医疗记录编号：_____________________________________

合并症(请勾选所有适用项)

□肥胖

□高血压

□高脂血症

□糖尿病

□哮喘

□慢性阻塞性肺病(COPD)

□冠状动脉疾病

□心肌梗塞

□心力衰竭

□脑血管疾病

□慢性肾病

□癌症——请说明_______________________________

初始生命体征：_______________________________

重要迹象评估日期(月/日/年)：______________________

重要迹象评估时间(24小时制)：__________:___________

温度：_._°F

心律：_跳/分钟

血压：_______/_______mmHg

氧饱和度：__________％

呼吸频率：___________呼吸/分钟

SOFA评分：(请在每个类别中圈出一个方框)

根据脓毒症-3，在存在感染的情况下，SOFA评分新的(或假定新的)高于基线的增加可诊断为脓毒症。SOFA评分增加与死亡率增加相关。

缩写：GCS，格拉斯哥昏迷量表；FIO

总评分：____________

采血

采血日期(月/日/年)：_

采血时间(24小时制)：_____:______

注意：请打印并附上所有实验室结果的副本，至少包括：

□全血细胞计数(CBC)

□化学(Chem 7)

□肝功能组

□血培养

□COVID血清学

□COVID PCR

射线照相结果：_______________________________

注意：请打印并附上参与者的胸部X光解释的副本。

如果被接受，请记录停留时间(月/日/年–月/日/年)。

发明人通过简化测定和扩大测试的隔室改进了SARS-CoV-2检测。然后，发明人设计了一项临床研究，从呼吸道的三个点对COVID进行采样。将通过唾液/舌部刮取物或呼出的气体采集的口腔样品与传统鼻咽拭子进行比较。为了简化测定，发明人探索了在不提取RNA的情况下直接对样品进行逆转录的可行性，从而消除了稳定样品的需要并允许在家中进行测定。发明人描述了一种称为Bubbler

结果。虽然SARS-CoV-2主要通过鼻咽拭子在上呼吸道进行采样，但大多数死亡是由于下呼吸道受累所致。由于传播风险与呼出液滴中病毒载量呈函数关系，因此有强力的论据来检测呼出气中的病毒载量。为了测定人类呼吸中的SARS-CoV-2RNA，发明人开发了一种手持式呼吸分析器，可在样品收集点将RNA逆转录为DNA。

Bubbler

临床前研究表明，Bubbler

在第十四实施方式中，发明人优化了装置并证明了Bubbler

发明人对在罗德岛医院(Rhode Island hospital)急诊室遇到的患者测试了Bubbler

为了确定是否可以从Bubbler

计算二元分类测试以总结临床研究中部署的三种测试之间的比较。参见表1。与L-PCR测试相比，H-PCR测试显示出0.65的阳性预测值(PPV)，并且H-PCR和L-PCR的结果显著不同(McNemar检验，p＝0.02)。H-PCR显示胸部X光异常(阳性XR)的PPV为0.95。H-PCR显示确认的Bubbler

虽然比较未知错误率的多种测定因缺乏明确定义的真阳性而受到限制，但Bubbler

将Bubbler

在收集管中进行逆转录的一个优点是在高通量测试方案中使用条码化cDNA。图7(A)。各个RT引物都靶向RNA窗口，但仍与5'端的附加序列一起发挥作用。该序列由用于放大信号的T7启动子、6个核苷酸的样品条形码和3个核苷酸的随机标签组成，用于区分独特的RT事件和扩增中出现的重复事件。为了测试该测定的检测限，使用条码化引物设三重复地测试了一系列SARS-CoV-2的10个五倍稀释液和两个水基空白样。样品被逆转录、合并，然后进行两步巢式PCR策略。参见图7(B)。在对生成的扩增子进行测序后，对条形码进行计数并将其与个体扩增事件相关联。条形码计数在重复之间高度相关且与预期计数高度相关。相关性在对应于334个基因组拷贝的检测限的第5连续稀释时丢失。

讨论通过分析呼气分析器的冷凝液，发明人得出结论，SARS-CoV-2可以很容易地在人类呼吸中检测到。与口腔样品相比，人类呼吸中的病毒RNA含量更高，而能够复制SARS-CoV-2的细胞的内容存在于唾液中，但人类呼吸中不存在。这一发现表明在Bubbler

除了Bubbler

美国疾病控制中心(CDC)建议使用上呼吸道样品进行SARS-CoV-2感染的初步诊断检测。尽管检测SARS-CoV-2的病毒载量最高，但由于存在雾化的可能性，不建议通过痰液诱导采集样品。仅当上呼吸道样品呈阴性时，才建议从疑似COVID-19肺炎患者收集下呼吸道样品。请参阅美国国立卫生研究院2019年冠状病毒病(COVID-19)治疗指南。

上呼吸道样品最常见的检测是鼻咽拭子。然而，鼻咽拭子也存在雾化风险，因为它们非常不舒服，以至于患者在操作过程中经常咳嗽、打喷嚏或作呕，例如，一名患者拒绝使用传统拭子。Bubbler

本实施例的结果表明条码化如何能够以常规测试成本的一小部分实现高通量RNA病毒测试。除了通过平行化节省成本和时间外，测序诊断方法还可以进行毒株鉴定，这很有用，因为可以了解更多有关可传播性和可能的毒株特异性治疗决策的信息。

实施方式列表

已经提出了大规模平行RNA病毒诊断测定的具体组合物和方法。本发明的范围应仅由权利要求限定。生物医学领域的普通技术人员应以与本公开的上下文和精神相一致的尽可能广泛的方式解释所有权利要求术语。本说明书中的详细说明是说明性的，而不是限制性的或穷尽的。本发明不限于本说明书中描述的特定方法、方案和试剂，并且可以在实践中变化。当说明书或权利要求叙述有序的步骤或功能时，替代性实施方式可能以不同的顺序或基本上同时执行它们的功能。如生物医学领域的普通技术人员所认识到的，在不脱离本说明书中描述的发明构思的情况下，除已经描述的那些之外的其他等同物和修改是可能的。

本说明书中引用的所有专利和出版物均通过引用并入，以公开和描述与本说明书中描述的技术一起使用的材料和方法。专利和出版物仅供其在本说明书的申请日之前公开。所有关于专利和出版物的公开和出版日期的陈述均来自发明人的信息和信念。发明人不保证这些文件的内容或日期的正确性。如果在本说明书中提供的日期与实际发布日期之间存在差异，则以实际发布日期为准。由于在先发明或其他原因，发明人可能会提前此类公开。如果先前专利或出版物的科学或技术教导与本说明书存在差异，则以本说明书和这些权利要求书的教导为准。

当说明书提供值的范围时，该范围的上限和下限之间的每个中间值都在值的范围内，除非上下文另有规定。

参考文献

生物医学领域的普通技术人员在进行和使用本发明时可以使用这些科学参考文献作为指导以获得可预测的结果。

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