核酸获取及基因检测的方法

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及核酸获取及基因检测的方法。

背景技术

非小细胞肺癌的治疗，尤其是靶向治疗，根据基因检测结果进行分子分型是实施分类精准治疗的前提。选择敏感性高、特异性强且方便快速的检测方法，筛选出适用靶向药物的目标人群具有重要临床意义。EGFR突变、ALK融合及ROS1融合的基因分型检测应在患者诊断为晚期非小细胞肺癌时即刻进行。该发明旨在提供一种新的EGFR基因检测标本来源与方法，可以在肺部肿块接受纤维支气管镜下活检、CT引导下经皮肺穿刺活检时，快速高效获得非小细胞肺癌的基因分型，为后续病理诊断与治疗提供依据。

现况：目前认可公知的非小细胞肺癌EGFR基因常见标本送检类型：(1)肿瘤组织石蜡标本：主要包括手术、纤维支气管镜下活检、CT引导下经皮肺穿刺活检、胸腔镜、淋巴结穿刺活检等方法获取的组织标本；(2)细胞学标本：包括胸腔积液、痰、肺泡灌洗液所含肿瘤细胞；(3)体液中的游离DNA：血液、胸水、脑脊液、尿液；

现有标本来源存在以下不足：(1)肿瘤组织石蜡标本检测前需对肿瘤细胞比例进行评估，满足检测要求后方可进行检测，且取材相对困难；(2)细胞学标本需制作成石蜡包埋标本，进行肿瘤细胞比例评估，满足检测要求后方可进行检测，同时对肿瘤负荷要求较大，更适合于晚期肿瘤；(3)非小细胞肺癌或发生脑膜转移的患者，其血液、其它体液，或脑脊液中ctDNA含量很低，其基因检测具有较高的特异度，但灵敏度较差。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了核酸获取及基因检测的方法，相比传统方法省时、准确率高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了获取核酸样品的方法，包括如下步骤：

步骤(1)：获得含活检组织的取样部件；

步骤(2)：浸洗步骤(1)所述取样部件，获得浸洗液；

步骤(3)：分离步骤(2)所述浸洗液中的核酸，获得所述核酸样品。

在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中步骤(2)所述浸洗包括用1～5mL的液体浸洗2～5s；所述液体包括水、生理盐水或缓冲液。

在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中在步骤(2)和步骤(3)之间，还包括对所述浸洗液进行离心，弃去沉淀物的步骤。

在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中所述离心的相对离心力为2000～10000×g；所述离心的时间为1～3min。

在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中所述取样部件包括CT引导下经皮肺穿刺的取样部件。

在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中所述取样部件包括穿刺针。

在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中所述核酸包括DNA。

本发明还提供了基因分型方法，包括上述获取核酸样品的方法，以及在其步骤(3)之后，对所述核酸样品进行基因分型，获得分型结果的步骤。

在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中所述基因包括EGFR基因。

在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中所述分型包括采用实时荧光定量PCR技术进行所述分型；

所述分型还包括采用Super-ARMS-PCR进行所述分型。

本发明的方法有如下效果：

实验表明，相比于对组织石蜡标本进行肿瘤细胞鉴定的传统方法而言，本发明通过组织浸洗液进行Super-ARMS-PCR法EGFR基因检测的方法可以节省约15天的时间，且准确率达95％(表1)。

表1：本发明与传统方法比较

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示Super-ARMS荧光分析图；其中1示19-Del阳性；2示9-Del阴性；3示L858R阳性；4示L858R阴性；5示T790M阳性；6示T790M阴性；7示阳性对照；8示阴性对照。

具体实施方式

本发明公开了核酸获取及基因检测的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

DNA的物理提取方式有玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法，均通过不同的途径导致细胞破裂释放出细胞内的DNA物质。CT引导下的经皮肺部肿瘤穿刺活检术，其穿刺针对肿瘤的穿刺咬检过程在原理上类似于研磨法，同样会导致肿瘤细胞破裂以及DNA的外溢，其操作过程中释放的DNA将会粘附在活检穿刺针和获取的肿瘤组织标本条上。本发明提供一种操作方法，利用含4mL灭菌双蒸水的专用试管收集粘附在活检穿刺针和肿瘤组织标本条上的外溢DNA，提前用于肺癌EGFR的基因突变检测，快速高效获得非小细胞肺癌的EGFR分型，为后续病理诊断与治疗提供依据，且不影响活检组织条的常规后续病理学检测分析。

为接受CT引导下经皮肺穿刺活检患者的基因检测提供一种更为方便快捷的新的样本来源，即穿刺活检针及组织标本条上粘附的外溢DNA浸洗液，它是充分利用穿刺时细胞破裂DNA外溢的性质来实现的，本发明通过浸洗上清液提取DNA的浓度平均为17.73ng/μL，因此本发明样本获取的核酸样品浓度足够高，必要时需将所得DNA稀释至相应浓度后再上机检测。该法可以较病理组织的基因检测结果提前约15天，较血液标本的NGS基因检测结果提前7天，充分体现本发明省时的有益效果。

附Super-ARMS-PCR法EGFR基因检测阳性判断值及检验结果的解释：

1.阴性对照(NTC)的FAM/ROX/CY5信号应无明显扩增曲线。若FAM/ROX/CY5信号升起，则此次实验结果无效，应重新检测。若反应管的HEX(或VIC)信号偶尔升起，而FAM/ROX/CY5信号无扩增曲线，不影响对突变结果的判断，可继续进行分析。

2.确认未选择校正荧光参照，按管号顺序依次选择单一检测反应管和单一荧光信号进行分析，同时选择阳性对照反应管、样本反应管和阴性对照反应管，以阳性对照扩增曲线升起拐点出为阈值线，得到各反应管的Ct值。

3.阳性对照(PC)的FAM/ROX/CY5和HEX(或VIC)信号均应有明显的扩增曲线，Ct值一般小于20，但可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。

4.待测样品内控HEX(或VIC)信号应有明显的扩增曲线且Ct值＜19。若内控Ct值≥19或内控无明显的扩增曲线，说明加入的DNA含有PCR抑制剂、DNA浓度过低或核酸严重降解，需重新提取DNA后再进行实验。

5.当反应管的▲Ct值＜▲Ct Cut-off值时，则样本为该反应管对应信号突变阳性，反之则为阴性或低于试剂盒的检测下限。

▲Ct值＝Ct值

表2：结果判定

检测结果附图如图1所示，其中：

1号图为19-Del阳性；2号图为19-Del阴性；

3号图为L858R阳性；4号图为L858R阴性；

5号图为T790M阳性；6号图为T790M阴性；

7号图为阳性对照；8号图为阴性对照。

如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

中南大学湘雅二医院肿瘤科收集20例利用CT引导下经皮肺穿刺活检组织，分别进行如下操作：

(I)、浸洗组织，获得组织浸洗液样本，采用Super-ARMS法进行EGFR基因检测(实验组)；

(II)、病理学检查，组织石蜡样本进行NGS检测(对比组)。

具体地，每一例各自进行如下操作：

(1)样本采集：

肺部肿块→CT引导下经皮肺穿刺→组织标本1～3条→含组织条的穿刺针在含1～5mL(表3浸洗液体积)灭菌双蒸水的专用试管浸洗2～5秒(表3浸洗时间)→收集组织浸洗液4mL→离心机模式调为rcf模式，将4mL组织浸洗液2000～10000×g(表3相对离心力)离心1～3分钟，去除细胞及杂质→取上清，吸取要慢且枪尖离底部沉淀物2～3mm，将上清液移至新的离心管中→获取的上清液即刻分离DNA或置于-20℃保存。与此同时，穿刺组织标本条常规置入含10％福尔马林液的专用保存瓶→病理学检查→组织基因检测(对比组)

表3

(2)组织浸洗液的DNA分离与收集：

试剂：核酸提取试剂、无水乙醇，异丙醇

设备：恒温水浴锅，恒温加热器，离心机，涡旋混合仪(MIX2500)，掌式离心机，移液器及配套枪头(1000mL/200mL/20mL/2.5mL)，冰箱(4℃/20℃)；

操作方法及步骤：

1.移取4mL组织上清液样本加入10mL圆底离心管中，加入2.4mL Buffer CDL，再加入210μL Digest Solution，充分混匀10s；

2.放入水浴锅中，60℃消化15min；

3.快速冷却至室温，加入400μL DNA Tracer，混匀后，再加入3.3mL预冷的异丙醇，上下颠倒混匀20次，立即10000×g离心5min；

注：实验前30min，将异丙醇置于-20℃冰箱预冷

4.从离心机小心取出离心管，弃上清，留沉淀，并用移液枪吸干残留的液体；

5.往沉淀中加入470μL Buffer CDB，在液面下加入40μL Buffer CDD；

6.放到涡旋混合仪上，2500rpm室温震荡混匀15min；

7.取出离心管，往离心管加入250μL无水乙醇，涡旋振荡混匀5s；

8.将离心管500×g离心1min

9.将全部液体移入微量核酸吸附柱中，10000×g离心1min，倒掉收集管中液体；

10.往微量核酸吸附柱中加入700μL Buffer CW1，10000×g离心1min，倒掉收集管液体；

11.往微量核酸吸附柱中加入700μL Buffer CW2，10000×g离心1min，丢弃收集管；

12.换用新的收集管，13000×g离心1min，丢弃收集管；

13.将吸附柱套在1.5mL离心管中，56℃开盖孵育2min；

14.往核酸吸附柱中滴加100μL Buffer CDE，56℃闭盖孵育2min，13000×g离心1min；

15.收集样本DNA并保存，如超过6h未使用，于-20℃以下保存；

(3)DNA浓度与纯度的测定：

1.紫外分光光度计开机，滴洗脱液Buffer CDE 2μL于柱上，反复清洗5次。NudeicA—dsDNA—Blank

2.操作流程：a)调零：仪器电源—电脑开机以及点开SMA4000+—Nudeic A—dsDNA—Blank。b)空白检测：Measure，检测结果在-1到1之间。c)上样测量。

3.若浓度＞10ng/μL，可稀释为1～5ng/μL。

(4)Super-ARMS-PCR法EGFR基因检测：

a、试剂盒：人类EGFR突变基因检测试剂盒(多重荧光PCR法)

b、仪器：全自动医用PCR分析仪(SLAN-96S)

c、在每次RCR反应中，每份样品必须和阳性对照(PC)、阴性对照(NTC，自备纯化水)共同进行检测和分析。

1.取出试剂盒内各组分，P-EGFR反应液和P-EGFR阳性对照充分解冻后及P-EGFR混合酶震荡混匀，快速离心15s待用。

2.向体积为247.5μL的P-EGFR反应液加入67.5μL待测DNA，再加入2.16μL P-EGFR混合酶，涡旋器上混匀15s。P-EGFR阳性对照和纯化水(NTC)也按照相同操作和P-EGFR反应液、P-EGFR混合酶混合。

3.将P-EGFR 8连反应条放置于PCR冰架上，快速离心15s后再轻轻揭开管盖，防止液体溅出。

4.将混合好的DNA样本一次取70μL靠着PCR管上管壁加入P-EGFR 8连反应条中，然后小心盖上P-EGFR 8连反应条的管盖。

5.快速离心P-EGFR8连反应条5s。

6.将PCR反应管置于实时PCR仪器(SLAN-96S)中，打开仪器窗口，按设定好的PCR反应程序进行实验。

第1阶段：95℃10min，1个循环；

第2阶段：95℃40s，64℃40s，72℃30s，15个循环；

第3阶段：93℃40s，60℃45s，72℃30s，28个循环；

7.信号收集：第三阶段60℃时收集FAM/ROX/CY5和HEX信号，执行实时PCR，保存文件。

(5)检测结果：

其结果(实验组)与后续病理组织标本的基因检测结果(对比组)对比如表4所示：

表4：20例实验检测样本信息数据表

备注：▲Ct值越小，代表突变含量越高，突变峰度亦越大。

(6)检测结果数据对比分析：

表5：20例配对的组织浸洗液和组织石蜡样本检测结果对比

从表5可以看出，20例配对的组织浸洗液EGFR基因检测结果为阳性11例、阴性9例，组织石蜡样本EGFR基因检测结果为阳性12例、阴性8例，组织浸洗液Super-ARMS法对比组织石蜡样本NGS检测法的敏感性91.7％、特异性100％，阳性预测值100％，阴性预测值88.9％。本发明旨在提供一种基因检测样本的新途径、新来源，实验组采用全自动医用PCR分析仪，对比组采用的为更高级别的基因检测平台，将两组EGFR检测数据进行统计分析，结果显示准确率达95.0％，这充分说明实验组所采用的新样本来源是非常可靠的、检测结果亦是可信的，因此新样本同样也可尝试用于NGS检测。临床上，在组织取样困难、标本有限的情况下，若采用新的取样途径，一份组织样本就可以满足病理和基因检测的双重需求，可轻松解决因样本不足无法进行下一步基因检测的难题，为患者尽早诊断与治疗提供机会与依据。

本发明提供了一种新的非小细胞肺癌基因检测样本来源，并不仅仅限于上述描述，后续也将用于其他恶性肿瘤活检样本的基因检测。故凡依本标本来源申请专利范围所述的原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明专利申请范围内。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。