一种准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法

技术领域

本发明涉及定量分析技术领域，具体地，涉及一种准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法。

背景技术

荧光光谱法具有灵敏度高、准确度高、检出限低、选择性好、无损、简便等优点，是最常用、最可靠的分析方法之一。它提供了有关物质的分子相互作用、能级转换和浓度变化的丰富信息，广泛应用于生化分析、材料应用、临床医学检测、环境监测、食品安全、公安情报等领域。

荧光光谱法是依据荧光强度与物质浓度的关系建立的。在测量低浓度的荧光溶液时，检测到的溶液荧光强度F

由于存在荧光内滤效应(IFE)，采用常规的荧光光谱分析法不能精确的定量物质浓度，已有研究将荧光内滤效应看成荧光分析中的一个误差源，导致荧光光谱失真、光谱形状畸变以及荧光信号强度和荧光团浓度之间呈现非线性，许多研究人员试图通过推导IFE校正公式来恢复荧光强度与其浓度之间的线性关系。一些研究人员利用吸光度对荧光强度和荧光物质溶液的浓度的公式进行了修正，修正后公式为：

其中，F

1994年，Albinsson等人给出了校正后的荧光强度约为

Nettles等人对一系列参考样品中的水拉曼信号的测量，得到样品中由内滤效应造成的拉曼强度变化，并通过水拉曼强度和吸光度等量的关系做简单的线性拟合，确定荧光光度计的有效激发路径长度d

Ma等人研究了罗丹明6G水溶液的荧光激发光谱随浓度变化的sIFE并提出了一个数学模型来解sIFE引起的荧光激发光谱拐点。

上述这些研究的校正公式大多针对比色皿几何结构与光束的几何参数对内滤效应进行校正，没有考虑荧光物质本身的溶质溶剂系统对内滤效应的影响，也没有考虑到发生sIFE的荧光物质，随着溶液浓度的增加，会形成二聚体或多聚体。二聚体或多聚体对荧光光谱和吸光度光谱的贡献程度不同，对发射荧光的被吸收过程的影响程度也是不同的，传统的校正吸收过程的方式并不能满足校正需求，对荧光光谱强度衰减和荧光峰的红移等问题的校正还有待完善。因此，利用吸光度对荧光强度进行修正后的荧光强度公式仍然不能用于具有sIFE的荧光溶液的测量和定量分析。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法，以解决具有次级内滤效应的荧光物质光谱校正及定量的难题。

根据本发明的一个方面，提供一种准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法，该方法包括：

获取一系列浓度荧光物质溶液的荧光光谱和吸光度光谱；

对所述荧光光谱和所述吸光度光谱进行预处理，并设置校正荧光衰减吸收程度系数n的考察范围和光谱畸变度的考察段；

根据次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型，利用吸光度光谱校正在n的考察范围内所有浓度下的荧光光谱，得到校正后不同n值下所有浓度的荧光溶液的的荧光光谱；

计算在n的考察范围内各浓度荧光光谱的畸变度；

根据全浓度范围内的最小畸变度，确定此时的校正荧光吸收程度系数n，即为该荧光物质的次级内滤效应荧光衰减吸收指数n

利用吸光度光谱计算所有浓度下的当n＝n

根据基于n

进一步地，所述设置校正荧光衰减吸收程度系数n的考察范围和光谱畸变度的考察段，其中：光谱畸变度的考察段为吸光度光谱与荧光光谱产生交叠的部分所在波长段。

进一步地，所述设置校正荧光衰减吸收程度系数n的考察范围和光谱畸变度的考察段，其中：考察范围根据畸变度的最低点设置，考察范围覆盖畸变度的最低点。

进一步地，所述根据次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型，其中，次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型为：

n

更进一步地，所述根据次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型，其中：次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型的确定过程包括：

基于利用吸光度对荧光强度进行修正后的荧光强度公式，在发射荧光吸光度前添加一个校正吸收的系数来表征需要校正的吸收程度，对应的公式I为：

其中，F

将初级内滤效应的影响和次级内滤效应的影响视作两部分，则公式I写为：

根据荧光光谱形状相似性和峰值是否校正于同一波长确定荧光衰减吸收程度系数n的最优值，即n

进一步地，所述计算在n的考察范围内各浓度荧光光谱的畸变度，其中：畸变度通过欧几里得距离、相关系数和光谱角度中任一种表示。

进一步地，对所述荧光光谱和所述吸光度光谱进行预处理，包括：去除光谱仪中电信号漂移和暗电流产生的基线，并根据拉依达准则剔除含有粗大误差的光谱。

进一步地，所述获取一系列浓度荧光物质溶液的荧光光谱和吸光度光谱，其中：测量荧光光谱的装置包括光源、准直系统、比色皿、会聚系统和检测器，所述会聚系统设于检测平面中垂直激发光的方向且位于所述比色皿出射面的中心线上；由所述光源出射的激发光被所述准直系统准直后，从比色皿的入射面中心入射，激发荧光溶液，经所述会聚系统会聚出射的荧光，被所述检测器接收。

进一步地，所述获取一系列浓度荧光物质溶液的荧光光谱和吸光度光谱，其中：测量吸光度光谱的装置为分光光度计。

与现有技术相比，本发明具有如下至少之一的有益效果：

本发明提出的反映自吸收效应的优化参数-次级内滤效应(sIFE)的荧光衰减吸收指数n

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明一实施例的准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法的流程示意图；

图2为本发明一实施例的荧光测量原理示意图；

图3中(a)为本发明一实施例的荧光素钠水溶液的未校正吸光度光谱，(b)为本发明一实施例的荧光素钠水溶液的未校正荧光光谱；

图4为本发明一实施例的荧光素钠水溶液中n的优化结果；其中，(a)为三维颜色图，(b)为二维曲线图；

图5为本发明一实施例的荧光素钠水溶液的校正后荧光光谱；

图6为本发明一实施例的荧光素钠水溶液校正效果分析；其中，(a)为505nm处的荧光强度校正前后与浓度的关系图，(b)为515nm处的荧光强度校正前后与浓度的关系图，(c)为513nm至518nm的荧光强度的积分校正前后与浓度的关系图，(d)为550nm处的荧光强度校正前后与浓度的关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明实施例提供一种准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法，参照图1，该方法首先确定荧光自吸收效应的优化参数-次级内滤效应荧光衰减吸收指数nopt，并基于该指数校正荧光光谱，包括：

S1，获取一系列浓度荧光物质溶液的荧光光谱和吸光度光谱；

S2，对获取的所有荧光光谱和吸光度光谱进行预处理，并设置校正荧光衰减吸收程度系数n的考察范围和光谱畸变度的考察段；

S3，根据次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型，利用吸光度光谱校正在n的考察范围内所有浓度下的荧光光谱，得到校正后的不同n值下所有浓度的荧光溶液的荧光光谱；

S4，计算在n的考察范围内各浓度荧光光谱的畸变度；

S5，根据全浓度范围内的最小畸变度，确定此时的校正荧光吸收程度系数n，即为该荧光物质的次级内滤效应荧光衰减吸收指数n

S6，利用吸光度光谱计算所有浓度下的当n＝n

S7，根据步骤S6中的基于n

在一些实施方式中，在步骤S1中，测量荧光光谱的装置包括光源、准直系统、比色皿、会聚系统和检测器；其中，光源可采用LED、LD、激光等光源，波长根据荧光物质激发波长选择；准直系统可采用凸透镜、准直镜筒、光纤—光纤准直镜等准直结构；会聚系统设于检测平面中垂直激发光的方向且位于比色皿出射面的中心线上，会聚系统可采用凸透镜、光纤—光纤准直镜等会聚结构；检测器可采用光谱仪等可得到全光谱数据的检测结构。由光源出射的激发光被准直系统准直后，从比色皿的入射面中心入射，激发荧光溶液，经会聚系统会聚出射的荧光，传入检测器被接收。需要说明，在具体实施时，上述光源、准直系统、会聚系统、检测器内的具体器件和结构，不限于上述几种，可以根据应用需求确定。

获取一系列浓度荧光物质溶液的荧光光谱和吸光度光谱，其中：测量吸光度光谱的装置为分光光度计。

在一些实施方式中，在步骤S2中，对获取的所有荧光光谱和吸光度光谱进行预处理，包括：去除光谱仪中电信号漂移和暗电流产生的基线，并根据拉依达准则剔除含有粗大误差的光谱。

在一些实施方式中，在步骤S2中，设置校正荧光衰减吸收程度系数n的考察范围和光谱畸变度的考察段，其中：光谱畸变度的考察段为吸光度光谱与荧光光谱产生交叠的部分所在波长段。考察范围根据畸变度的最低点设置，例如，在图4b中，最低点大概在n＝2.0附近，整体的畸变度都是一个先变小后变大的过程，所以，考察范围需要覆盖n＝2.0左右的范围，考察范围为0-3.2，考察步长为0.1，以便于找到畸变度最低点对应的n值，并使n

在一些实施方式中，在步骤S3中，根据次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型，其中，次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型为：

n

进一步地，根据次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型，其中：次级内滤效应荧光衰减吸收指数分析模型的确定过程包括：

S31，对于某种确定的荧光物质，存在一个最佳的n，即n

基于利用吸光度对荧光强度进行修正后的荧光强度公式，在发射荧光吸光度前添加一个校正吸收的系数n

其中，F

S32，将初级内滤效应的影响和次级内滤效应的影响视作两部分，则公式I写为：

S33，由于pIFE是由于激发光被吸收造成的主要影响光谱强度，荧光光谱不会产生光谱形状上的变化，而sIFE是由于发射荧光被吸收造成的，吸收光谱与发射光谱的叠加会造成荧光光谱形状上的变化，直观来看就是峰值所在波长位置随浓度发生移动，而且荧光强度也会降低。n的最优值可根据荧光光谱形状相似性和峰值是否校正于同一波长来确定，不受前一项影响，故求解n

在一些实施方式中，在步骤S4中，计算在n的考察范围内各浓度荧光光谱的畸变度，其中：畸变度D为表征光谱相似度的参数，畸变度可以通过欧几里得距离、相关系数和光谱角度中任一种表示。在其他一些实施方式中，畸变度还可以采用其他的参数表示，只要能够实现上述相同功能即可。

本发明上述实施例，提出一个反映荧光物质自吸收效应的优化参数-次级内滤效应(sIFE)的荧光衰减吸收指数n

在一具体实施方式中，被测样品为配制的浓度范围为2.5mg/L-25mg/L的10个浓度梯度的荧光素钠水溶液。在其他一些实施方式中，也可选用其他的具有sIFE的荧光溶液，包括但不限于罗丹明B水溶液、罗丹明B乙醇溶液、罗丹明B丙三醇溶液、罗丹明6G水溶液和叶绿素乙醇溶液等。

采用的测量荧光溶液荧光光谱的装置包括光源、准直系统，比色皿、会聚系统和检测器。具体的，光源选用中心波长460nm的LED，准直系统和会聚系统均选用凹透镜，检测器选用Ocean Optics公司的型号为QE65000的光谱仪。经由LED出射的激发光被凸透镜准直，从光程为10mm的四通光比色皿的入射面中心入射，激发荧光溶液，在检测平面中垂直激发光的方向且位于比色皿出射面的中心线上设置凸透镜，会聚出射的荧光，经过光纤传入光谱仪被接收。

采用的测量荧光溶液吸光度光谱的装置为分光光度计，具体的，型号为TU-1901的双光束紫外可见分光光度计。在其他一些实施方式中，也可选用其他型号的分光光度计，不局限于紫外可见波段。吸光度测量的比色皿光程根据实际荧光测量的d

准确校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法，包括以下步骤：

步骤1：使用高精度电子天平称取12.5mg荧光素钠(AR，上海麦克林生化有限公司)粉末，并将其溶解在250mL容量瓶中，以制备浓度为50mg/L的荧光素纳水溶液。用去离子水将溶液稀释成一系列浓度梯度为2.5mg/L-25mg/L的荧光素钠水溶液，浓度分别为2.5mg/L、5mg/L、7.5mg/L、10mg/L、12.5mg/L、15mg/L、17.5mg/L、20mg/L、22.5mg/L、25mg/L。

步骤2：将配置好的10个不同浓度荧光素钠水溶液分别放入紫外分光光度计中测量其吸光度光谱，如图3(a)所示。再将荧光素钠水溶液放入荧光装置中测量其荧光光谱，设置积分时间为100ms，每个浓度的样本荧光光谱测量50次，剔除波动过大的光谱，并对剩余光谱进行平均。测得的荧光光谱如图3(b)所示。

步骤3：对所有光谱进行预处理，去除光谱仪中电信号漂移和暗电流产生的基线，根据拉依达准则剔除含有粗大误差的光谱；并设置校正荧光衰减吸收程度系数n的考察范围为0-3.2，考察步长为0.1；设置光谱畸变度D的考察段为490nm-506nm；

步骤4：根据公式

步骤5：计算n在0-3.2内时各浓度荧光光谱的畸变度D，本实施例中畸变度D是每个浓度溶液校正后的归一化荧光光谱和最低浓度溶液校正后的标准化荧光光谱之间的欧几里得距离；结果如图4(a)和图4(b)所示；

步骤6：根据全浓度范围内的最小畸变度D

步骤7：根据公式

结果分析：

从图3(a)和图3(b)的比较可以看出，荧光素钠的吸收光谱在470nm-530nm的波长范围内与荧光光谱重叠。部分荧光会被自身吸收，这意味着sIFE发生。sIFE不仅会降低峰值强度，而且会使峰值波长随着浓度的升高而发生明显的红移。在图3(b)中，515nm标准线用实心线标记，不同浓度溶液的校正荧光光谱峰的波长用虚线标记。通过比较虚线和实心线可以观察到波长的红移。

在图4(a)中，横坐标表示荧光素钠水溶液的浓度，纵坐标表示n。浓度与n的交点是荧光光谱的畸变度D。畸变度D越小越好，表明光谱相似度高，校正效果好。即在所有浓度中，D最小处的n为该荧光物质溶液的n

因此，n

如图6所示，有必要展示校正荧光强度和浓度之间的关系，以更清楚地评估校正效果。在图6(b)中，校正荧光光谱预测的浓度线性范围从12.5mg/L扩展到15mg/L，增加20％，前六组浓度拟合曲线的线性相关系数R

然而，在图6(b)和图6(c)中，高浓度下仍存在非线性。在实验过程中，光谱测量往往在光谱仪检测上限附近不准确而导致非线性。QE65000光谱仪的荧光强度检测上限为65535。在实验中，在检测上限大约2/3内的所有荧光数据都被视为有效的测量数据，这意味着最高峰值强度约为43690。选择505nm波长下的荧光光谱数据以建立与浓度的关系，以探究该影响。在图6(a)中，校正后荧光光谱预测的浓度线性范围被扩展，前五组的浓度拟合曲线的线性相关系数R

在实验中，即使已经在0.2-0.8的吸光度范围内获得数据，荧光和吸光度的实验装置彼此分离，也不可避免地发生pIFE，导致高浓度下的非线性。由于荧光素钠水溶液不吸收550nm波长的光，因此图6(d)中的荧光在校正前后几乎相同。前六组的浓度拟合曲线的线性相关系数R

上述校正荧光次级内滤效应的荧光定量分析方法，确定了本实施例中荧光素钠水溶液的n

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。上述各优选特征在互不冲突的情况下，可以任意组合使用。