赖氨酰特异性内切酶突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体讲，涉及一种赖氨酰特异性内切酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

赖氨酰特异性内切酶（Lysyl endopeptidase,EC 3.4.21.50）又称赖氨酰肽链内切酶、无色杆菌蛋白酶I、赖氨酸内肽酶、赖氨酰内切酶、赖氨酸C端内切酶、Lys-C内切酶，是一种丝氨酸蛋白酶，最初由Masaki等人从土壤细菌中发现并分离得到的。赖氨酰肽链内切酶具有高度特异性，可特异性切割肽链中赖氨酸残基和S-氨乙基半胱氨酸残基羧基端的肽键。

赖氨酰特异性内切酶是一条由268个氨基酸残基构成的多肽，其中肽链内部含有三个二硫键（Cys6-Cys216，Cys12-Cys80，Cys36-Cys58），由His57、Asp113和Ser194构成的三联体决定了该酶的催化活性，而Asp225决定了其对赖氨酸的特异选择性。

赖氨酰特异性内切酶与牛胰蛋白酶的氨基酸序列虽然只有20％的同源性，但是决定酶催化活性以及赖氨酸特异性相关的氨基酸序列和空间结构完全一致，因此赖氨酰特异性内切酶被归为胰蛋白酶家族。与牛胰蛋白酶相比，赖氨酰特异性内切酶对赖氨酸碳端的选择性更高，并且有10倍于胰蛋白酶的活性、较广的最适pH范围（pH 8.5～10.5）及在4 M的尿素或0.1％的SDS中依然正常的稳定性。这些特性使赖氨酰特异性内切酶成为生物医药生产中一种非常有用的工具酶。

利用天然无色杆菌Achromobacter lyticus M497-1生产的赖氨酰内切酶表达量低，周期长，成本明显较高，导致赖氨酰内切酶价格居高不下。而大肠杆菌Escherichiacoli是目前应用最广泛的蛋白表达系统，大肠杆菌表达系统具有遗传背景和生理特性研究清楚，已开发有多种商业化工程菌可以使用；且大肠杆菌易于培养和控制、转化操作简单，并具有表达水平高、成本低、周期短等特点。

但由于赖氨酰特异性内切酶自身氨基酸序列和结构特点，对于目前广泛应用的大肠杆菌表达系统获得的其包涵体存在着酶活降低、稳定性不足等问题。因此，仍需要能够更优的适应大肠杆菌表达系统，并具备更高酶活及酶活稳定性的赖氨酰特异性内切酶。鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明通过大量的研究，提供了一种赖氨酰特异性内切酶突变体、其重组基因工程菌及构建方法，本发明的赖氨酰特异性内切酶突变体具备显著提高的酶活和酶活稳定性。

本发明的第一方面提出了一种赖氨酰特异性内切酶突变体，是将野生型赖氨酰特异性内切酶中第51位和/或第137位的氨基酸进行如下突变得到的：Y51D突变和R137K突变。所述野生型赖氨酰特异性内切酶的氨基酸序列为Genbank中Sequence ID: 1ARB_A所示，具体为：

GVSGSCNIDVVCPEGDGRRDIIRAVGAYSKSGTLACTGSLVNNTANDRKMYFLTAHHCGMGTASTAASIVVYWNYQNSTCRAPNTPASGANGDGSMSQTQSGSTVKATYATSDFTLLELNNAANPAFNLFWAGWDRRDQNYPGAIAIHHPNVAEKRISNSTSPTSFVAWGGGAGTTHLNVQWQPSGGVTEPGSSGSPIYSPEKRVLGQLHGGPSSCSATGTNRSDQYGRVFTSWTGGGAAASRLSDWLDPASTGAQFIDGLDSGGGTP。

本发明对赖氨酰特异性内切酶序列进行了深入的研究分析，筛选了数十个突变点及其组合，最终得到本发明的Y51D突变、R137K突变及其组合。上述突变体可改善蛋白的体外复性效率，提高蛋白本身的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，并可显著提高蛋白酶的酶活和酶活稳定性。

其中，突变所表示的含义如表1所示：

表1

作为本发明技术方案的一种改进，所述赖氨酰特异性内切酶突变体的突变选自：

（1）Y51D突变；

（2）R137K突变；

（3）Y51D突变和R137K突变。

作为本发明技术方案的一种改进，突变体的具体实例包括：

（1）突变体HSE-LC，包括Y51D突变和R137K突变；

（2）突变体HSE-LC-1，仅包括Y51D突变；

（3）突变体HSE-LC-2，仅包括R137K突变。

实验结果证实，突变体HSE-LC和突变体HSE-LC-2均能显著提高相对酶活，且突变体HSE-LC的效果更优。而突变体HSE-LC和突变体HSE-LC-1均能显著提高酶活稳定性，同样以突变体HSE-LC的效果更优。综合相对酶活和酶活稳定性实验结果可知，突变体HSE-LC的综合性能最优。

本发明的第二方面提出了编码上述重组融合蛋白的多核苷酸序列。其中，例如根据突变体HSE-LC的氨基酸序列设计并优化得到其编码序列，得到具体的多核苷酸序列如下所示：

ggcgtgagcggcagctgcaacattgatgtggtgtgcccggaaggcgatggccgccgcgatattattcgcgcggtgggcgcgtatagcaaaagcggcaccctggcgtgcaccggcagcctggtgaacaacaccgcgaacgatcgcaaaatggattttctgaccgcgcatcattgcggcatgggcaccgcgagcaccgcggcgagcattgtggtgtattggaactatcagaacagcacctgccgcgcgccgaacaccccggcgagcggcgcgaacggcgatggcagcatgagccagacccagagcggcagcaccgtgaaagcgacctatgcgaccagcgattttaccctgctggaactgaacaacgcggcgaacccggcgtttaacctgttttgggcgggctgggatcgcaaagatcagaactatccgggcgcgattgcgattcatcatccgaacgtggcggaaaaacgcattagcaacagcaccagcccgaccagctttgtggcgtggggcggcggcgcgggcaccacccatctgaacgtgcagtggcagccgagcggcggcgtgaccgaaccgggcagcagcggcagcccgatttatagcccggaaaaacgcgtgctgggccagctgcatggcggcccgagcagctgcagcgcgaccggcaccaaccgcagcgatcagtatggccgcgtgtttaccagctggaccggcggcggcgcggcggcgagccgcctgagcgattggctggatccggcgagcaccggcgcgcagtttattgatggcctggatagcggcggcggcaccccg

本发明的第三方面提出用于表达赖氨酰特异性内切酶突变体的重组表达载体，重组表达载体包括上述核苷酸序列。

本发明的第四方面提出包括上述重组表达载体的重组基因工程菌。该重组基因工程菌采用以下方法制备得到：

（1）合成上述多核苷酸序列；

（2）将多核苷酸插入到表达载体上，构建得到重组表达载体；

（3）将重组表达载体导入到宿主菌中，得到表达赖氨酰特异性内切酶突变体的重组基因工程菌。

其中，宿主菌选自大肠杆菌，进一步优选大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）。具体的，本发明实施例的表达载体优选使用质粒载体，具体可选用质粒pET-32a(+)；并优选通过NcoI和XhoI酶切位点插入本发明的多核苷酸，构建重组质粒。本发明的第四方面提出一种表达赖氨酰特异性内切酶突变体的重组基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

（1）合成上述多核苷酸序列；

（2）将多核苷酸插入到表达载体上，构建得到重组表达载体；

（3）将重组表达载体导入到宿主菌中，得到表达赖氨酰特异性内切酶突变体的重组基因工程菌。

其中，宿主菌选自大肠杆菌，进一步优选大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）。具体的，本发明实施例的表达载体优选使用质粒载体，具体可选用质粒pET-32a(+)；并优选通过NcoI和XhoI酶切位点插入本发明的多核苷酸，构建重组质粒。

本发明提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本发明的赖氨酰特异性内切酶突变体相对于野生型具有更高的酶活和酶活稳定性。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1：赖氨酰特异性内切酶的制备

1、根据赖氨酰特异性内切酶的氨基酸序列，设计并合成其编码多核苷酸序列，如突变体HSE-LC，其是将野生型赖氨酰特异性内切酶的第51位和第137位氨基酸分别进行Y51D和R137K突变得到的突变酶，氨基酸序列具体如下所示：

GVSGSCNIDVVCPEGDGRRDIIRAVGAYSKSGTLACTGSLVNNTANDRKMDFLTAHHCGMGTASTAASIVVYWNYQNSTCRAPNTPASGANGDGSMSQTQSGSTVKATYATSDFTLLELNNAANPAFNLFWAGWDRKDQNYPGAIAIHHPNVAEKRISNSTSPTSFVAWGGGAGTTHLNVQWQPSGGVTEPGSSGSPIYSPEKRVLGQLHGGPSSCSATGTNRSDQYGRVFTSWTGGGAAASRLSDWLDPASTGAQFIDGLDSGGGTP；

根据上述氨基酸序列设计并优化得到其编码序列，其编码核苷酸序列如下所示：

ggcgtgagcggcagctgcaacattgatgtggtgtgcccggaaggcgatggccgccgcgatattattcgcgcggtgggcgcgtatagcaaaagcggcaccctggcgtgcaccggcagcctggtgaacaacaccgcgaacgatcgcaaaatggattttctgaccgcgcatcattgcggcatgggcaccgcgagcaccgcggcgagcattgtggtgtattggaactatcagaacagcacctgccgcgcgccgaacaccccggcgagcggcgcgaacggcgatggcagcatgagccagacccagagcggcagcaccgtgaaagcgacctatgcgaccagcgattttaccctgctggaactgaacaacgcggcgaacccggcgtttaacctgttttgggcgggctgggatcgcaaagatcagaactatccgggcgcgattgcgattcatcatccgaacgtggcggaaaaacgcattagcaacagcaccagcccgaccagctttgtggcgtggggcggcggcgcgggcaccacccatctgaacgtgcagtggcagccgagcggcggcgtgaccgaaccgggcagcagcggcagcccgatttatagcccggaaaaacgcgtgctgggccagctgcatggcggcccgagcagctgcagcgcgaccggcaccaaccgcagcgatcagtatggccgcgtgtttaccagctggaccggcggcggcgcggcggcgagccgcctgagcgattggctggatccggcgagcaccggcgcgcagtttattgatggcctggatagcggcggcggcaccccg。

2、重组表达载体的构建及工程菌的构建

将合成上述编码基因，并将其分别插入至pET-32a(+)质粒的NcoI 和XhoI位点之间，构建重组质粒；重组质粒转化如大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3），转化液涂布LB固体培养基（含卡那霉素30 μg/mL），利用抗性筛选得到含有目的基因重组质粒的工程菌。

经测序验证，得到的工程菌中的序列与所设计的序列一致。

基因合成及测序服务业务均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

3、目的蛋白的诱导表达

（1）培养基的配制方法如下：

LB液体培养基，Trypton 10 g/L，酵母抽提物 5 g/L，NaCl 10 g/L。

LB固体培养基，Trypton 10 g/L，酵母抽提物 5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂 20 g/L。

（2）目的蛋白表达

取保存的重组工程菌，接种LB液体培养基，30℃，220 rpm，过夜培养后测定OD600，转种至20 mL新鲜LB培养基中，培养至OD600=0.6~4.0，加入IPTG（终浓度为0.1 ~ 1.0 mM），16 ~ 30 ℃，220 rpm，诱导培养12 ~ 24小时，收集上清液，以测定酶活。

按照上述方法，分别制备设计野生型赖氨酰特异性内切酶、突变体HSE-LC-1和突变体HSE-LC-2的编码序列，并按照上述方法制备得到所述酶。

实施例2：酶活检测

配制底物溶液，底物溶液的配方为：180 mmol/L Tris-HCl，0.25 mmol/L Bz-Lys-pNA，pH值为9.2。

取1450 μL底物溶液，于30℃恒温水浴中加热5 min，然后再加入50 μL实施例1步骤（2）中的上清液（稀释合适倍数），30℃水浴中反应5 min，立即加入500 μL的45％(V/V)乙酸溶液终止反应，用纯化水稀释3倍后，在405 nm波长下测定反应液的吸光度。

酶活定义为：在30℃下每分钟催化底物生成1 μmol对硝基苯胺的酶量，定义为1U。以野生型酶活定义为100%相对酶活，计算得到相对酶活的实验结果如表2所示：

表2

由表2的实验数据可知，相比于野生型赖氨酰特异性内切酶，包含Y51D突变的突变体HSE-LC-1活性略有降低，但包含R137K突变的突变体HSE-LC-2，其活性则有显著提升。同时，实验证实，同时包含Y51D突变和R137K突变的突变体HSE-LC，其酶活更是超过野生型3倍以上，酶活得到显著提升。

实施例3：稳定性研究

收集实施例1步骤（2）中的上清液，室温环境下放置，分别在放置0、24和72小时取样，按照实施例2中的方法检测酶活，以自身0 h酶活定义为100%相对酶活，计算酶活稳定性结果如表3所示。

表3

由表3的实验数据可知，相比于野生型赖氨酰特异性内切酶，包含Y51D突变的突变体HSE-LC-1，其酶活稳定性有所升高，但包含R137K突变的突变体HSE-LC-2，其酶活稳定性基本不变。但将两者的突变进行组合的突变体HSE-LC，其酶活稳定性得到一定提升。

综合本发明实施例2和3的内容可知，Y51D突变能够带来酶活稳定性的提升，但对酶活影响有限，而R137K突变则对酶活提升显著，但对酶活稳定性基本无影响；但当两者结合，其酶活和酶活稳定性均得到显著提升，可见Y51D突变对野生型赖氨酰特异性内切酶结构稳定性的影响进一步提升了酶活，使得两者突变的组合取得了显著的酶活和酶活稳定性提升。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。