一种基于叶绿素荧光成像技术的红豆杉胁迫检测方法

技术领域

本发明涉及植物早期胁迫诊断技术，特别涉及一种基于叶绿素荧光成像技术的红豆杉胁迫检测方法。

背景技术

红豆杉是红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)常绿针叶灌木或乔木，是国家I级野生珍稀濒危保护植物，具有极大的材用、观赏和药用价值，尤其是树体中特有的二萜类物质紫杉醇，被认为是一线临床最有效的抗癌药物，在治疗乳腺癌、肺癌和卵巢癌等方面具有极好的疗效。然而，红豆杉生长缓慢，对生境的要求十分严格，即使是适生区内的环境因子发生变化也会影响红豆杉的生长发育，甚至威胁其生存，这严重制约了红豆杉的栽培和推广。因此，有必要建立科学有效的红豆杉早期胁迫状态的检测方法，这是合理开发红豆杉资源、快速准确地鉴定和筛选环境耐受型红豆杉种质以及提高红豆杉育种效率的基础，对红豆杉的保护与利用具有重要意义。

叶绿素荧光技术是研究植物在不同环境下光合作用变化的强大工具。基于其快速、灵敏和非破坏性测量等优点，已被广泛应用于植物抗逆生理等领域。植物遭受胁迫后，叶片的荧光强度会先于表型特征发生改变。由于光合活性的丧失，荧光信息会相应减少，严重时几乎没有荧光信息。因此，通过探究叶绿素荧光动力学的变化，结合图像处理技术，能实现健康植株和胁迫植株的区分。

现阶段，虽然已有学者尝试利用叶绿素荧光成像技术探究不同生物或非生物胁迫对植物的影响，比如温度、水分、病虫害等。但适用于红豆杉胁迫状态的检测方法目前尚未见报道，且不同植物的叶绿素荧光参数对环境变化的敏感程度不同，需要筛选合适的参数用于红豆杉荧光成像的构建。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种基于叶绿素荧光成像技术的红豆杉胁迫检测方法。

需要说明的是，目前已公布的方法大多针对特定时期和特定胁迫，在自然或农业生产条件下的识别效果一般；且由于季节变动直接影响植株的生存状态。因此，有必要更加全面的分析季节变动对红豆杉胁迫状态的检测效果的影响。

另外，目前技术多为针对阔叶植物开展的单点或多点测量，而红豆杉作为典型的针叶树种，在遭受胁迫后，叶片表面的不同区域或不同针叶之间的叶绿素荧光参数均存在空间异质性，单独叶片以及叶片单点或多点测量分析是不足的；且红豆杉对生长环境要求严格，开发一种先于表型症状的监测方法用于检测红豆杉的早期胁迫状态，以推动红豆杉的保护和利用。

一种基于叶绿素荧光成像技术的红豆杉胁迫检测方法，包括如下步骤：

(1)采集红豆杉带叶小枝，所述的红豆杉带叶小枝包括不同采集时间和不同生长季节的带有全展、成熟叶的小枝；

(2)用滤纸或纱布将步骤(1)中的红豆杉带叶小枝表面的水分和污渍擦拭干净，置于挤出空气的自封袋中，并置于不透光的冰盒中进行暗处理；

(3)利用调制式荧光成像系统测定红豆杉带叶小枝的叶绿素荧光参数Fv/Fm(PSII反应中心的最大光量子产量)值，并对相应的RGB图像进行采集；

(4)根据以下分级标准确定待测红豆杉种质的胁迫程度：

Fv/Fm≥0.8，RGB图像中整个小枝的叶片呈现均匀的橙红色，为健康状态；

Fv/Fm在0.74～0.8，RGB图像中整个小枝的叶片呈现橙黄色，为轻度胁迫状态；局部叶片呈现黄绿色，为局部中度胁迫状态；

Fv/Fm在0.70～0.74，RGB图像中整个小枝的叶片呈现黄绿色，为中度胁迫状态；局部叶片呈现蓝绿色，为局部重度胁迫状态；

Fv/Fm＜0.7，RGB图像中整个小枝的叶片呈现蓝绿色，为重度胁迫状态。

进一步地，步骤(1)中，所述的不同采集时间优选在晴朗无云的晴天，在上午9:00至11:00间，该时段为植株每日光合作用的关键时期；所述的不同生长季节可以根据实际需要确定。

作为优选，本发明按月采集了红豆杉的带叶小枝作为供试样品。

所述的带有全展、成熟叶的小枝，优选植株顶端往下数第3-7节位分枝顶部一年生小枝，采集长度为3～5cm，可保证每个小枝上包含15～20片针叶。

进一步地，步骤(2)中，所述的暗处理时间至少为20分钟，可以根据实际需要确定。

作为优选，本发明将样品的保存、运输和暗处理结合在一起，时间在20分钟至60分钟，可保证离体叶片后续测定的准确性。

进一步地，步骤(3)中，按仪器说明书所述规范运行叶绿素荧光成像系统，测量供试样品叶绿素荧光参数Fv/Fm值，并采集相对应的RGB图像。

作为优选，本发明将Fv/Fm值对应的RGB图像色彩模式设为0～255，Fv/Fm值对应的RGB图像色彩强度值设为0.35～0.9，可在鉴定胁迫程度时呈现明显的分级效果；

更进一步地，步骤(3)中测量得到的叶绿素荧光参数Fv/Fm值为整株带叶小枝样品的综合值；作为优选，本发明对每个材料进行3次重复样品的检测，再计算平均值，从而得到待测材料的Fv/Fm值。

进一步地，步骤(4)中，所述的分级标准，以全年不同气候条件下不同红豆杉种质Fv/Fm值和对应的RGB图像的综合鉴定结果为参考，该分级标准对于不同生长环境下的红豆杉带叶小枝都通用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明通过将叶绿素荧光成像技术应用于红豆杉种质胁迫的检测中，采用红豆杉带叶小枝进行叶绿素荧光成像的检测，同时针对红豆杉种质进行特定参数的筛选和成像特征的优化，不仅对植株造成的创伤小、操作过程快捷，而且结果重复性好、对于不同季节和不同生长环境的红豆杉的胁迫状态均具有良好的鉴定效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1是未经统一成像模式设定的曼地亚红豆杉带叶小枝1月～12月Fv/Fm的代表性RGB图像。

图2是未经统一成像模式设定的南方红豆杉带叶小枝1月～12月Fv/Fm的代表性RGB图像。

图3是曼地亚红豆杉带叶小枝1月～12月Fv/Fm值及对应的代表性RGB图像。

图4是南方红豆杉带叶小枝1月～12月Fv/Fm值及对应的代表性RGB图像。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例及说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。

下面，将结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1

1.红豆杉带叶小枝的采集

本发明采用的红豆杉种质分别为曼地亚红豆杉(Taxus media)和南方红豆杉(Taxus mairei)。供试用的红豆杉带叶小枝分别采集于2021年1月～12月的江苏省南京市玄武区南京中山植物园红豆杉种质资源圃内。观测期内的环境因子变化如表1所示。

由表1可知，随着季节的变化，气温、光照以及降水量等均会发生不同程度的改变，从而形成潜在的环境胁迫影响红豆杉的生长和发育。每月月中(10日～15日)选择晴朗无云的晴天，在上午9:00至11:00间，对植株顶端往下数第3-7节位分枝顶部带有全展、成熟叶的当年生小枝进行采集，采集长度为3～5cm，保证每个小枝上包含15～20片针叶；

表1 2021年1～12月环境因子数据

2.红豆杉带叶小枝的前处理

每月采集红豆杉带叶小枝样品后，立即用预先准备好的滤纸或纱布将样品表面的水分和污渍擦拭干净，置于挤出空气的自封袋中，并置于不透光的冰盒中保存，期间同时完成样品运输和暗处理过程，时间在20分钟至60分钟，以保证离体样品后续测定的准确性。

3.将完成暗处理的样品平铺放置在叶绿素荧光成像系统检测室的置物台上，本发明实施例使用的叶绿素荧光成像系统为调制式荧光成像系统Chlorophyll Fluorescence-Imager(CFI,Technologica,UK)，按仪器说明书所述规范运行叶绿素荧光成像系统，采用内置软件Fluor Imager(version 2.2)自动计算获得叶绿素荧光参数，包括Fv/Fm、Fv’/Fm’(PSII反应中心的有效光量子产量)、NPQ(非光化学淬灭)、qP(光化学淬灭)和

如表2，通过分析全年不同红豆杉种质不同叶绿素荧光参数的动态变化结果发现，Fv’/Fm’和

表2两种红豆杉叶绿素荧光参数的月动态变化

此外，未经统一成像模式设定的曼地亚红豆杉和南方红豆杉的Fv/Fm的代表性RGB图像见图1和图2。如图1和图2可见，均不能准确区分叶片的健康程度和异质性。

根据不同红豆杉种质Fv/Fm的全年变化结果，设定荧光成像模式用以匹配参数分级。作为优选，设定RGB图像色彩模式为0～255，RGB图像色彩强度值为0.35～0.9，在鉴定红豆杉胁迫程度时呈现明显的分级效果。每个材料设置3个重复样本，计算平均值，得到该材料的Fv/Fm值。

4.根据以下分级标准确定待测红豆杉的胁迫程度：

Fv/Fm≥0.8，RGB图像中整个小枝的叶片呈现均匀的橙红色，为健康状态；

Fv/Fm在0.74～0.8，RGB图像中整个小枝的叶片呈现橙黄色，为轻度胁迫状态；局部叶片呈现黄绿色，为局部中度胁迫状态；

Fv/Fm在0.70～0.74，RGB图像中整个小枝的叶片呈现黄绿色，为中度胁迫状态；局部叶片呈现蓝绿色，为局部重度胁迫状态；

Fv/Fm＜0.7，RGB图像中整个小枝的叶片呈现蓝绿色，为重度胁迫状态。

不同红豆杉种质的Fv/Fm值和RGB图片见图3和图4。

根据本实施例的分级标准，由检测结果(图3和图4)可见，

曼地亚红豆杉在2月和4月～9月呈现健康状态，在10月和11月呈现轻度胁迫状态，在3月呈现局部中度胁迫状态，在12月呈现中度胁迫状态，在1月呈现重度胁迫状态；

南方红豆杉在4月、5月、7月和9月呈现健康状态，在11月呈现轻度胁迫状态，在3月、6月、8月和10月呈现局部中度胁迫状态，在2月和12月呈现中度胁迫状态，在1月呈现重度胁迫状态；

此外，南方红豆杉在1月，叶片表面出现脱绿的现象，进一步验证了分级标准的准确性。

且，本发明使用的供试红豆杉为常用栽培材料，实施本发明不限于上述种质。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。