一种用于治疗老年性聋的中药配方及其应用方法

技术领域

本发明属于医药技术领域及系统生物信息学技术领域，公开了一种用于治疗老年性聋的中药配方及其应用方法，具体涉及一种用于治疗老年性聋的中药配方及其临床应用方法并基于网络药理学论证其药理机制。

背景技术

老年性聋又称年龄相关性听力损失(Age-Related Hearing Loss,ARHL),主要表现为隐匿性、缓慢进行性双侧高频感音神经性听力下降,可引起老年患者的交流障碍、认知改变、脱离社会等不良影响，给社会和家庭带来沉重负担。通常认为其发病机制为氧化应激、兴奋性毒性、炎症和缺血通过凋亡和自噬等细胞死亡途径导致耳蜗内特定位置(听觉毛细胞、血管纹、螺旋神经节神经元和支持细胞)的年龄相关变化，如耳蜗螺旋神经节细胞及其纤维、基底膜上的毛细胞等发生退行性变。老年性聋的治疗手段极其有限，目前西医治疗原则是扩血管、营养神经、改善微循环，但并未针对病因用药，临床疗效也存在争议。因此，急需寻求一种防治老年性聋的有效方法。中医辨证角度来讲，老年性聋的病机主要为肾精不足、气血亏虚、肝火上扰、气滞血瘀等。基于ARHL的中医病机，发明一种中药配方，其药物组成为柴胡、川芎、香附、葛根、路路通、石菖蒲、煅磁石、丹参、黄苓、升麻；其剂型为颗粒剂，便携度高。网络药理学是基于网络数据库及相关软件对复方或单药信息进行整合、寻找药物的有效活性成分及靶点信息的药理分析方法，可通过计算机分析初步阐明药物的基本药理机制。基于网络药理学论证其药理机制，精准挖掘本中药配方治疗老年性聋核心靶点，有效预测生物进程及信号通路，充分阐明本中药配方在治疗老年性聋方面的合理性。临床结果表明，本发明能够安全有效地治疗老年性聋。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种用于治疗老年性聋的中药配方及其应用方法，具体涉及一种用于治疗老年性聋的中药配方及其临床应用方法并基于网络药理学论证其药理机制。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案包括以下步骤：

S1、所述中药配方的原材料包括：柴胡、川芎、香附、葛根、路路通、石菖蒲、煅磁石、丹参、黄苓、升麻，各原料的重量份数为：柴胡10～20、川芎15～25、香附15～25、葛根10～20、路路通15～25、石菖蒲15～25、煅磁石20～30、丹参10～20、黄芩15～25、升麻4～10，各原料的重量份数基于患者伴随症状的情况来确定，如耳鸣、耳闷、失眠等；

S2、基于老年性聋患者耳聋分级(轻度26～40分贝、中度41～55分贝、中重度56～70分贝、重度71～91分贝、极重度91分贝以上)及听力复查结果(纯音听阈)，确定其临床应用方法，包括服药剂量、时间和注意事项；

S3、所述药理机制的论证主要涉及核心靶点、核心成分的确定，其内容如下：

(1)、获取中药配方潜在活性成分及靶点；检索老年性聋靶点；获得药物-疾病共同靶点；获取关键生物进程及信号通路；

(2)、利用药物-疾病共同靶点构建PPI(Protein-Protein Interaction)网络，并根据阈值化保留网络中的重要连接，然后根据度中心性(Degree Centrality,DC)、介数中心性(Betweenness Centrality,BC)、接近中心性(Closeness Centrality,CC)、特征向量中心性(Eigenvector Centrality,EC)这四个网络属性计算网络中各节点的重要程度，并根据节点的重要程度来确定核心靶点；

(3)、筛选中药配方核心成分；分子对接验证。

进一步地，所述步骤S1中主要伴随症状为耳鸣时，增加石菖蒲、煅磁石、丹参重量份数的占比，各原料的重量份数为柴胡20g、川芎15、香附25、葛根10、路路通15、石菖蒲20、煅磁石30、丹参20、黄苓15、升麻5。

更进一步地，所述步骤S1中主要伴随症状为耳闷时，增加葛根和路路通重量份数的占比，各原料的重量份数为柴胡15、川芎25、香附20、葛根20、路路通25、石菖蒲20、煅磁石25、丹参15、黄苓15、升麻5。

更进一步地，所述步骤S1中主要伴随症状为失眠时，增加黄芩和升麻重量份数的占比，各原料的重量份数为柴胡15、川芎20、香附25、葛根15、路路通20、石菖蒲20、煅磁石25、丹参15、黄苓25、升麻10。

更进一步地，所述步骤S2中，轻度老年性聋患者的服药剂量为每日1剂，分早晚两次于饭后1小时温水冲服，服药时间为3疗程(7日为一疗程),服药3疗程后复查纯音听阈，疗效不佳可按此方法加服1-2疗程。

更进一步地，所述步骤S2中，中度及中重度老年性聋患者的服药剂量为每日1剂，分早晚两次于饭后1小时温水冲服，服药时间为5疗程(7日为一疗程),服药5疗程后复查纯音听阈，疗效不佳可按此方法加服1-2疗程。

更进一步地，所述步骤S2中，重度及极重度老年性聋患者的服药剂量为每日1.5剂，分早中晚三次于1小时温水冲服，服药时间为7疗程(7日为一疗程),服药7疗程后复查纯音听阈，疗效不佳可按此方法加服1-2疗程。

更进一步地，所述步骤S2中，服药注意事项:忌生冷、辛辣、油腻、鱼腥、烟酒。

更进一步地，所述步骤S3中(1)，检索TCMSP数据库，分别输入柴胡、川芎、香附、葛根、路路通、石菖蒲、煅磁石、丹参、黄苓、升麻，以OB≥35％和DL≥0.2为阈值筛选出潜在活性成分，进而通过检索数据库获得潜在活性成分的靶点；获取老年性聋靶点；获得药物-疾病共同靶点；获取关键生物进程及信号通路并进行可视化处理。

更进一步地，所述步骤S3中(2)，首先将药物-疾病共同靶点输入STRING数据库，获得PPI网络；然后对网络进行所述阈值化，其中包括设定J

(J

其中，J用于确定后续需要保留的两点间有连线的节点对的数量；

那么根据J，找到J

更进一步地，所述步骤S3中(2)，阈值化后的网络中，某一节点的DC的计算公式为：

其中，N代表网络的节点个数，i代表某一节点，k

网络中某一节点的BC的计算公式为:

其中，N代表网络的节点个数，i、s、t分别代表某一节点，g

网络中某一节点CC的计算公式为：

其中，N代表网络的节点个数，i、j分别代表某一节点，d

网络中某一节点EC的计算公式为：

其中，N代表网络的节点个数，i、j分别代表某一节点，x

x＝cAx

这表示x是矩阵A的特征值c

x(t)＝cAx(t-1),t＝1,2,...,

直到归一化的x'(t)＝x'(t-1)为止；每一步的迭代过程中，如果给x除以邻接矩阵A的主特征值λ，这一方程就能得到一个收敛的非零解，即x＝λ

利用上述公式，计算网络中各节点的重要性，其公式为：

其中，Q

更进一步地，所述步骤S3中(2)，计算所有节点重要性的均值Q，其公式为：

其中，N代表网络的节点个数；

选取节点中其重要性大于Q的节点作为核心靶点。

更进一步地，所述步骤S3中(3)，利用潜在活性成分及核心靶点构建成分-靶点-疾病网络，根据DC筛选核心成分，然后对核心靶点与核心成分进行分子对接验证。

附图说明：

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1所示为药物-疾病共同靶点韦恩图。

图2所示为GO富集分析图。

图3所示为KEGG信号通路富集分析图。

图4所示为药物-疾病共同靶点PPI网络图。

图5所示为成分-靶点-疾病网络图。

图6所示为核心靶点TP53与核心成分MOL000098对接图。

具体实施方式

为了使本发明的目的及有益效果更加清楚明白，下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用数据库及软件如下：

TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)，TargetNet数据库(http://targetnet.scbdd.com/)，STRING数据库(https://cn.string-db.org/)，UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)，OMIM数据库(https://www.omim.org/),GeneCards数据库(https://www.genecards.org/),DieGeNet(https://www.disgenet.org/home/),VENNY2.1在线作图工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/),Cytoscape3.9.1软件，DAVID在线软件(https://david.ncifcrf.gov/)，微生信在线平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)，Discovery Studio2019软件。

一种用于治疗老年性聋的中药配方及其应用方法，具体涉及一种用于治疗老年性聋的中药配方及其临床应用方法并基于网络药理学论证其药理机制，其特征在于，包括以下步骤：

S1、所述中药配方的原材料包括：柴胡、川芎、香附、葛根、路路通、石菖蒲、煅磁石、丹参、黄苓、升麻，各原料的重量份数为：柴胡10～20、川芎15～25、香附15～25、葛根10～20、路路通15～25、石菖蒲15～25、煅磁石20～30、丹参10～20、黄芩15～25、升麻4～10，各原料的重量份数基于患者伴随症状的情况来确定，如耳鸣、耳闷、失眠等；

S2、基于老年性聋患者耳聋分级(轻度26～40分贝、中度41～55分贝、中重度56～70分贝、重度71～91分贝、极重度91分贝以上)及听力复查结果(纯音听阈)，确定其临床应用方法，包括服药剂量、时间和注意事项；

S3、所述药理机制的论证主要涉及核心靶点、核心成分的确定，其内容如下：

(1)、获取中药配方潜在活性成分及靶点；检索老年性聋靶点；获得药物-疾病共同靶点；获取关键生物进程及信号通路；

(2)、利用药物-疾病共同靶点构建PPI网络，并根据阈值化保留网络中的重要连接，然后根据度中心性(Degree Centrality,DC)、介数中心性(Betweenness Centrality,BC)、接近中心性(Closeness Centrality,CC)、特征向量中心性(EigenvectorCentrality,EC)这四个网络属性计算网络中各节点的重要程度，并根据节点的重要程度来确定核心靶点；

(3)、筛选中药配方核心成分；分子对接验证。

所述步骤S1中主要伴随症状为耳鸣时，增加石菖蒲、煅磁石、丹参重量份数的占比，各原料的重量份数为柴胡20g、川芎15、香附25、葛根10、路路通15、石菖蒲20、煅磁石30、丹参20、黄苓15、升麻5。

所述步骤S1中主要伴随症状为耳闷时，增加葛根和路路通重量份数的占比，各原料的重量份数为柴胡15、川芎25、香附20、葛根20、路路通25、石菖蒲20、煅磁石25、丹参15、黄苓15、升麻5。

所述步骤S1中主要伴随症状为失眠时，增加黄芩和升麻重量份数的占比，各原料的重量份数为柴胡15、川芎20、香附25、葛根15、路路通20、石菖蒲20、煅磁石25、丹参15、黄苓25、升麻10。

所述步骤S2中，轻度老年性聋患者的服药剂量为每日1剂，分早晚两次于饭后1小时温水冲服，服药时间为3疗程(7日为一疗程),服药3疗程后复查纯音听阈，疗效不佳可按此方法加服1-2疗程。

所述步骤S2中，中度及中重度老年性聋患者的服药剂量为每日1剂，分早晚两次于饭后1小时温水冲服，服药时间为5疗程(7日为一疗程),服药5疗程后复查纯音听阈，疗效不佳可按此方法加服1-2疗程。

所述步骤S2中，重度及极重度老年性聋患者的服药剂量为每日1.5剂，分早中晚三次于1小时温水冲服，服药时间为7疗程(7日为一疗程),服药7疗程后复查纯音听阈，疗效不佳可按此方法加服1-2疗程。

所述步骤S2中，服药注意事项:忌生冷、辛辣、油腻、鱼腥、烟酒。

所述步骤S3中(1)，检索TCMSP数据库，分别输入柴胡、川芎、香附、葛根、路路通、石菖蒲、煅磁石、丹参、黄苓、升麻，以OB≥35％和DL≥0.2为阈值筛选出中药配方潜在活性成分144个(表1)，通过Pubchem数据库获取上述潜在的Canonical SMILES(SimplifiedMolecular Input-Line Entry System)号，使用Canonical SMILES号分别于SwissTargetPrediction及TargetNet数据库进行化合物靶点预测。SwissTargetPrediction数据库预测靶点信息可直接输出为基因名称，截取前15个靶点信息并保存。TargetNet数据库获得的靶点信息为UniProt ID格式，通过UniProt数据库将其转化为基因名称。将靶点去重整合，获得药物潜在活性成分的靶点731个(表1)；以老年性聋“Age-Related Hearing Loss”为关键词，检索OMIM、GeneCards、DieGeNet数据库，将得到的靶点去重整合，获取老年性聋靶点394个；分别将药物活性成分靶点及疾病靶点导入VENNY2.1在线作图平台，对二者取交集，制作韦恩图，获得药物-疾病共同靶点29个(表2，图1)；使用DAVID在线软件对药物-疾病共同靶点进行GO(Gene Ontology)和KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，设定P＜0.05，使用微生信在线平台进行可视化处理。GO分析包括生物过程(Biological Processes,BP)、分子功能(MolecularFunctions,MF)及细胞成分(Cellular Components,CC)。GO富集分析结果显示(图2)，主要集中于BP，涉及到基因表达的正向调控、MAP激酶活性的正向调节、细胞对机械刺激的反应、肽基丝氨酸磷酸化的正向调节、蛋白质磷酸化的正向调节等。KEGG信号通路富集分析结果显示(图3)，主要集中在PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、EGFR信号通路、癌症通路等。

表1中药配方潜在活性成分及靶点

表2药物-疾病共同靶点信息

所述步骤S3中(2)，首先将药物-疾病共同靶点输入STRING数据库，获得PPI网络(图4)，包含29个节点和145条连线；然后对网络进行所述阈值化，其中包括设定J

(J

其中，J用于确定后续需要保留的两点间有连线的节点对的数量；

那么根据J，找到J

所述步骤S3中(2)，阈值化后的网络中，某一节点的DC的计算公式为：

其中，N代表网络的节点个数，i代表某一节点，k

网络中某一节点的BC的计算公式为:

其中，N代表网络的节点个数，i、s、t分别代表某一节点，g

网络中某一节点CC的计算公式为：

其中，N代表网络的节点个数，i、j分别代表某一节点，d

网络中某一节点EC的计算公式为：

其中，N代表网络的节点个数，i、j分别代表某一节点，x

x＝cAx

这表示x是矩阵A的特征值c

x(t)＝cAx(t-1),t＝1,2,...,

直到归一化的x'(t)＝x'(t-1)为止；每一步的迭代过程中，如果给x除以邻接矩阵A的主特征值λ，这一方程就能得到一个收敛的非零解，即x＝λ

利用上述公式，计算网络中各节点的重要性，其公式为：

其中，Q

所述步骤S3中(2)，计算所有节点重要性的均值Q，其公式为：

其中，N代表网络的节点个数；

选取节点中其重要性大于Q的节点作为核心靶点，共得到11个核心靶点，分别为TP53、AKT1、VEGFA、TNF、ERBB2、IL6、IL1B、PTPN11、PIK3CA、TLR4、IL10。

所述步骤S3中(3)，将潜在活性成分及核心靶点输入Cytoscape3.9.1软件构建成分-靶点-疾病网络(图5)，点击“Analyze Network”进行网络分析，共包含63个节点，84条连线，椭圆形节点“ARHL”代表疾病“老年性聋”，长方形节点代表核心靶点，六边形节点代表其靶点与核心靶点有交集的中药配方活性成分。计算网络中所有潜在活性成分的DC值，将DC大于平均值的潜在活性成分节点筛选为核心成分，共得到10个核心成分(表3)，分别为MOL000098、MOL000006、MOL000173、MOL002714、MOL004058、MOL007101、MOL007145、MOL007154、MOL001689、MOL001924；将筛选得到的11个核心靶点与10个核心成分进行分子对接；从UniProt数据库中检索获取对应各靶点的PDB ID,从RCSB PDB数据库下载各靶点的X射线衍射3D高分辨结构文件。将核心靶点作为受体导入Discovery Studio 2019软件,进行添加极性氢、计算电荷、去掉水分子等操作；从Pubchem数据库获得核心成分的MOL2格式的3D结构，作为小分子配体，同样导入Discovery Studio 2019软件进行加氢、去水；随后使用LibDock模块进行半柔性分子对接，验证核心靶点与核心成分相互作用的可靠性。选择核心靶点TP53(PDB ID:6GGA)与核心成分MOL000098的对接结果进行展示(图6)，右上和右下分别为对接图的2维和3维图，可见MOL000098通过PRO、CYS、THR、TRP、ASP、LEU、VAL等氨基酸残基通过常规氢键(Conventional Hydrogen Bond)、碳氢键(Carbon Hydrogen Bond)等分子间作用力与TP53发生交联，产生相互作用。其他核心靶点与核心成分的相互作用关系与其类似。结果表明，核心靶点与核心成分对接良好，结果可靠。

表3核心成分信息

下面结合临床研究数据说明本发明的有益效果：

1、一般资料

发明人收集2021.10.1—2022.9.31就诊于吉林大学第二医院耳科老年性聋患者88例，以是否服用本发明进行分组，按随机数字表法分为两组。治疗组46例，男27例，女19例；年龄60-79岁，平均(69.21±7.39)岁；对照组42例，男26例，女16例；年龄60-77岁，平均(67.36±8.12)岁。两组患者性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

诊断标准：①年龄在60周岁以上；②多为双耳发病，听力呈进行性下降，伴或不伴耳鸣、耳闷、失眠等；③纯音听阈结果在25分贝以上。

纳入标准：①符合上述老年性聋诊断标准；

②首次就诊，未经治疗；

③年龄范围：60岁以上；

④无中药禁忌症，无耳部疾病及其他疾病史；

⑤依从性佳，同意参与本研究并签署知情同意书。

排除标准：①不符合上述老年性聋诊断标准；

②非首次就诊，有治疗史；

③年龄范围：60岁以下；

④有中药禁忌症，有耳部疾病或其他基础疾病史；

⑤依从性不佳，拒绝参与本研究。

剔除与脱落标准：①纳入实验后未遵医嘱同时采取其他治疗手段；

②由于个人原因终止本次实验；

③治疗过程中发生严重的不良反应，无法耐受本次实验。

2、研究方法

①治疗方案：

对照组：行单纯声治疗，首先检查患者的耳鸣响度和音调，以此为基础模拟类似的自然声音，如鸟鸣、水流等声音，以患者自觉舒适，不反感为宜。每次30分钟，每天2次。疗程设定原则同治疗组。

治疗组：在声治疗基础上加服本发明，具体方法如下：

轻度老年性聋患者的服药剂量为每日1剂，分早晚两次于饭后1小时温水冲服，服药时间为3疗程(7日为一疗程)。服药3疗程后复查纯音听阈，疗效不佳可按此方法加服1-2疗程。

中度及中重度老年性聋患者的服药剂量为每日1剂，分早晚两次于饭后1小时温水冲服，服药时间为5疗程(7日为一疗程)。服药5疗程后复查纯音听阈，疗效不佳可按此方法加服1-2疗程。

重度及极重度老年性聋患者的服药剂量为每日1.5剂，分早中晚三次于1小时温水冲服，服药时间为7疗程(7日为一疗程)。服药7疗程后复查纯音听阈，疗效不佳可按此方法加服1-2疗程。

②治疗结束进行纯音听阈检查，疗效判定标准如下：

痊愈：受损频率听力恢复至正常，或达健耳水平，或达此次患病前水平；

显效：受损频率听力平均提高30分贝以上；

有效：受损频率听力平均提高15～30分贝；

无效：受损频率听力平均提高不足15分贝。

③统计学分析

采用SPSS22.0统计学软件分析两组治疗前后数据。计量资料以(x±s)表示，采用t检验；计数资料以率(％)表示，采用χ

3、治疗结果

经过治疗，治疗组的总有效率为84.78％，对照组的总有效率为64.29％，两组对比，差异具有统计学意义(P＜0.05)(表4)。

表4实验组与对照组疗效对比

注：P＜0.05

4、结论

临床研究结果显示，治疗组总有效率高于对照组(P＜0.05)，证实本发明制得的药物能够安全有效治疗老年性聋，总有效率高达84.78％，具备临床推广价值。

本发明的有益效果：本发明应用于老年性聋患者。根据老年性聋患者耳聋分级及听力复查结果调整服药剂量及时间，可达到最佳临床疗效。临床研究数据表明，本发明对老年性聋患者有效率高达84.78％。本发明剂型为颗粒剂，制作流程遵照国家标准，精准统一，最大程度降低药物制备过程的误差。同时，颗粒剂方便患者携带及服用，大大提高便捷度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。