一种基于红外测温技术的中草药发酵状态检测方法

技术领域

本发明属于中草药发酵技术领域，尤其涉及一种基于红外测温技术的中草药发酵状态检测方法。

背景技术

近年来，中医药尤其是中草药的研究快速发展，导致中草药相关副产物的生成也逐年增加，而现有技术中对中草药副产物的开发利用不足，存在着资源严重浪费的问题。中草药主要为植物源药材，其有效成分主要存在于细胞胞浆中，受到植物细胞壁中纤维结构的阻碍，导致有效活性成分难以被充分提取、药效不理想而造成资源浪费。发酵技术作为一种有效提高中草药有效成分的含量和药效，降低毒性，减少毒副作用，产生新活性成分的方法，目前存在着发酵过程不可控、容易污染杂菌、不能实时评估中草药发酵程度、受发酵条件影响波动较大等问题。

此外，现代发酵技术纳入了微生物学、生物工程学、药物学和生物情报信息学等技术，液体发酵可以实时检测温度、湿度、酸碱度、菌种生长等发酵参数，这在很大程度上提升了发酵产品的质量与安全。但相对于液体发酵，中草药一般固体发酵更为普遍。而固体发酵物质的非流动性，实时检测上述发酵参数较为困难。

目前，红外测温技术已经被应用于很多医疗领域，如体温检查，肿瘤检查等，但并没有现有技术报道其在中草药发酵领域的应用。因此，提供一种利用红外测温技术能够实时检测固体发酵中药副产物的发酵状态和程度的方法，对于中草药产业的发展意义重大。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用红外测温技术实时测定中草药固体发酵内部的温度，并根据发酵中草药的内部温度预测中草药固体发酵状态和程度的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种基于红外测温技术的中草药发酵状态检测方法，将中草药用生物酶复合物进行固体发酵，用红外测温技术检测发酵中草药内部的温度，同时检测发酵中草药的总糖和还原糖含量；以发酵中草药内部温度为横坐标x，以发酵中草药的总糖和还原糖含量分别为纵坐标y，构建发酵中草药中总糖和还原糖含量的线性预测模型；根据发酵中草药的内部温度和所述线性预测模型预测发酵中草药的总糖和还原糖含量。

优选的，所述固体发酵为将中草药副产物干燥后粉碎过2-5目筛，与水按10:6-15的质量比混合，添加质量百分比为0.4-5.5％的生物酶复合物进行发酵处理。

优选的，所述中草药包括连翘、金银花、炒苦杏仁、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、红景天和甘草中的任意一种或几种。

优选的，所述中草药副产物包括中药制剂在加工过程中提取、煎煮产生的药渣，和/或中草药的非药用部位。

优选的，所述生物酶复合物由纤维素酶、木聚糖酶和蛋白酶按1-3:1:1的重量比例组成。

优选的，所述纤维素酶为6万U/g，木聚糖酶为6万U/g，蛋白酶为6万U/g。

优选的，所述发酵温度为40-50℃。

优选的，所述红外测温为将发酵中草药的样品发酵袋取出冷却10-30min后，使用连接红外热成像设备的仪器拍照测温。

优选的，所述发酵中草药内部的温度每隔1-2天利用红外测温技术检测一次。

优选的，所述发酵中草药为添加质量百分比5.0％的生物酶复合物，于50℃发酵时，总糖预测模型为y＝7.648x+60.643，R

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种基于红外测温技术的中草药发酵状态检测方法，本发明在使用生物酶复合物对中草药进行固体发酵时，利用红外测温技术测定中草药固体发酵内部的温度，同时检测发酵中草药的总糖和还原糖含量，构建发酵中草药中总糖和还原糖含量的线性预测模型，再根据发酵中草药的内部温度和构建的线性预测模型能够预测发酵中草药的总糖和还原糖含量。本发明通过实时检测中草药固体发酵的温度，利用发酵温度预测固体发酵中草药中总糖和还原糖的含量，能够评估中草药的发酵程度，以及发酵状态，对中草药产业发展具有重大意义。

附图说明

图1：黑曲霉(An)、枯草芽孢杆菌(Bs)和生物酶复合物(En)在不同温度不同添加量条件下发酵中草药样品中的温度变化；

图2：黑曲霉(An)、枯草芽孢杆菌(Bs)和生物酶复合物(En)在不同温度，不同添加量条件下发酵中草药样品中的活菌数、粗纤维、总糖和还原糖变化；

图3：基于黑曲霉(An)、枯草芽孢杆菌(Bs)和生物酶复合物(En)发酵样品中红外温度与活菌数(CFU)、粗纤维(CF)、总糖(TS)和还原糖(RS)之间的相关性分析；

图4：生物酶复合物(En)发酵样品中红外温度和总糖(TS)、还原糖(RS)相关性分析。

具体实施方式

本发明提供了一种基于红外测温技术的中草药发酵状态检测方法，将中草药用生物酶复合物进行固体发酵，用红外测温技术检测发酵中草药内部的温度，同时检测发酵中草药的总糖和还原糖含量；以发酵中草药内部温度为横坐标x，以发酵中草药的总糖和还原糖含量分别为纵坐标y，构建发酵中草药中总糖和还原糖含量的线性预测模型；根据发酵中草药的内部温度和所述线性预测模型预测发酵中草药的总糖和还原糖含量。

本发明中，所述固体发酵为将中草药副产物干燥后粉碎过2-5目筛，与水按10:6-15的质量比混合，添加质量百分比为0.4-5.5％的生物酶复合物进行发酵处理。优选的，所述固体发酵为将中草药副产物干燥后粉碎过4目筛，与水按10:8-12的质量比混合，添加质量百分比为0.5-5％的生物酶复合物进行发酵处理。作为一种可实施的方式，所述中草药副产物于45℃干燥6-12h，优选干燥8-10h。

本发明在研究中发现，生物酶复合物添加比例过低，中草药分解不完全，易造成资源浪费，同时发酵中草药的内部温度与发酵中草药的总糖和还原糖含量的线性关系较差，生物酶复合物添加比例过高，增加了生产成本。本发明中添加的生物酶复合物比例能够充分分解中草药副产物，提取中草药副产物中的有益成分，避免资源浪费。同时采取本发明提供的生物酶复合物及添加比例，在中草药发酵过程中，发酵中草药的内部温度与发酵中草药的总糖和还原糖含量呈现良好的线性关系。

本发明中，所述生物酶复合物由纤维素酶、木聚糖酶和蛋白酶按1-3:1:1的重量比例组成，优选的所述生物酶复合物由纤维素酶、木聚糖酶和蛋白酶按1:1:1的重量比例组成。所述纤维素酶为6万U/g，木聚糖酶为6万U/g，蛋白酶为6万U/g。在中草药发酵中，常使用微生物或酶制剂对中草药进行发酵，本发明在研究中发现，当添加真菌或细菌对中草药进行发酵时，发酵中草药内部温度，与发酵物中活菌数、湿度、温度、粗纤维、总糖和还原糖含量等发酵参数并不具有良好的线性关系，进而无法根据发酵中草药的内部温度预测中草药固体发酵的发酵状态和程度。本发明通过选择本发明提供的生物酶复合物组成及重量比对中草药进行固体发酵，在发酵过程中，发酵中草药的内部温度与发酵中草药的总糖和还原糖含量具有良好的线性关系，进而能够通过构建发酵中草药中总糖和还原糖含量的线性预测模型，再根据发酵中草药的内部温度和所述线性预测模型预测发酵中草药的总糖和还原糖含量。

本发明中，所述中草药包括连翘、金银花、炒苦杏仁、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、红景天和甘草中的任意一种或几种。

本发明中，所述中草药副产物包括中药制剂在加工过程中提取、煎煮产生的药渣，和/或中草药的非药用部位。

本发明中草药为中医常用中草药，日常用量大，中草药相关副产物生成量大。中草药主要为植物源药材，将中药材中有效成分提取利用后，剩余的副产物中仍具有未被充分提取利用的药效成分，进一步加工处理后，可作为商品饲料的添加剂使用，以促进动物生长。

本发明中，所述发酵温度为40-50℃。

本发明中，所述红外测温为将发酵中草药的样品发酵袋取出冷却10-30min，优选冷却20min后，使用连接红外热成像设备的仪器拍照测温。作为一种可实施的方式，本发明红外热成像设备为CompactPro,SeeThermal,USA。

本发明中，所述发酵中草药内部的温度每隔1-2天利用红外测温技术检测一次。

本发明中，所述发酵中草药为添加质量百分比5.0％的生物酶复合物，于50℃发酵时，总糖预测模型为y＝7.648x+60.643，R

如无特殊说明，本发明涉及的试剂均为市售产品，均可以通过稳定的商业渠道获得。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将连翘、金银花、炒苦杏仁、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、红景天和甘草加工过程中提取、煎煮产生的药渣和中草药的非药用部位，于45℃干燥8h；

将干燥后的中草药副产物粉碎过4目筛，与水按10:8的质量比混合，添加质量百分比为5.0％的生物酶复合物，于50℃进行发酵处理；

其中，生物酶复合物由纤维素酶、木聚糖酶和蛋白酶按1:1:1的重量比例组成；生物酶复合物中纤维素酶为6万U/g，木聚糖酶为6万U/g，蛋白酶为6万U/g；

每隔1-2天利用红外测温技术检测一次发酵中草药内部的温度；测定温度时，将样品发酵袋取出，冷却30分钟后用接连红外热成像设备(Compact Pro,SeeThermal,USA)的手机拍照；

分别于发酵的第1d、第4d和第7d，利用红外测温技术检测发酵中草药内部的温度，同时检测发酵中草药的总糖和还原糖含量；以发酵中草药内部温度为横坐标x，以发酵中草药的总糖和还原糖含量分别为纵坐标y，构建发酵中草药中总糖和还原糖含量的线性预测模型。

实施例2

将连翘、金银花、炒苦杏仁、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、红景天和甘草加工过程中提取、煎煮产生的药渣和中草药的非药用部位，于45℃干燥8h；

将干燥后的中草药副产物粉碎过4目筛，与水按10:8的质量比混合，添加质量百分比为0.5％的生物酶复合物，于50℃进行发酵处理；

其中，生物酶复合物由纤维素酶、木聚糖酶和蛋白酶按1:1:1的重量比例组成；生物酶复合物中纤维素酶为6万U/g，木聚糖酶为6万U/g，蛋白酶为6万U/g；

每隔1-2天利用红外测温技术检测一次发酵中草药内部的温度；测定温度时，将样品发酵袋取出，冷却30分钟后用接连红外热成像设备(Compact Pro,SeeThermal,USA)的手机拍照；

分别于发酵的第1d、第4d和第7d，利用红外测温技术检测发酵中草药内部的温度，同时检测发酵中草药的总糖和还原糖含量；以发酵中草药内部温度为横坐标x，以发酵中草药的总糖和还原糖含量分别为纵坐标y，构建发酵中草药中总糖和还原糖含量的线性预测模型。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于，于40℃进行发酵。

实施例4

本实施例与实施例2的区别在于，于40℃进行发酵。

实施例5

将连翘、金银花、炒苦杏仁、板蓝根加工过程中提取、煎煮产生的药渣，于45℃干燥10h；

将干燥后的中草药副产物粉碎过5目筛，与水按10:12的质量比混合，添加质量百分比为3.5％的生物酶复合物，于45℃进行发酵处理；

其中，生物酶复合物由纤维素酶、木聚糖酶和蛋白酶按1:1:1的重量比例组成；生物酶复合物中纤维素酶为6万U/g，木聚糖酶为6万U/g，蛋白酶为6万U/g；

每隔1-2天利用红外测温技术检测一次发酵中草药内部的温度；测定温度时，将样品发酵袋取出，冷却30分钟后用接连红外热成像设备(Compact Pro,SeeThermal,USA)的手机拍照；

分别于发酵的第1d、第4d和第7d，利用红外测温技术检测发酵中草药内部的温度，同时检测发酵中草药的总糖和还原糖含量；以发酵中草药内部温度为横坐标x，以发酵中草药的总糖和还原糖含量分别为纵坐标y，构建发酵中草药中总糖和还原糖含量的线性预测模型。

对比例1

将连翘、金银花、炒苦杏仁、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、红景天和甘草加工过程中提取、煎煮产生的药渣和中草药的非药用部位，于45℃干燥8h；

将干燥后的中草药副产物粉碎过4目筛，与水按10:8的质量比混合，添加质量百分比为3.5％的黑曲霉，于30℃进行发酵处理；其中，黑曲霉菌的有效活菌数为10

每隔1-2天，利用红外测温技术检测发酵中草药内部的温度；测定温度时，将样品发酵袋取出，冷却30分钟后用接连红外热成像设备(CompactPro,SeeThermal,USA)的手机拍照。

对比例2

将连翘、金银花、炒苦杏仁、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、红景天和甘草加工过程中提取、煎煮产生的药渣和中草药的非药用部位，于45℃干燥8h；

将干燥后的中草药副产物粉碎过4目筛，与水按10:8的质量比混合，添加质量百分比为3.5％的枯草芽孢杆菌，于30℃进行发酵处理；其中，枯草芽孢杆菌的有效活菌数为10

每隔1-2天，利用红外测温技术检测发酵中草药内部的温度；测定温度时，将样品发酵袋取出，冷却30分钟后用接连红外热成像设备(CompactPro,SeeThermal,USA)的手机拍照。

对比例3

将连翘、金银花、炒苦杏仁、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、红景天和甘草加工过程中提取、煎煮产生的药渣和中草药的非药用部位，于45℃干燥8h；

将干燥后的中草药副产物粉碎过4目筛，与水按10:8的质量比混合，添加质量百分比为3.5％的枯草芽孢杆菌，于40℃进行发酵处理；其中，枯草芽孢杆菌的有效活菌数为10

每隔1-2天，利用红外测温技术检测发酵中草药内部的温度；测定温度时，将样品发酵袋取出，冷却30分钟后用接连红外热成像设备(CompactPro,SeeThermal,USA)的手机拍照。

实施例6

本实施例对比了不同中草药发酵处理条件下，发酵中草药样品内部温度变化

分别于发酵第0d、第1d、第2d和第4d测定实施例1-4，以及对比例1-3发酵中草药内部温度，结果如图1所示。

在30℃发酵条件下，使用黑曲霉和枯草芽孢杆菌在发酵中草药的第二天温度显示最高，两者整体上温度差异不大。在芽孢杆菌发酵处理时，发酵的第1、2、4天，40℃发酵中草药的显示温度要明显高于30℃发酵中草药显示的温度。在芽孢杆菌和生物酶复合物的比较中，在40℃条件下，样品中两种处理方式的温度差异不大。生物酶复合物在相同温度不同添加量条件下，发酵样品中温度差异不大。整体上，相对于黑曲霉发酵中草药的处理方式，枯草芽孢杆菌和酶制剂在相对高温条件下发酵的中草药样品，其内部温度越高。

实施例7

本实施例对比了不同中草药发酵处理条件下，发酵中草药样品活菌数、粗纤维、总糖和还原糖变化

分别于发酵第1d、第2d和第4天，采集实施例1-4，以及对比例1-3的样品，并分析样品中活菌数、粗纤维、总糖和还原糖含量，结果如图1所示。

(1)活菌数检测

将1g样品加入到9mL灭菌蒸馏水中，充分混匀后，按照10倍比例对样品进行稀释，用LB琼脂培养基在30℃条件下培养24小时，测定活菌数。

(2)粗纤维检测

配制0.13mol/L的硫酸溶液、0.23mol/L的氢氧化钾溶液、0.5mol/L的盐酸溶液。将样品粉碎过筛至10-40目。将过筛的样品，放入玻璃或者金属器皿，放入鼓风干燥箱，在105℃的环境下烘干4个小时，将烘干后的样品放入干燥皿中，放凉至少30分钟。秤取1g样品，标记滤袋，将装入样品的滤袋封口后放入丙酮浸泡去除样品中的脂肪。再次向玻璃烧杯中倒入足量的0.5mol/L的盐酸溶液，在通风橱中放置20分钟，倒掉盐酸溶液后静置10分钟。按照纤维测定仪标准程序，对发酵中草药样品进行酸碱消煮。取出样品，用丙酮、盐酸溶液依次浸泡后，将所有滤袋均匀的放入鼓风干燥箱中，105℃烘干小时，放凉30分钟后，将滤袋放入坩埚中，然后将坩埚放入马弗炉中，550℃灰化4小时，放凉，称重计算。

(3)总糖检测

称取1g样品置于100mL锥形瓶中，加入10mL盐酸(6mol/L)溶液和15mL蒸馏水，于100℃水浴锅中消煮30min，边煮边搅拌，取出锥形瓶，待液体冷却后，用6mol/L的NaOH溶液调节pH至7.4左右，再将液体定容至100mL，4000rpm、10min离心，取10mL上清液定容至100mL。取1ml总糖提取液，加入2mLDNS溶液，置于100℃水浴锅中煮沸10min，冷却后加入9mL蒸馏水，混匀，取200uL溶液与96孔板，540nm测定吸光值，计算分析。

(4)还原糖检测

称取1g样品置于100mL锥形瓶中，加入15mL蒸馏水，于50℃水浴锅中消煮30min，边煮边搅拌，取出锥形瓶，待液体冷却后，4000rpm、10min离心，取上清液，再将20mL蒸馏水倒入离心管离心，取上清液，将两次的上清液混合，定容至100mL。取1ml总糖提取液，加入2mLDNS溶液，置于100℃水浴锅中煮沸10min，冷却后加入9mL蒸馏水，混匀，取200uL溶液与96孔板，540nm测定吸光值，计算分析。

结果显示，对比例1中，使用黑曲霉于30℃条件下发酵中草药时，微生物菌数维持在10

实施例8

本实施例对比了不同中草药发酵处理条件下，发酵中草药样品的红外测温与活菌数、粗纤维、总糖和还原糖的相关性

分别于发酵第1天、第2天和第4天测定实施例1-4，以及对比例1-3发酵中草药内部温度，并同时测定发酵中草药中的活菌数(Viablecellnumber,CFU)、粗纤维(Crudefiber,CF)、总糖(Totalsugars,TS)和还原糖(Reducing sugars,RS)含量，分析发酵中草药样品的红外测温与活菌数、粗纤维、总糖和还原糖的相关性，结果如图3所示。

结果表明，热成像作为一种反应发酵中草药内部温度的测量手段，在中草药不同处理方式下，测量温度与其它结果表现出的相关性不同。对比例1中，使用黑曲霉在30℃发酵条件下(An30℃)，测量温度与CFU、CF、TS和RS呈现出负相关，其中与粗纤维呈现出显著负相关。同样在30℃发酵条件下(Bs30℃)，对比例2中，使用枯草芽孢杆菌发酵样品中测量温度与CF呈现正相关，与TS呈现出负相关。

实施例1-4中，使用生物酶复合物在相同温度不同添加剂量条件下，测量温度与TS呈现出正相关；在不同温度相同添加剂量条件下，测量温度也与TS呈现出正相关；其中实施例1中添加5.0％生物复合酶，于50℃发酵条件下，测量温度和RS呈现出显著负相关。

整体上，发酵中草药样品的测量温度与不同发酵指标之间的相关性分析，因处理方式、发酵温度、添加比例的不同呈现出不同的趋势。但在与使用生物酶复合物发酵处理方式的关系上，测量温度与发酵样品中的还原糖呈现出负相关。一般情况下，样品中热成像温度越高，表明生物反应越剧烈，对于粗纤维降解的越充分，产生的总糖和还原糖越多，而还原糖的增加促进微生物的生长导致活菌数增加，还原糖含量降低。本发明基于其在酶解处理下温度与总糖含量呈现的正向关系以及与还原糖含量呈现的负向关系，红外测温可以用来辅助衡量酶解条件下发酵中草药样品中多糖和还原糖的含量。

实施例9

本实施例为实施例1和实施例2构建的发酵中草药中总糖和还原糖含量的线性预测模型，结果如图4所示。

如图4A和4B所示，实施例2中在50℃，添加0.5％生物酶复合物发酵中草药处理条件下，利用红外测温预测发酵产物中总糖和还原糖的含量，其中对总糖的预测R

如图4C和4D所示，实施例1中在50℃，添加5.0％生物酶复合物发酵中草药处理条件下，利用红外测温对发酵产物中总糖和还原糖的含量都具有较好的预测效果，其中与总糖含量y呈现正向线性关系，预测模型为y＝7.648x+60.643，R

可见，在使用生物酶复合物发酵中草药时，在酶解充分条件下，发酵温度可以很好预测发酵产物中总糖和还原糖的含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。