一种肿瘤相关多肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肿瘤相关多肽及其制备方法和应用。

背景技术

卵巢癌是卵巢肿瘤的一种恶性肿瘤，是指生长在卵巢上的恶性肿瘤，其中90％～95％为卵巢原发性的癌，另外5％～10％为其它部位原发的癌转移到卵巢。由于卵巢癌早期缺少症状，即使有症状也不特异，筛查的作用又有限，因此早期诊断比较困难，就诊时60％～70％已为晚期，而晚期病例又疗效不佳。因此，虽然卵巢癌的发病率低于宫颈癌和子宫内膜癌居妇科恶性肿瘤的第三位，但死亡率却超过宫颈癌及子宫内膜癌之和，高居妇科癌症首位，是严重威胁妇女健康的最大疾患。

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是最常见的卵巢癌组织学类型，占卵巢肿瘤的50％-70％。其发病具有隐蔽性，缺乏有效的早期筛查方法，76％的病人在发现时已有腹腔内种植，肝实质和/或胸腔、颅内转移(III、IV期)。

Sema家族参与肿瘤细胞增殖、迁移和血管新生，且在肿瘤侵袭及转移中起重要作用。Sema3A是Sema3家族中最典型和最先被确定的神经导向因子，其基因被认为是候选的抑癌基因(TAMAGNONE L.Emerging role of semaphorins as major regulatory signalsand potential therapeutic targets in cancer[J].Cancer Cell,2012,22(2):145-152)。研究发现(JIANG H,QI L,WANG F,et al.Decreased semaphorin 3A expression isassociated with a poor prognosis in patients with epithelial ovariancarcinoma[J].Int J Mol Med,2015,35(5):1374-1380.)，低水平的Sema3A与EOC患者的不良预后有关，提示Sema3A可能参与EOC的发生、发展。王晓琴等研究证明(王晓琴，等Sema3A通过调控上皮-间质转化/基质金属蛋白酶-2参与上皮性卵巢癌转移。)，Sema3A通过调控EMT/MMP-2途径参与EOC转移，其可以作为预测EOC转移和预后的生物学指标。

发明内容

本发明在现有研究的基础上，提供了一种肿瘤相关多肽，所述的多肽为来源于Sema3A蛋白，以及该多肽在EOC中的作用。

因此，本发明一方面提供了一种抑制人卵巢癌细胞的多肽，所述的多肽来源于Sema3A截短蛋白，所述的来源于Sema3A截短蛋白的多肽与穿膜肽偶联，形成穿膜肽-Sema3A截短蛋白多肽；所述的Sema3A截短蛋白多肽包括4条多肽，所述的4条多肽分别为Sema3A截短蛋白多肽10、Sema3A截短蛋白多肽16、Sema3A截短蛋白多肽20、Sema3A截短蛋白多肽26；所述的Sema3A截短蛋白多肽10、Sema3A截短蛋白多肽16、Sema3A截短蛋白多肽20、Sema3A截短蛋白多肽26的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.20和SEQ IDNO.26所示。

优选地，本发明所述的Sema3A截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示。

优选地，本发明所述的穿膜肽的氨基酸序列为YGRKKKRRQRRR。

优选地，本发明所述的穿膜肽的C端与多肽的N端偶联。

再一方面，本发明还提供了一种抑制人卵巢癌细胞的药物，所述的药物包括穿膜肽-Sema3A截短蛋白多肽中的任意一条或任意两条或任意三条或四条。

优选地，本发明所述的药物中多肽的总浓度为50μM。

再一方面，本发明还提供了一种所述的抑制人卵巢癌细胞的多肽在制备治疗上皮性卵巢癌药物中的应用。

本发明在Sema3A蛋白的基础上，筛选了4条肿瘤相关多肽。所述的多肽与穿膜肽偶联后，对人卵巢癌细胞具有良好的抑制作用。因此，本发明的多肽为后续上皮性卵巢癌的多肽治疗提供了良好的参考和指导作用，具有重要的意义。

另外，多肽药物相比化学药和蛋白质药物具有更高效、更安全、更具有耐受性，同时也具有更高选择性、不易在体内蓄积的优点，是未来肿瘤治疗药物研究的重要方向之一。如表1所示。

表1化学药物、多肽药物、蛋白质药物比较

附图说明

图1Sema3A蛋白信号肽预测结果。

图2Sema3A蛋白(N端去除20个氨基酸，C端去除45个氨基酸)剩余序列无序区预测结果。分值越高代表该位置为无序区的概率越大，0.5作为是否为无序区的分界线。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

现有研究证明，Sema3A蛋白在上皮性卵巢癌低表达，且研究发现，提高Sema3A蛋白的表达能显著性抑制EOC转移。因此，本发明在现有技术的基础上，对Sema3A蛋白进行研究和分析，设计Sema3A截短蛋白的多肽，并从中筛选能显著性抑制人卵巢癌细胞的多肽，为EOC转移的治疗提供参考。

实施例1：Sema3A截短蛋白多肽的设计

对Sema3A蛋白(Q14563·SEM3A_HUMAN)进行分析。首先对信号肽进行预测，结果显示(图1)，有信号肽的概率为98.0％,信号肽类型为SP(Sec/SPI)，切割位点为aa20-aa21，信号肽序列为MGWLTRIVCLFWGVLLTARA。

对Sema3A蛋白进行核定位信号肽预测。结果显示，有核定位信号肽的概率为90.9％，其在Sema3A蛋白中的位置为aa727-aa762，具体序列为KRDRKQRRQRPGHTPGNSNKWKHLQENKKGRNRRTH。

根据以上结果，将Sema3A蛋白的N端去除20个氨基酸(aa1-aa20，信号肽序列)、C端去除45个氨基酸(aa727-aa771，主要为核定位序列)，对剩余的氨基酸序列进行无序区预测。结果显示(图2)，约aa650～aa675无序区的概率较大，综合考虑，去除aa651-aa706的氨基酸，对剩余的650个氨基酸序列(命名为Sema3A截短蛋白，具体的氨基酸序列如SEQ IDNO.29所示)进行多肽设计。共设计合成了28条Sema3A截短蛋白多肽，具体序列见表2所示。

在表2中Sema3A截短蛋白多肽氨基酸序列的基础上，引入穿膜肽(序列为YGRKKKRRQRRR)，将穿膜肽与表2的Sema3A截短蛋白多肽连接起来(穿膜肽C端与多肽的N端偶联)，形成“穿膜肽-Sema3A截短蛋白多肽”。以人工合成多肽的方式制备。

表2 Sema3A截短蛋白多肽序列

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Sema3A截短蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO.29)：

NYQNGKNNVPRLKLSYKEMLESNNVITFNGLANSSSYHTFLLDEERSRLYVGAKDHIFSFDLVNIKDFQKIVWPVSYTRRDECKWAGKDILKECANFIKVLKAYNQTHLYACGTGAFHPICTYIEIGHHPEDNIFKLENSHFENGRGKSPYDPKLLTASLLIDGELYSGTAADFMGRDFAIFRTLGHHHPIRTEQHDSRWLNDPKFISAHLISESDNPEDDKVYFFFRENAIDGEHSGKATHARIGQICKNDFGGHRSLVNKWTTFLKARLICSVPGPNGIDTHFDELQDVFLMNFKDPKNPVVYGVFTTSSNIFKGSAVCMYSMSDVRRVFLGPYAHRDGPNYQWVPYQGRVPYPRPGTCPSKTFGGFDSTKDLPDDVITFARSHPAMYNPVFPMNNRPIVIKTDVNYQFTQIVVDRVDAEDGQYDVMFIGTDVGTVLKVVSIPKETWYDLEEVLLEEMTVFREPTAISAMELSTKQQQLYIGSTAGVAQLPLHRCDIYGKACAECCLARDPYCAWDGSACSRYFPTAKRRTRRQDIRNGDPLTHCSDLHHDNHHGHSPEERIIYGVENSSTFLECSPKSQRALVYWQFQRRNEERKEEIRVDDHIIRTDQGLLLRSLQQKDSGNYLCHAVEHGFIQTLLKVTLEVIDT。

实施例2：Sema3A截短蛋白多肽的筛选

将穿膜肽-Sema3A截短蛋白多肽接入人卵巢癌细胞系(SKOV3、HO-8910PM、HO-8910LM、OVCA429和OVCA420，来源于ATCC细胞库)中，进行肿瘤抑制试验(MTT试验)。

1分别取对数生长期的人卵巢癌细胞(SKOV3、HO-8910PM、HO-8910LM、OVCA429和OVCA420)，37℃用0.25％胰蛋白酶消化细胞，以每孔5000个细胞接种于96微孔板中，每孔体积200μl，37℃5％CO

2分别取穿膜肽-Sema3A截短蛋白多肽母液，加入800μl不含血清的RPMI1640培养基至1ml，使药物浓度均为50μM，每孔加入200μl，不加药组为阴性对照组，6μM紫衫醇为阳性对照组(每个药物浓度设5个复孔)200μl，37℃5％CO

3取出微孔板，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配)20μl，继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μlDMSO溶解MTT甲瓒沉淀，用微型震荡器低速振荡约10分钟，结晶完全溶解后用酶联免疫检测仪测570nm波长处的吸光度(A)值。

4按以下公式可计算肿瘤细胞生长抑制率：肿瘤细胞的生长抑制率(％)＝[(阴性对照组孔A值-实验组孔A值)/阴性对照组孔A值]×100％。检测结果见表3所示，Sema3A截短蛋白多肽10、16、20和26在5个细胞系中均具有较高的抑制率，而其他的多肽抑制率较差、或在有的细胞系抑制率高、有的较低。

表3各多肽在人卵巢癌细胞抑制试验结果

实施例3：Sema3A截短蛋白多肽的联合治疗

对实施例2中筛选的4条多肽(Sema3A截短蛋白多肽10、16、20和26)进行不同的排列组合(每种组合中的总药物浓度均为50μM，组合中不同药物用量均为等比例平分)，对5种人卵巢癌细胞，具体MTT试验方法见实施例2所示。结果显示(表4)，联合治疗比单个治疗的效果要好，且多肽种类越多，效果越好。

表4不同组合多肽在人卵巢癌细胞抑制试验结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。