一种好氧高效脱氮复配菌群及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种好氧高效脱氮复配菌群及其应用。

背景技术

随着工业、农业和生活水平的发展，越来越多的氮被排放到天然水体中。过量的氮释放到水中会导致富营养化并影响生态平衡，如何削减水体中的氮素污染成为水环境领域亟待解决的问题。

废水中氨氮的去除主要包括氨氧化工艺和反硝化工艺。传统废水处理工艺的氨氧化工艺主要依靠自养硝化细菌。然而，自养硝化细菌生长缓慢且对环境敏感，传统工艺中的反硝化微生物只能在以下条件下进行反硝化厌氧条件，它们在脱氮处理中的应用存在局限性。与自养硝化细菌和厌氧反硝化细菌相比，异养硝化和好氧反硝化微生物可以在好氧条件下同时完成硝化和反硝化。当向异养硝化好氧反硝化微生物提供足够的有机碳源时，它们可以快速生长并形成有效的硝化和反硝化能力。目前，随着越来越多的异养硝化好氧反硝化微生物在不同环境中被发现，但部分菌株具备的脱氮途径不完全，或在脱氮反应过程中积累亚硝氮，而亚硝氮对于微生物来说是一种毒性物质，高浓度的亚硝态氮会对反硝化细菌的生长和反应起到抑制作用。将异养硝化好氧反硝化过程分配给多种脱氮细菌，能够减少脱氮过程中有毒中间代谢产物的积累，进而实现污水中多种形式的氮素高效去除。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了好氧脱氮菌群及其应用，该脱氮菌群包括保藏编号CCTCCNO:M2022731的硫氧化丛毛单胞菌ZM19和CCTCCNO:M2022732的亚洲假单胞菌ZM20，对乳制品厂废水和生活废水中的氮具有高效的脱除效果。

本发明提供保藏编号为CCTCCNO:M2022731的硫氧化丛毛单胞菌ComamonasthiooxydansZM19。所述硫氧化丛毛单胞菌Comamonas thiooxydansZM19的16SrRNA有效序列长度为1,432bp，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，GenBank登录号为ON668216；菌株ZM19基因组大小为5,582,591bp，GC含量为61.28mol％，BioProject登录号为：PRJNA845089；菌株ZM19的形态特征如下：白色点状，菌落直径较小，表面光滑，隆起，不透明，边缘完整。

本发明还提供了保藏编号为CCTCCNO:M2022732的亚洲假单胞菌PseudomonasasiaticaZM20。所述菌株ZM20的16SrRNA有效序列长度为1,435bp，其基因序列如SEQ ID NO.2所示，GenBank登录号为ON668215；菌株ZM20基因组大小为5,682,613bp，GC含量为62.63mol％，BioProject登录号为：PRJNA845090；菌株ZM20的形态特征如下：菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。

实验表明，菌株ZM19在48h内能够完全去除140mg/L的氨氮和140mg/L的亚硝氮，菌株ZM20在48h内能够去除57.41％140mg/L的氨氮和72.77％

140mg/L的硝氮。

本发明还提供一种脱氮复配菌群，包括保藏编号为CCTCCNO:M2022731的硫氧化丛毛单胞菌ZM19和保藏编号为CCTCCNO:M2022732的亚洲假单胞菌ZM20。

一些实施方案中，所述硫氧化丛毛单胞菌ZM19和亚洲假单胞菌ZM20的有效菌数量比为1:1。一些具体实施例中，所述硫氧化丛毛单胞菌ZM19和亚洲假单胞菌ZM20的有效菌数量比为1:1。

本发明将保藏号为CCTCCNO:M2022731的Comamonasthiooxydans ZM19和保藏号为CCTCCNO:M2022732的PseudomonasasiaticaZM20先在LB液体培养基中进行活化，培养至生长对数期后，将其以体积比1:1的比例，按照接种量4vol％接种于乳品厂废水和农村生活废水中，30℃200rpm进行摇瓶培养。该复配菌群对实际废水的脱氮效果较好，能够在反应12h后将乳制品厂废水中的氨氮完全去除，反应48h后将乳制品厂废水中的硝氮去除87.24±0.01％，反应24h后将农村生活废水中的氨氮完全去除。

本发明还提供了所述的硫氧化丛毛单胞菌ComamonasthiooxydansZM19、所述的亚洲假单胞菌PseudomonasasiaticaZM20或所述的脱氮复合菌在废水脱氮中的应用。

其中，所述氮包括氨氮、硝氮和亚硝氮中的至少一种。

所述废水包括乳制品厂废水和农村生活废水中的至少一种。

本发明提供的脱氮复配菌群能够有效地去除废水中多种氮源，具体表现为其能够将140mg/L的氨氮在反应48h后去除率98.86±0.25％，将140mg/L的亚硝氮去除100.00％，将140mg/L的硝氮去除83.98±0.44％；当三种氮源同时存在时，该复配菌群能够在30h内将140mg/L的氨氮完全去除，36h内将140mg/L的亚硝氮完全去除，36h内将140mg/L的硝氮去除82.00±0.01％。利用本发明所述的好氧脱氮复配菌群，对乳制品厂废水和农村生活废水进行处理后具有显著的脱氮效果。本发明所提供的复配菌群，能够弥补两株菌脱氮功能的不足，相互补充、促进，最终实现了在好氧条件下高效地同时脱除多种氮，且中间代谢产物积累较少，解决了传统废水处理中生物脱氮需要采取好氧硝化，缺氧反硝化分段处理的瓶颈问题。将氨氮、亚硝氮和硝氮在同一空间同时去除，节省了设备和投资运营的成本，具有较好的经济效益和环保效益。

附图说明

图1为菌株ZM19和菌株ZM20在LB培养基上的菌落形态；

A为菌株ZM19在LB固体培养基上的菌落形态；B为菌株ZM20在LB固体培养基上的菌落形态；

图2为菌株ZM19和菌株ZM20基于16SrRNA的系统发育树；

A为菌株ZM19基于16SrRNA的系统发育树；B为菌株ZM20基于16S rRNA的系统发育树；

图3为复配菌群分别以氨氮、亚硝氮和硝氮为唯一氮源的生长降解曲线图A为以氨氮为唯一氮源；B为以亚硝氮为唯一氮源；C为以硝氮为唯一氮源；

图4为复配菌群以氨氮、亚硝氮和硝氮为混合氮源的生长降解曲线图；

图5为复配菌群在不同C/N条件下分别对氨氮、亚硝氮和硝氮的去除；

A为以氨氮为唯一氮源；B为以亚硝氮为唯一氮源；C为以硝氮为唯一氮源；

图6为复配菌群对乳制品厂原水和农村生活废水的脱氮作用；A为对乳制品厂原水的脱氮作用；B为对农村生活废水的脱氮作用。

生物保藏说明

ComamonasthiooxydansZM19，于2022年5月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2022731。

PseudomonasasiaticaZM20，于2022年5月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2022732。

具体实施方式

本发明公开了一种好氧脱氮复配菌群及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明具体实施例中采用的培养基配方如下：

脱氮菌群富集培养基-1：(NH

脱氮菌群富集培养基-2：KNO

微量元素母液：FeCl

氨氮检测培养基：(NH

亚硝氮检测培养基：NaNO

硝氮检测培养基：KNO

LB液体培养基：胰蛋白胨10.00g/L，酵母提取物5.00g/L，NaCl10.00g/L，水1.00L。

LB固体培养基：胰蛋白胨10.00g/L，酵母提取物5.00g/L，NaCl10.00g/L，琼脂15.00g/L，水1.00L。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1脱氮细菌ComamonasthiooxydansZM19和Pseudomonas asiaticaZM20的分离

配制脱氮细菌富集培养基-1和脱氮细菌富集培养基-2。将采集于山东省潍坊市先达化工有限公司、江苏省淮安市联润化工有限公司和浙江省杭州市天子岭生活垃圾卫生填埋场的活性污泥分别取10.00mL接种于脱氮细菌富集培养基-1中，30℃200rpm培养7天。取培养液10.00mL，转接至脱氮细菌富集培养基-2中，30℃200rpm培养7天。富集培养完成后，取培养液稀释成10

将甘油管保存的脱氮菌株分别接种至LB培养基中进行活化。24h后，取活化的菌液1mL，使用无菌水进行洗菌3次。洗菌完毕后，将其以4％的接种量接种于氨氮检测培养基，30℃200rpm培养48h后，取1mL培养液在8000rpm条件下离心2min，取上清液测其氨氮浓度。结果表明，64株菌种有18株菌去除氨氮率高于70％。将去除氨氮率高于70％的菌株按照上述方法接种于亚硝氮检测培养基，30℃200rpm培养48h后，取1mL培养液在8000rpm条件下离心2min，取上清液测其亚硝氮浓度。结果表明，18株菌中有6株菌能够将140mg/L的亚硝氮完全去除，这6株中菌株ZM19去除氨氮的效率最高(能够去除100％的氨氮)。

将能够完全去除亚硝氮的6株菌，按照上述方法接种至硝氮检测培养基，30℃200rpm培养48h后，取1mL培养液在8,000rpm条件下离心2min，取上清液测其硝氮浓度。结果表明，6株菌种中有3株菌能够去除50％的硝氮，其中，菌株ZM20去除硝氮效率最高，反应48h后能够将140mg/L的硝氮去除72.77％。

通过以上结果可知，菌株ZM19去除氨氮的效率最高，菌株ZM20去除硝氮的效率最高且去除过程中没有亚硝氮的积累。

实例2：脱氮细菌的鉴定

1.菌株ZM19的鉴定

(1)形态学鉴定

将菌株ZM19接种至LB固体培养基，30℃培养24h后，观察其菌落形态。由菌落形态图可知，菌株ZM19在LB固体培养基上菌落形态为白色点状，菌落直径较小，表面光滑，隆起，不透明，边缘完整。

(2)分子生物学鉴定

使用

将菌株ZM19的基因组DNA送至北京诺禾致源生物科技有限公司进行IlluminaPE150二代测序，获得菌株ZM19全基因组框架图序列后，在EZBioCloud中的ANI Calculator和参比菌株Comamonas testosteroni NCTC10698

(3)全基因组信息及脱氮功能基因鉴定

菌株ZM19的全基因组基本信息如下表所示。

表1

使用RAST服务器(https://rast.nmpdr.org/)对菌株ZM19全基因组测序拼接后的序列进行脱氮功能基因注释。注释结果显示菌株ZM19具有NO

2.菌株ZM20的鉴定

(1)形态学鉴定

将菌株ZM20接种至LB固体培养基，30℃培养24h后，观察其菌落形态。由菌落形态图可知，菌株ZM20在LB固体培养基上菌落形态为菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。

(2)分子生物学鉴定

使用

表2

结果表明，菌株ZM20与Pseudomonas asiatica RYU5

(3)全基因组信息及脱氮功能基因鉴定

菌株ZM20的全基因组基本信息如下表所示。

表3

使用RAST服务器对菌株ZM20全基因组测序拼接后的序列进行脱氮功能基因注释。注释结果显示菌株ZM20具有NO

实例3：复配菌群对唯一氮源和混合氮源的去除

由于菌株ComamonasthiooxydansZM19能够高效去除氨氮，菌株PseudomonasasiaticaZM20能够高效去除硝氮，且去除过程中没有亚硝氮的积累，考虑将两种脱氮细菌以体积比1:1制成脱氮复配菌群，并对该复配菌群的脱氮过程进行进一步表征。

首先，先对复配菌群在48h后脱氮情况进行初步检测：将菌株ZM19和ZM20等体积接种至氨氮检测培养基中，30℃200rpm培养48h，测定其脱氨氮率。结果表明，菌群反应48h后氨氮浓度为0.20±0.35mg/L，去除率为98.86±0.25％。将菌株ZM19和ZM20等体积接种至亚硝氮检测培养基中，30℃200rpm培养48h，测定其脱亚硝氮率。结果表明，菌群反应48h后亚硝氮浓度为0.00mg/L，去除率为100.00％。将菌株ZM19和ZM20等体积接种至硝氮检测培养基中，30℃200rpm培养48h，测定其脱硝氮率。结果表明，菌群反应48h后硝氮浓度为22.42±0.62mg/L，去除率为83.98±0.44％，没有亚硝氮的积累。并且发现，菌群去除硝氮的效率相比两株菌单独作用要有所提高。

其次，检测复配菌群连续去除单一氮源情况：将菌株ZM19和ZM20等分别体积接种至氨氮检测培养基、亚硝氮检测培养基和硝氮检测培养基，调节初始OD

再检测复配菌群连续去除混合氮源情况：将菌株ZM19和ZM20等分别体积接种至混合氮源检测培养基，其中氨氮、亚硝氮和硝氮的浓度均为140mg/L，调节初始OD

实例4：C/N对复配菌群脱氮的影响

配制C/N比为5、10、15、20和25的氨氮检测培养基、亚硝氮检测培养基和硝氮检测培养基，按照前述方法将菌株ZM19和ZM20等体积接种至培养基中，30℃200rpm培养16h，取不同样本的上清液测定其氨氮、亚硝氮和硝氮浓度，结果如图5所示。从图5结果可知，复配菌群去除氨氮的最优C/N比范围为10-20，去除亚硝氮的最优C/N范围为10-15，去除硝氮的最优C/N范围为15-20。

实例5：复配菌群对实际废水的脱氮作用

取浙江省金华市一处乳制品厂废水和农村生活废水，分别测定其氨氮、亚硝氮和硝氮的浓度，结果如下表所示。

表4

将菌株ZM19和ZM20分别体积比1:1以4％的接种量接种至100mL乳制品厂废水和农村生活废水中，调节初始OD

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。