一种高产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌及提高L-丝氨酸生产的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌及提高L-丝氨酸生产的方法。

背景技术

L-丝氨酸是目前三十个最具潜力的化学和材料领域的骨架化合物，在化妆品、食品及医药领域具有广泛的应用，但一直缺乏较为经济、有效的工业化生产方法，国内80％以上L-丝氨酸是通过毛发酸水解提取，有国际企业采用酶法半合成技术，但仍存在转化率低、前体物甘氨酸昂贵等难题，导致L-丝氨酸价格居高不下。与酶法、酸水解法相比，微生物发酵法生产L-丝氨酸具备污染小，成本低等优势，但其发展一直相对滞后。实现微生物发酵法生产L-丝氨酸对完善我国氨基酸品种具有重要意义。然而这种生产方法由于受到菌株的限制，始终没有获得进一步的突破，这也使得L-丝氨酸成为瓶颈氨基酸。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是重要的氨基酸生产菌株，广泛应用于发酵法生产谷氨酸、赖氨酸和缬氨酸等。近几年国内外采用微生物发酵法生产L-丝氨酸的主要研究有：田丹丹等报道甲基营养型菌株假单胞菌WGP35利用甲醇产L-丝氨酸25g/L；杨慧等报道黄色短杆菌C-11利用糖产L-丝氨酸22.65g/L；中国专利CN201510570110.6公开了一种促进谷氨酸棒杆菌生长及产L-丝氨酸的方法，在谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33aΔSSA的培养过程中加入原儿茶酸，最终产量达到19.7511；中国专利CN201310389798.9公开了一株抗L-丝氨酸反馈抑制的谷氨酸棒杆菌SYPS-062的构建方法，其通过在谷氨酸棒杆菌SYPS-062的基因组水平改造其3-磷酸甘油酸脱氢酶编码基因serA获得，摇瓶发酵中，重组菌产量为21-26g/L，较出发菌株提高近2.4倍；中国专利CN202011001880.6公开了一种含有氨基脱氧分支酸合成酶突变体的谷氨酸棒杆菌，发酵生产L-丝氨酸的产量达到30.4g/L。但这无法满足L-丝氨酸的实际生产，L-丝氨酸的产量仍待进一步提升。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明通过实验室适应性进化提供了一种高产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌，发酵后产量达到33.7g/L，随后为了进一步提高L-丝氨酸的产量，将α-酮戊二酸添加到谷氨酸棒杆菌A36-pDser全合成培养基中进行摇瓶发酵培养，结果发现添加12mMα-酮戊二酸后谷氨酸棒杆菌A36-pDser的生物量变化不大，L-丝氨酸产量提高36.2％，提高了利用谷氨酸棒杆菌生产L-丝氨酸的效率，而是否添加α-酮戊二酸对出发菌株A36无显著影响。

本发明的第一个目的是提供一种高产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌，命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)A36-pDser，于2018年01月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15172。

本发明的第二个目的是提供上述高产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌在生产L-丝氨酸中的应用。

进一步地，以蔗糖为底物进行发酵生产。

进一步地，所述的发酵生产为将高产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌接种至种子培养基中进行培养获得种子液，再将种子液转接至发酵培养基中进行培养。

进一步地，按质量百分比计，所述种子培养基的组成为：蔗糖1-10％、脑心浸液1-10％、硫酸铵1-5％、硫酸镁0.01-0.1％、磷酸二氢盐0.01-0.1％、磷酸氢盐0.01-0.1％。

进一步地，按质量百分比计，所述发酵培养基的组成为：蔗糖5-15％、硫酸铵1-5％、碳酸钙1-5％、硫酸镁0.01-0.1％、硫酸铁0.001-0.01％、硫酸锰0.001-0.01％、磷酸氢盐0.1-0.5％、生物素50-70μg/L、维生素B1450-550μg/L。

本发明的第三个目的是提供一种提高谷氨酸棒杆菌生产L-丝氨酸的方法，包括向谷氨酸棒杆菌培养基中添加α-酮戊二酸的步骤。

进一步地，所述谷氨酸棒杆菌为上述高产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌。

进一步地，培养基中α-酮戊二酸的浓度为6-15mM，最优选为12mM。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

(1)本发明以A36为出发菌株，通过实验室适应性进化得到了一株能够利用蔗糖直接发酵生产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌A36-pDser，通过摇瓶发酵，L-丝氨酸的产量达到33.7g/L。

(2)本发明还提供了一种添加α-酮戊二酸(α-KG)提高谷氨酸棒杆菌生产L-丝氨酸的方法，结果表明添加适当量的α-酮戊二酸时，L-丝氨酸产量最高达到45.90g/L，相对于未添加前提高了36.2％，大大提高了利用谷氨酸棒杆菌A36-pDser生产L-丝氨酸的效率。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例说明如后。

生物材料保藏

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)A36-pDser，所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)A36-pDser已于2018年01月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15172，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1谷氨酸棒杆菌A36-pDser的获得

以A36作为出发菌株(保藏号：CGMCC No.15171)，通过添加不同浓度的蔗糖，将菌株进行实验室适应性进化(ALE)，然后通过荧光筛选以及摇瓶筛选获得菌株A36-pDser。

实施例2未添加α-酮戊二酸时谷氨酸棒杆菌A36-pDser生长及产L-丝氨酸的能力

1.菌种：以谷氨酸棒杆菌A36-pDser和出发菌A36进行L-丝氨酸的发酵生产。

2.种子培养基：蔗糖2％；BHI 3％；硫酸铵1.5％；MgSO

发酵培养基：蔗糖10％；(NH

3.谷氨酸棒杆菌发酵培养：利用接种环将菌株划线于种子培养基固体平板中，将平板置于30℃恒温培养箱中培养至长出单菌落，接种至20mL种子培养基中，30℃，120rpm培养至对数生长中期，按照5％接种量接种至25mL发酵培养基中，30℃，120rpm进行发酵培养。每组做3个重复。

4.生物量的检测：每12h取样，利用分光光度计测定生物量(OD

5.氨基酸浓度的检测：HPLC法测定发酵液中氨基酸浓度。

实验结果见表1，当不添加α-酮戊二酸，谷氨酸棒杆菌A36-pDser生长OD

表1未添加α-酮戊二酸时谷氨酸棒杆菌A36-pDser生长及产酸的能力

实施例3不同浓度α-酮戊二酸对谷氨酸棒杆菌生长及L-丝氨酸产量的影响

1.菌种及培养基与种子培养基实施例1相同，在发酵培养基中添加α-酮戊二酸的浓度为3mM、6mM、9mM、12mM、15mM；

2.谷氨酸棒杆菌发酵培养、生物量的检测及氨基酸浓度的检测：参照实施例1；

添加不同浓度α-酮戊二酸对谷氨酸棒杆菌A36-pDser生长及L-丝氨酸产量影响的相关实验结果见表2-6，结果表明添加12mMα-酮戊二酸效果最佳，谷氨酸棒杆菌A36-pDser生长OD

表2 3mMα-酮戊二酸对谷氨酸棒杆菌A36-pDser生长及产酸的影响

表3 6mMα-酮戊二酸对谷氨酸棒杆菌A36-pDser生长及产酸的影响

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表4 9mMα-酮戊二酸对谷氨酸棒杆菌A36-pDser生长及产酸的影响

表5 12mMα-酮戊二酸对谷氨酸棒杆菌A36-pDser生长及产酸的影响

表6 15mMα-酮戊二酸对谷氨酸棒杆菌A36-pDser生长及产酸的影响

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。