脆弱拟杆菌在防治癌症相关腹泻中的应用

技术领域

本发明涉及一种脆弱拟杆菌的应用，具体而言，涉及脆弱拟杆菌在防治癌症治疗相关性腹泻中的应用。

背景技术

癌症治疗相关性腹泻(cancer treatment-induced diarrhea,CTID)是肿瘤患者化疗引起的一种常见消化道毒副反应。CTID不仅会降低患者的生活质量，还会导致水电紊乱、脱水、感染，严重可致休克、死亡。CTID主要是一种分泌性腹泻(Rutledge DN,EngelkingC.Cancer-related diarrhea:selected findings of a national survey of oncologynurse experiences[J].Oncol Nurs Forum，1998，25(5):861-73)，通常发生在化疗或靶向药物输注后24到96小时内。

CTID的病理生理学是复杂的，目前认为在CTID发生过程中占主导性地位的是肿瘤治疗相关性黏膜炎。肿瘤治疗相关性黏膜炎导致肠道菌群失调，肠黏膜屏障损坏(肠道黏膜层破坏和肠上皮脱落)，破坏微绒毛细胞的重吸收功能，引起腹泻。能够引发CTID的药物包括以下类型：氟嘧啶(例如，5-氟尿嘧啶和高活性的化合物卡培他滨)、拓扑异构酶抑制剂(如伊立替康，拓扑替康)和其他类型(例如奥沙利铂、紫杉醇、顺铂、阿糖胞苷)，其中伊替立康(CPT-11)和5-氟尿嘧啶(5-FU)最为常见；此外，在新兴的靶向小分子药物中，也存在类似的症状。以表皮生长因子受体(EGFR)靶向抑制剂(吉非替尼、阿法替尼等)为例，从皮疹到黏膜炎都是其副作用。根据药物的不同，肠黏膜屏障功能受损的时间也有所不同。

CTID以对症治疗为主，常规治疗CTID的药物包括非特异性的吗啡类止痛剂，阿片类受体抑制剂洛哌丁胺、生长抑素类似物奥曲肽和其他止泻剂，如蒙脱石散；其中，洛哌丁胺为一线用药，奥曲肽为CTID评分3级以上患者的一线用药。然而，洛哌丁胺和奥曲肽均有明显的副作用。洛哌丁胺的副作用包括严重的便秘，腹痛，头晕，皮疹以及已经存在的腹胀，恶心和呕吐的恶化等，奥曲肽的副作用有缓慢和/或不均匀的心跳，严重的便秘，胃痛，甲状腺肿大，呕吐，恶心，头痛和头晕等。而蒙脱石散对严重的腹泻作用甚微。

共生细菌在肠道稳态中起着重要作用，并对肠道完整性具有一定的保护作用。因此，采用益生菌治疗CTID成为近年来研究的热点。益生菌是通过定植在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。目前常用于治疗CTID的益生菌制剂为整肠生(双歧杆菌三联胶囊)、思连康(双歧杆菌四联片)及它们与其他益生菌制剂，如整肠生(地衣芽胞杆菌)联合使用。

针对上述问题，副益生菌(Paraprobiotic)应运而生。副益生菌被定义为“无活力的微生物细胞，如果口服或局部使用足够的数量，即可为使用者带来好处”。该定义包括形态不完整的微生物细胞和形态完整的微生物细胞，主流研究观点认为，破碎的微生物细胞能够更好地释放功能分子，因此具有更好的效果；但对于完整的灭活微生物细胞，没有统一的观点能够说明其在某些应用中优于活菌的原因。目前针对副益生菌的研究集中在乳杆菌、双歧杆菌等一代益生菌上，研究方向相对固定；因此，有必要开发新型副益生菌，扩展副益生菌的适应症范围。

脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis，B.fragilis)是人类肠道中的常见共生菌，分为产肠毒素脆弱拟杆菌(ETBF)和非产肠毒素脆弱拟杆菌(NTBF)。

NTBF可在小鼠体内定植，由于能够调控T细胞扩张和产生阻碍致病性Th17细胞发育的细胞因子IL-10，具有抗炎作用，被认为是一种益生菌。已有多项研究表明NTBF能够分泌抑炎细胞因子IL-10，促进Th1/Th2细胞的平衡，能够抵抗肠道炎症，对DSS诱导的结肠炎具有治疗作用。

由上述可知，NTBF在减轻消化道炎症中的疗效已经得到证实，这为它作为二代益生菌，扩展消化道相关适应症打下了良好的基础。基于此，将它开发成为针对消化道适应症的副益生菌也具有应用价值。

但目前国际上针对功能性脆弱拟杆菌的研究主要局限于美国人群来源的模式株NCTC 9343。

发明内容

针对上述问题，本发明所提供了脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)在防治癌症治疗相关性腹泻中的应用。

为了更好地解决上述问题，脆弱拟杆菌选自保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。

本发明还进一步提供了脆弱拟杆菌在制备预防和/或治疗化疗或靶向药物副作用的组合物中的应用。

优选的，所述化疗药物选自细胞毒类化疗药物、紫杉烷类、铂类、氟尿嘧啶类、喜树碱类中的一种或多种；和/或，所述靶向药物选自Anti-EGFR、Anti-HER-2、Anti-BRAF、Anti-MEK、Anti-EML4/ALK、Anti-VEGF、Multi-targeted TKI、Anti-mTOR、Anti-CDK4/6、Anti-PARP的一种或多种。

优选的，所述化疗选自多西他赛、奥沙利铂、顺铂、氟尿嘧啶、卡培他滨、伊立替康中的一种或多种；和/或，所述靶向药物选择阿法替尼、奥希替尼、奈拉替尼、维莫非尼、达拉非尼、考比替尼、曲美替尼、克唑替尼、阿帕西普、拉帕替尼、吡咯替尼、伊马替尼、帕唑帕尼、依维莫司、西罗莫司、帕博西尼、瑞博西尼、奥拉帕尼、芦卡帕尼中的一种或多种。

优选地，上述脆弱拟杆菌是灭活的、减毒的、低感染性或非感染性的，并且含有天然结构的细菌蛋白组分，能够有效降低T细胞表达耗竭分子从而增强T细胞免疫。所述脆弱拟杆菌是以下中的一种或多种：脆弱拟杆菌活菌体；经过灭活、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的脆弱拟杆菌；脆弱拟杆菌裂解物；和/或脆弱拟杆菌液体培养上清液。

优选的，所述灭活的脆弱拟杆菌为形态完整的灭活菌和/或形态不完整的灭活菌，优选为形态完整的灭活菌。

优选的，上述脆弱拟杆菌是通过干热、湿热、过滤、有机溶剂、化学试剂、紫外或红外射线、发酵、冻干、基因重组、基因修饰或改造的方法中的任意一种或多种灭活的。

优选的，通过冻干方法得到灭活菌粉。

上述的应用和/或用途中，组合物可以是药物组合物、食品、保健品或食品添加剂中的任意一种。

本发明还提供了一种脆弱拟杆菌制备防治癌症治疗相关性腹泻的药物组合物。其中，药物组合物含有保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。

优选地，通过冻干方法得到灭活菌。

上述的药物组合物，其中，药物组合物的剂型为丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、散剂、混悬剂、口服液或灌肠剂。

优选地，所述药物组合物通过口服或灌肠的形式给药。

上述的药物组合物，其中，所述药物组合物的给药周期为间歇给药、周期性给药、持续给药或长期给药。

为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于防治癌症治疗相关性腹泻的保健品组合物，其中，所述保健品组合物含有保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌。

本发明的技术效果在于，本发明通过大量试验证明，灭活脆弱拟杆菌，特别是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312灭活菌，不仅具有活菌粘附肠道上皮细胞，保护肠道上皮的作用；通过与Toll样受体(TLR)的相互作用及随后的NF-κB信号通路激活，减少TNF-α,、IL-1β、IFN-γ、IL-6等炎性细胞因子，减轻肠道炎症，恢复肠黏膜屏障功能的效果，还具有更好的耐胃酸、胆盐性质；安全性高、易储存、稳定性强等优点。

附图说明

图1为实施例1的脆弱拟杆菌ZY-312的菌落特征图；

图2为实施例1的脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色后的显微镜观察图；

图3为实施例2脆弱拟杆菌灭活细胞形态图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的结构原理和工作原理作具体的描述。应当理解的是，下文仅仅是为说明，只在实施例中描述了其中一少部分，然而不应将其理解为对本发明的限制。除非特殊说明，否则本发明中所使用的试剂都是市售可购买的。

实施例1.脆弱拟杆菌的发酵培养

将脆弱拟杆菌ZY-312菌种划线接种于血平皿，厌氧培养48h。观察菌落形态特征、染色特性、大小、球杆状和分布情况等。

菌落特征：脆弱拟杆菌ZY-312在血平皿上培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1-3mm之间，参见图1。

显微镜下形态：脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，呈现典型的杆状，两端钝圆而浓染，菌体中间不着色部分形如空泡，参见图2。

选取单个菌落接种于培养基中进行发酵培养8小时(温度为37℃)，所得菌液离心沉淀，转速3000r/min，离心15min，去上清，收集沉淀物，即得脆弱拟杆菌ZY-312菌泥。

实施例2.样品制备

1、脆弱拟杆菌活菌液、灭活菌液及裂解液的制备

1)将菌种划线接种于血平皿，37℃、厌氧培养48h。

菌落特征：脆弱拟杆菌ZY-312在血平皿上培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1-3mm，参见图1。。

2)增菌：从步骤1)中选取单个菌落接种于TSB(胰蛋白胨大豆肉汤，含5％胎牛血清)中进行增菌培养，所得菌液保存备用。

3)脆弱拟杆菌活菌液：将步骤1)制备的菌液，用麦氏比浊管做菌数测定，用生理盐水稀释至10

4)脆弱拟杆菌灭活菌液：采用高温或紫外照射的方法制备脆弱拟杆菌灭活菌液。具体步骤：分别取步骤2)制备的10

5)脆弱拟杆菌裂解液：通过超声破碎的方法制备脆弱拟杆菌裂解液。具体步骤：采用步骤2)制备的的脆弱拟杆菌活菌液5mL，经超声仪裂解30分钟，On 10秒，Off 10秒，该体系裂解菌体效率达到99％，裂解后经6000rpm、10min、4℃离心，0.22μm滤头过滤后备用。

2.脆弱拟杆菌灭活菌粉的制备

(1)取实施例1制得的脆弱拟杆菌发酵液对发酵液进行离心处理，收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:(10～30)(m:v)比例加入生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心收集洗涤后的菌体；

(2)对步骤(1)所得菌体加入5％麦芽糊精+0.9％氯化钠混合成的赋形剂，按菌体：赋形剂＝1:(5～15)(m:m)比例进行添加，搅拌分散后在(70～100)±5℃热灭活(20～40)±5分钟，得灭活菌液；

(3)将步骤(2)所得的灭活菌液离心收集灭活菌泥。

(4)在步骤(3)收集的灭活菌泥中加入赋形剂使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉，菌粉的菌数达到1×10

实施例3.脆弱拟杆菌菌粉对伊利替康所致小鼠腹泻影响

(1)试验方法

BALB/c小鼠88只，经过检疫期，根据体重随机分为A.正常组，B.模型组，C.ZY-312活菌液(10

腹泻记录及评分标准：每天记录每只试验鼠腹泻情况，腹泻的评分标准参照Kurita A等研究中的腹泻评分方法。0分：大便正常或没有；1分：轻度腹泻，大便可见轻微湿软；2分：中度腹泻，大便较湿且不成形，并且有轻度的肛周着色；3分：重度腹泻，水样便并伴有重度肛周着色。

表1ZY-312菌株对腹泻评分的影响

注：与模型组比较，*：P<0.05，**：P<0.01。

腹泻评分结果：与正常组比较，模型组5～8d腹泻评分显著增加(P<0.01)。实验5d，与模型组比较，样品4组的腹泻评分显著降低(P<0.05)。实验6～8d，与模型组比较，各药物组均能降低腹泻评分，但各药物组之间无显著差异，其中灭活菌液高剂量组显示相对较好的治疗的效果。

实施例4脆弱拟杆菌灭活菌粉对伊立替康所致小鼠迟发型腹泻模型的疗效

(1)试验方法

试验设计：选用BALB/c小鼠100只，雌雄各半，按动物性别和体重区间随机分为10组，即空白组、模型组、阳性1(整肠生500mg/kg)、阳性组2(易蒙停4mg/kg)、NCTC 9343/ZY-312灭活菌粉低剂量组(2×10

检测方法与频率：

摄食量：采用电子天平进行饲料添加和剩余量的称量操作，在给药前(D0)、D4分别记录加入量，分别在D4、D8、D11(试验结束)称剩余量1次，并记录，按公式计算：日平均摄食量(g)＝(加入量-剩余量)/动物数/天数。

腹泻记录及评分标准：每天记录每只试验鼠腹泻情况，腹泻的评分标准参照Kurita A等研究中的腹泻评分方法。0分：大便正常或没有；1分：轻度腹泻，大便可见轻微湿软；2分：中度腹泻，大便较湿且不成形，并且有轻度的肛周着色；3分：重度腹泻，水样便并伴有重度肛周着色。

肠道组织病理学检查：所有存活动物安乐死后取全部肠道，用10％甲醛溶液固定，制备病理组织切片，采用HE染色，在显微镜下进行肠道组织病理学检查。

数据统计与分析：对体重、摄食量、腹泻评分和病理学检查结果等数据以均数±标准差(Mean±SD)表示，使用SPSS统计软件25.0进行统计学分析。

(2)试验结果

1)摄食量：各组动物摄食量如下表。

表2各组动物的摄食量统计结果(均数±标准差，n＝10)

注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。

在D4(即造模前),空白组、模型组及各给药组动物的日均摄食量均无明显差异(p>0.05)；与空白组相比，在D8、D11即造模后，模型组雌雄动物的日均摄食量均显著下降(p<0.01)。D8时，各给药组与模型组摄食量差异不大。D11时，阳性组2摄食量相比模型组显著下降；阳性组1、NCTC 9343各组摄食量与模型组相似；ZY-312各剂量组摄食量高于模型组。

2)粪便湿重、含水量和腹泻评分：

各组动物粪便湿重和含水量如下表。

表3各组动物的粪便湿重和含水量统计结果(均数±标准差，n＝10)

注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05，**表示差异极显著p<0.01。

在粪便湿重及粪便含水量上，空白组没有明显差异。造模结束后，各造模组粪便湿重没有明显差异，但模型组粪便含水量相对空白组明显升高，但各给药组相对模型组粪便含水量呈下降趋势。其中，脆弱拟杆菌各组有效遏制了粪便含水量升高的趋势，但ZY-312组效果优于NCTC 9343组。

各组动物腹泻评分如下表。

表4各组动物的腹泻评分统计结果(均数±标准差，n＝5)

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注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。

模型组及各给药组动物在第4天(D7)开始出现腹泻，与空白组相比，试验期间的腹泻评分显著升高，且腹泻评分随时间增高，说明造模成功。

对于雄性动物而言，阳性组1、阳性组2及NCTC 9343各剂量组的腹泻评分也是呈上升趋势，但是均低于模型组。ZY-312各组显示出维持腹泻评分稳定的效果，显示出较优的降低腹泻评分上升的效果，且均低于NCTC 9343组。

对于雌性动物而言，上述药效基本相似，ZY-312各组效果自始优于阳性药和NCTC9343各组。

3)炎症因子

各组动物炎症因子如下表。

表5各组动物的炎症因子统计结果(均数±标准差)

/>

续表

注：n为动物数；与模型组比较，*表示差异显著p<0.05，**表示差异极显著p<0.01。

相对于空白组，模型组炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-6、IL-17、INF-γ及ICAM-1蛋白显著升高；抗炎因子IL-4、IL-10、IL-13显著下降。阳性药组对炎性因子水平具有下调作用，对抗炎因子水印具有上调作用。脆弱拟杆菌各组同样体现出对细胞因子的调节作用；其中，ZY-312的调节效果优于NCTC 9343。脆弱拟杆菌菌株组内没有明显的剂量差异性。

4)病理检查：选取空肠、回肠和结直肠组织，HE染色，进行病理学评价。结果如下表。

表6各组动物病理检查结果(均数±标准差)

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注：n为动物数；与模型组比较，*表示差异显著p<0.05，**表示差异极显著p<0.01。

空肠部位，相对于空白组，只有模型组出现了不明显的黏膜出血，且模型出现了明显的腺体扩张、肠黏膜损伤、炎细胞浸润、黏膜充血等病理学损伤；NCTC 9343各组菌粉在腺体扩张、肠黏膜损伤、炎细胞浸润方面体现了一定的治疗效果，而ZY-312各组体现出对腺体扩张、肠黏膜损伤、炎细胞浸润、黏膜充血各个病理损伤的治疗效果。

对于回肠部位，模型组出现了一定的黏膜出血，脆弱拟杆菌各组没有出现这种情况。阳性药组在剩余的腺体扩张、肠黏膜损伤、炎细胞浸润、黏膜充血方面，有明显的治疗效果；9343各组和ZY-312均显示出治疗效果，ZY-312各组的治疗效果优于NCTC 9343各组。

对于结直肠部位，各组均没有发生肠黏膜损伤。此外，模型组出现了腺体扩张、炎性细胞浸润、一定的黏膜充血和出血状况。NCTC 9343组表现出了遏制这种情况恶化的作用，ZY-312同样表现出治疗效果，且改善程度优于NCTC 9343组。在脆弱拟杆菌菌株组内，不存在明显的剂量差异性。

综上所述，脆弱拟杆菌灭活菌粉(ZY-312/NCTC 9343)能够治疗伊立替康所致的小鼠癌症治疗相关性腹泻，且ZY-312的治疗效果优于NCTC 9343。

实施例5.脆弱拟杆菌灭活菌粉对5-氟尿嘧啶(5-FU)所致小鼠癌症治疗相关性腹泻模型的疗效

(1)试验方法

试验设计：试验选用BALB/c小鼠100只，雌雄各半，按动物性别和体重区间随机分为10组，即空白组、模型组、阳性组1(整肠生500mg/kg)、阳性组2(易蒙停4mg/kg)、NCTC9343/ZY-312灭活菌粉低剂量组(2×10

检测方法与频率：

粪便含水量测定：分别在D8下午(造模结束)、D11下午采用单笼收集4h每只小鼠粪便并称湿重，然后放置80℃烘箱3h将粪便烘干后称干重并记录。按公式计算：粪便含水量(％)＝(粪便湿重－粪便干重)/粪便湿重×100。

腹泻记录及评分标准：每天记录每只试验鼠腹泻情况，腹泻的评分标准参照Kurita A等研究中的腹泻评分方法。0分：大便正常或没有；1分：轻度腹泻，大便可见轻微湿软；2分：中度腹泻，大便较湿且不成形，并且有轻度的肛周着色；3分：重度腹泻，水样便并伴有重度肛周着色。

血清样品收集与测定：存活动物在异氟烷麻醉后眼眶静脉丛采血约0.5mL。血液不抗凝，在室温静置30～50min，待血清析出后3000r/m离心15min，分离所有血清。用液相芯片试剂盒测定测定细胞因子IL-4、TNF-α。

数据统计与分析：对体重、摄食量、腹泻评分和病理学检查结果等数据以均数±标准差(Mean±SD)表示，使用SPSS统计软件25.0进行统计学分析。

(2)试验结果

1)摄食量：各组动物摄食量如下表。

表7各组动物摄食量统计结果(均数±标准差)

在造模前(D4)，各组小鼠摄食量没有明显差别。造模结束后(D8)，相对于空白组，各组小鼠摄食量均有所下降。至试验结束(D11)，与空白组相比，各组小鼠摄食量明显下降。D8时，模型组及阳性药组、NCTC 9343低中高剂量组摄食量相似，ZY-312低中高剂量组摄食量高于上述组；D11时，脆弱拟杆菌组小鼠的摄食量增加了，其中ZY-312各组增加的幅度大于NCTC 9343各组。脆弱拟杆菌菌株组内，没有明显的剂量差异性。

2)粪便含水量和腹泻评分：各组动物粪便含水量统计如下表。

表8各组动物粪便含水量检查结果(均数±标准差，n＝10)

注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。

从实验开始到试验结束，空白组小鼠粪便湿重和含水量没有明显差异。造模结束后，各组小鼠粪便湿重显著低于空白组小鼠，粪便含水量显著高于空白组小鼠。造模后模型组小鼠及各给药小鼠粪便湿重及粪便含水量相似。试验结束时，模型组小鼠粪便湿重自然恢复，但粪便含水量没有明显变化；阳性药1和阳性组2上调了小鼠的粪便湿重。相对于阳性药组，脆弱拟杆菌各组提高了粪便湿重，降低了粪便含水量。其中，ZY-312各组的效果优于NCTC9343各组；脆弱拟杆菌菌株组内，不存在明显的剂量依赖性。

腹泻评分：各组动物腹泻评分如下表。

表9各组动物腹泻评分(均数±标准差，n＝5)

注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。

对于雄性动物，模型组及各给药组动物在造模第4天后(D8)开始出现腹泻，且腹泻评分随试验时间呈增长趋势；与空白组相比，模型组及各受试物组动物在造模后(D8-12)的腹泻评分均显著升高(P<0.01或0.05)，说明造模成功。模型组在第12天，腹泻评分自然下降。

对于雄性动物而言，阳性组1和阳性组2均降低了腹泻评分。脆弱拟杆菌各组呈现相似的趋势，但ZY-312各组下调腹泻评分的速度较快，且幅度大于NCTC9343各组。各脆弱拟杆菌菌株组内，没有明显的剂量依赖性。

对于雌性动物而言，各给药组效果与雄性相似。

3)血清炎症因子：各组动物血清炎症因子评分如下表。

表10各组动物血清炎症因子评分(均数±标准差，n＝10)

续表

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注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。

相对于空白组，模型组炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-6、IL-17、INF-γ及ICAM-1蛋白显著升高；抗炎因子IL-4、IL-10、IL-13显著下降。说明阳性药组对炎性因子水平具有下调作用，对抗炎因子水平具有上调作用。脆弱拟杆菌各组同样体现出对细胞因子的调节作用；其中，ZY-312的调节效果优于NCTC9343。脆弱拟杆菌菌株组内没有明显的剂量差异性。

5)病理检查：选取空肠、回肠和结直肠组织，HE染色评价病理学损伤程度。

表11各组动物肠道病理学损伤程度评分(均数±标准差，n＝10)

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对于各肠道部位，相对于空白组，模型组出现了肠黏膜损伤、明显的腺体扩张、炎细胞浸润、黏膜充血等病理学损伤，阳性组1和阳性药2显示出了治疗作用。脆弱拟杆菌各组显示出了治疗效果，而ZY-312各组的效果优于9343各组。在脆弱拟杆菌菌株组内，不存在明显的剂量差异性。

脆弱拟杆菌灭活菌粉(ZY-312/NCTC 9343)能够治疗5-FU所致的小鼠癌症治疗相关性腹泻，且ZY-312的治疗效果优于NCTC 9343。

实施例6脆弱拟杆菌灭活菌粉对阿法替尼所致大鼠癌症治疗相关性腹泻模型的疗效

(1)试验方法

试验设计：选用雌性SD大鼠90只，按体重区间随机分为10组，即空白组、模型组、阳性组(易蒙停1.5mg/kg)、NCTC9343/ZY312灭活菌粉低剂量组(10

体重：采用电子天平每日称量动物体重并记录。

腹泻记录及评分标准：每天记录每只试验鼠腹泻情况，腹泻的评分标准如下：

肠道组织病理学检查：所有存活动物安乐死后取全部肠道，用10％甲醛溶液固定，制备病理组织切片，采用HE染色，在显微镜下进行肠道组织病理学检查。

数据统计与分析：对体重、摄食量、腹泻评分和病理学检查结果等数据以均数±标准差(Mean±SD)表示，使用SPSS统计软件25.0进行统计学分析。

(2)试验结果

1)体重：各组动物体重如下表。

表12各组动物体重(均数±标准差，n＝10)

注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。

试验开始前(D0)及造模前(D3)各组动物体重相似，且空白组、模型组及各给药组动物的体重以相似速度上升。自D3开始，模型组动物体重呈下降趋势，各给药组动物体重变化与模型组相似。其中模型组体重均值维持在220g，D13下滑至210g；阳性组体重均值与模型组相似，D13大幅下降，不足210g。NCTC9343各给药组自D6开始下滑，D9到D13均维持在210g上下；ZY-312各给药组体重变化不大，D6-13维持在220g上下。体重指标各给药组相差不大。

2)腹泻评分：各组动物腹泻评分如下表。

表13各组动物腹泻评分(均数±标准差，n＝10)

注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。

各组动物在造模后第2天(D4)开始出现腹泻，与空白组相比，模型组及各给药组试验期间的腹泻评分显著升高，且腹泻评分随时间增高。阳性药组及NCTC9343各组腹泻评分上升的趋势类似于模型组；ZY-312表现出维持腹泻评分稳定的能力。在D6腹泻评分即不明显地小于其他各组；低剂量和中剂量的遏制趋势保持到D13，且高剂量的腹泻评分在D13显著低于模型组；中剂量的遏制趋势维持至D11。因此，各给药组均呈现出遏制腹泻评分上升的能力，其中ZY-312效果优于阳性药组和NCTC 9343组。

3)肠道组织病理学检查：选取空肠、回肠和结直肠组织，评价黏膜充血和损伤程度。结果如下表。

表14各组动物病理检查结果(均数±标准差，n＝10)

肠道部位，相对于空白组，模型组出现了明显的腺体扩张和黏膜充血，各给药组对上述损伤有治疗效果，NCTC 9343的治疗效果类似于阳性药，ZY-312各组的效果优于NCTC9343组。

综上所述，脆弱拟杆菌灭活菌粉(ZY-312/NCTC 9343)能够治疗阿法替尼所致的大鼠体重降低、化疗性腹泻、肠黏膜损伤、黏膜充血、炎细胞浸润和腺体损伤，且ZY-312的治疗效果优于NCTC 9343。