用于检测子宫颈癌易感性的分子标记、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及妇科肿瘤学与分子遗传学领域，具体涉及一种用于检测子宫颈癌易感性的分子标记、试剂盒及应用。

背景技术

高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发生的必需条件，但仅是HPV感染又不足以引起宫颈癌。HPV人群感染率较高，但大多数感染是一过性的，且只有很小一部分HPV感染的女性会发展为宫颈癌。这表明宫颈癌是内因和外因复杂的相互作用的结果：外因即病毒及其致癌潜能的影响因素，内因则为与慢性感染和/或肿瘤发生倾向相关的宿主因素。研究发现，宫颈癌发生风险具有显著遗传易感性，这表明应当存在遗传易感因素。因此，遗传学研究可增强我们对宫颈癌发病机制的认识，同时为预防和治疗方法的发展提供新线索。

目前大多数关于遗传变异和宫颈癌易感性的关联研究均是以假设为基础，研究方向集中于参与免疫应答的基因(如人白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)以及影响DNA修复、细胞周期、细胞凋亡、异物代谢等过程的基因。全基因组关联分析(Genome-wideassociation studies，GWAS)已成功确定了一些既往认为不参与宫颈癌发展的遗传易感相关单碱基多态性(SNP)位点。近期还有几项后全基因组关联分析(Post genome-wideassociation studies，post-GWAS)，如基于通路的分析研究和相关基因位点的功能研究，虽然为宫颈癌发病机制研究提供了新思路。但是缺乏进一步的研究，并未能定位到基因上，而且不能很好的圈定宫颈癌的高危人群。

宫颈癌仍然是全球女性健康的一个重要威胁，而宫颈癌的早期诊断和早期治疗与病人的长期生存密切相关。所以，进一步理解遗传易感性对持续性HPV感染和肿瘤发生的贡献，并找到宫颈癌的遗传易感基因，对宫颈癌的早期防治有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种用于检测子宫颈癌易感性的分子标记、试剂盒及应用。

为实现上述目的，本发明所设计一种用于检测子宫颈癌易感性的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中，在该核苷酸序列的第79位存在单核苷酸多态性：G>A；即该序列的第79位的碱基包括碱基G或碱基A两种情况。

本发明还提供了一种上述的分子标记作为检测靶点在制备检测子宫颈癌易感性试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种获得上述分子标记的特异性引物对，其特征在于：所述特异性引物对为：

上游引物F：5’-gaagggctaccatctgtcttcc-‘3；

下游引物R：5’-ccagtctctaccgtgtcgatg-‘3。

本发明还提供了一种用于检测子宫颈癌易感性的试剂盒；所述试剂盒包括权利要求3所说的特异性引物对。

进一步地，所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括dNTP混合液、TaqDNA聚合酶和PCR缓冲液。

本发明的有益效果：

本发明从子宫颈癌和癌前病变聚集的家族中发现了DLGAP2基因的变异符合孟德尔遗传模式，并提供了可靠的功能验证证据，为子宫颈癌疾病的发病机理提供了新的认知。本发明通过检测DLGAP2基因的变异特点设计一种检测用于检测子宫颈癌易感性的试剂盒，该试剂盒通过聚合酶连反应(PCR)和Sanger测序，从而检测待测样品中DLGAP2基因的多态性特点，从而指导医护人员来识别子宫颈癌和癌前病变的易感人群，为实现子宫颈癌和子宫颈癌前病变的早期精准防治提供了有力的工具。本发明试剂盒成分简单，成本低廉且方法简单，便于推广。

附图说明

图1：子宫颈癌前病变和子宫颈癌聚集的家族的图谱。在家族中存在符合孟德尔遗传模式的DLGAP2基因突变。正方形代表男性，圆形代表女性。黑色填充的图形代表患者，白色填充的图形代表健康，灰色填充的图形代表其他肿瘤患者。打叉代表已去世。“+/-”代表携带杂合DLGAP2基因突变(基因型为GA杂合子),“-/-”代表不携带DLGAP2基因突变(基因型为GG纯合子)。

图2：DLGAP2基因在散发的子宫颈癌前病变和子宫颈癌病人的病灶组织中的表达量低于癌旁正常组织，存在组间显著统计学差异。数据来源于GEO数据库的GSE9705数据集。*，P值小于0.05。

图3：表达突变的DLGAP2蛋白可显著促进细胞的迁移能力，存在组间显著统计学差异。CON,正常对照的细胞株。WT,过表达未突变的DLGAP2蛋白的细胞株。MT，过表达突变的DLGAP2蛋白的细胞株。*，P值小于0.05。**，P值小于0.01。

图4：PCR的反应程序图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

实施例1

DLGAP2基因单核苷酸多态性检测和宫颈癌易感性的关联分析：

1.收集的样本：

选择3个及3个以上子宫颈癌前病变或子宫颈癌的病例的家族，招募其病例和未患病的成年女性(对照)，采集其外周静脉血，提取其DNA；

2.DNA提取与质检：

采用QIAGEN公司生产的DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit)提取外周静脉血DNA，具体操作流程参照试剂盒说明书。提取的DNA用琼脂糖凝胶电泳检验无降解；用Nanodrop2000检测OD 260/280介于1.8-2.0之间；用Qubit 2.0检测DNA浓度≥15ng/μL，总量≥1.5μg。

3.全基因组测序：

3.1使用TruSeq Library Construction Kit构建DNA文库；

3.2用超声将DNA样本随机打断成350bp的片段；

3.3对片段进行末端修复和磷酸化，加A尾，连接接头，变性，扩增；

3.4用Qubit 2.0对DNA文库进行定量检测，将文库稀释到1ng/μL。用Agilent 2100检测文库DNA片段的长度；

3.5用q-PCR确认文库的有效浓度。最后用Illumina Hiseq 2000平台进行测序。

4.数据处理：

使用BWA-MEM(v0.7.12，默认参数)将测序reads比对到人类参考基因组GRCh37(NCBI)；使用GATK(v3.6)进行SNV和INDEL检测，然后，使用ANNOVAR(version:2016Feb01)对变异进行功能注释。有多个患者聚集的家族，可能是由于某个基因发生罕见的功能性变异，导致这个家族中的携带者都有异常高的易感性。因此，我们挑选注释为missense、stopgain、stop loss、frameshift indels和splicing site的潜在功能性变异，在stop gain、stop loss、frameshift indels和splicing site的变异中过滤掉1000genomes,ExAC,gnomAD genomes,gnomAD exomes等数据库的亚洲人群中等位基因频率大于0.01的变异(即保留罕见变异)，在missense的变异中过滤掉1000genomes,ExAC,gnomAD genomes,gnomADexomes等数据库的亚洲人群中等位基因频率大于0.0001的变异(即保留罕见变异)，得到初步的罕见功能性变异集合。对初步的罕见功能性变异进一步剔除被Polyphen2、SIFT、Mutation Taster中任意一个平台预测为良性的变异，得到罕见功能性变异集合。

5.孟德尔遗传模型分析：

对家族中筛选符合显性或隐性遗传模型的罕见功能性变异，这些变异所影响的基因很可能就是潜在的易感基因。显性模型指的是所有病例或携带者都携带变异(纯合或杂合)，所有对照都不携带变异。隐性模型指的是所有病例或携带者都携带纯合变异，对照为不携带变异或携带杂合变异。

6.连锁分析：

使用MERLIN(v.1.1.2)软件对罕见功能性变异基于显性模型进行参数法连锁分析得到其LOD值。家族内LOD值越高的位点与疾病关联可能性越大。将LOD值≥0.9的变异与孟德尔显性模型分析得到的变异取交集，最终筛选出DLGAP2基因的变异(图1)。DLGAP2基因的变异具体为：核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的第79个碱基G>A转换：

gaagggctac catctgtctt ccttccctcc ttttgcagac acggacgttt taaacgttct

aacagcgtca cggccgccrt ccaagctgac ctggagctgg aggggttccc aggccacatc

accacggagg acaaaggcct tcagttcggc tcatccttcc agcggcactc cgagcccagc

acccccaccc agtacagcgc ggtgagaact gtacggaccc aggggctctt cagctataga

gaagactatc ggacccaagt ggacacctcc accctgcccc ctccagaccc ctggctggag

cccgccatcg acacggtaga gactgg

7.变异功能的验证：

使用GEO数据库GSE9750数据集进行DLGAP2基因的差异表达分析。GSE9750数据集包含33例散发的子宫颈癌或宫颈癌前病变组织和24例正常癌旁组织的转录组表达谱芯片数据。DLGAP2基因在散发的子宫颈癌前病变和子宫颈癌病人的病灶组织中的表达量低于癌旁正常组织，存在组间显著统计学差异(图2)，说明DLGAP2基因在宫颈癌中发挥抑癌基因的作用。使用慢病毒载体分别携带野生型DLGAP2、突变型DLGAP2的cDNA感染HaCaT和HeLa细胞系，构建相应的稳定的过表达细胞株。细胞划痕实验提示表达突变的DLGAP2蛋白可显著促进细胞的迁移能力(图3)，说明突变后的DLGAP2基因发挥癌基因的作用。可见DLGAP2基因变异可作为子宫颈癌前病变和子宫颈癌易感人群的标志。

实施例2

在NCBI数据库检索DLGAP2基因DNA序列(NC_000008.11),易感位点位于第940627位碱基，选取该位点上下游各500bp的序列作为PCR引物设计模板，在Primer-BLAST网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)根据网站说明进行引物设计，参数均为默认参数。选取其中PCR产物在300-400bp左右、特异性高无非特异产物的引物作为检测易感位点的引物。最终选取的引物对为：

上游引物F：5’-gaagggctaccatctgtcttcc-‘3；

下游引物R：5’-ccagtctctaccgtgtcgatg-‘3。

实施例3

用于检测子宫颈癌易感性的试剂盒；包括特异性引物对和特异性引物对，其中，所述PCR反应液包括dNTP混合液、Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液；特异性引物对为：

上游引物F：5’-gaagggctaccatctgtcttcc-‘3；

下游引物R：5’-ccagtctctaccgtgtcgatg-‘3。

用于检测子宫颈癌易感性的试剂盒的使用方法如下：

1.样本采集与基因组DNA提取

采集受试者2mL外周静脉血(EDTA抗凝)。采用QIAGEN公司生产的DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit)提取外周静脉血DNA，具体操作流程参照试剂盒说明书。提取的DNA用琼脂糖凝胶电泳检验无降解；用Nanodrop2000检测DNA浓度。

2.PCR扩增包含DLGAP2突变位点的目的片段

使用擎科生物公司生产的Golden Star T6 Super PCR Mix(TSE101)来配置PCR反应体系，具体配置如下：

PCR产物长度为326bp。PCR的反应程序如图4所示；

3.Sanger测序与基因型判读

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像，切取分子量大小为326bp的核苷酸条带所在凝胶，使用擎科生物公司生产的DNA凝胶回收试剂盒(TSP601)回收目的片段核苷酸，具体操作流程参照试剂盒说明书。目的片段核苷酸使用ABI 3730xl测序仪进行Sanger测序(正向测序)，具体操作流程参照设备说明书。测序文件使用Chromas软件读取，检索DLGAP2变异位点下游侧翼序列“TCCAAGCTGAC”即可定位到目标变异位点。若目标变异位点为G单峰，基因型即为GG纯合。若目标变异位点为GA双峰，基因型即为GA杂合。若目标变异位点为A单峰，基因型即为AA纯合。

上述结果判读：

DLGAP2变异位点的基因型为GA杂合或AA纯合即为携带子宫颈癌或子宫颈癌前病变的易感基因，判定为易感人群。DLGAP2变异位点的基因型为GG纯合即为不携带子宫颈癌或子宫颈癌前病变的易感基因，判定为非易感普通人群。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。