茶树木葡聚糖内糖基转移酶相关蛋白在扦插生根中的应用

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及茶树木葡聚糖内糖基转移酶相关蛋白在茶树扦插生根中的应用。

背景技术

植物细胞被富含多糖的细胞壁所包围，细胞壁决定了细胞的形态，并在发育的过程中起重要的作用；植物细胞壁中的多糖可以分为纤维素、半纤维素和果胶，这些组分在特定酶的催化下被“剪切和粘贴”，从而完成植物生长发育过程中细胞壁重塑。参与细胞壁修饰的最主要酶类为转葡聚糖酶，属于糖苷水解酶家族16，其中研究最深入的为木葡聚糖内糖基转移/水解酶(XTHs)，属于一种细胞壁松酶，包括了木葡聚糖内糖基转移酶(XETs)和木葡聚糖内糖基水解酶(XEHs)。

XTH在植物发育和应答逆境胁迫的过程中发挥作用，拟南芥AtXTH9的转录产物在植物茎尖累积，突变后植株节间显著变短，AtXTH27则在拟南芥莲座叶的形成和维管组织发育中起重要作用；Miedes等研究表明，XET的活性在番茄果实生长的过程中上升，在成熟的过程中下降，说明SiXTH5和SiXTH8在果实发育过程中能维持细胞壁组分的稳定性。XTH在应答逆境胁迫中也有重要功能，Cho等在拟南芥中过表达辣椒的CaXTH3基因能增加叶肉细胞的数目并显著增强植物对水分胁迫的耐受性。但XTH在植物不定根发生过程中的作用未见报道。

茶树(Camellia sinensis[L.]O.Kuntze)是起源于中国的多年生木本植物，作为经济作物被广泛种植于中国山区。扦插是茶树主要的无性繁殖方式，具有操作简易、繁殖系数高、便于机械化操作等特点，然而，由于部分难生根品种和古树资源扦插成活率和生根率低，给茶树良种推广和资源保存带来了很大的限制。

茶树生根是茶树扦插育苗是否成功的关键所在，提高茶树插穗扦插生根率，生产上常用的策略为控制育苗环境(CN104641920A和CN104541837A)和使用促生根物质(CN104012288A)；如若对栽培环境进行控制，需要大量的人力资源和栽培设施，一次性投入较大，且由于中国茶树育苗区的地理位置不同，一个栽培区域的控制环境技术可能不适合于其他茶树育苗区域；生长素类物质如ABT1常用于植物扦插生根、茶树育苗中，如若使用促生根物质处理插穗或者母树，生根物质的种类、使用方式和浓度都会影响到茶树插穗生根，探索过程繁琐，在生产实践中费时耗力。因此，不依赖生长素途径提高茶树扦插生根率对珍稀茶树资源保存极具意义。

发明内容

为了解决茶树难生根品种和古树资源扦插生根难度大的问题，本发明提供了木葡聚糖内糖基转移酶相关蛋白在促进茶树扦插生根中的应用，显著地提高了茶树扦插生根率。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

与茶树扦插生根相关的截短蛋白，包括TEA021045、TEA021057、TEA031639和Novel.313的截短蛋白，TEA021045截短蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示，TEA021057截短蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示，TEA031639截短蛋白的序列如SEQ ID NO.3所示，Novel.313的截短蛋白序列如SEQ ID NO.4所示。

生物材料，所述生物材料为下述A1)-A3)中的任意一种：

A1)编码上述TEA021045、TEA021057、TEA031639和Novel.313截短蛋白的核酸序列；TEA021045截短蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.5所示，TEA021057截短蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.6所示，TEA031639截短蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.7所示，Novel.313截短蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.8所示。

A2)含有A1)所述核酸序列的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸序列的重组载体或重组微生物。

茶树木葡聚糖内糖基转移酶相关蛋白在促进茶树扦插生根中的应用：将TEA021045、TEA021057、TEA031639和Novel.313截短蛋白表达纯化后处理茶树插穗(鄂茶10号、迎霜)并统计插穗的生根比率，结果表明4种截短蛋白均能显著提高茶树插穗扦插生根率。

木葡聚糖内糖基转移酶粗提物在促进茶树扦插生根中的应用：在本发明的具体实施例中，提取茶树的XET粗提物，比较IBA、XET粗提物和两者同时处理茶树插穗的生根率，结果表明XET粗提物与IBA同样具有促进生根的效果，并且XET粗提物能协同IBA促进茶树扦插生根，促生根效果显著高于两者单独使用。

附图说明

图1为鄂茶10号和迎霜扦插过程中脱落酸含量的变化。A.鄂茶10号插穗基部ABA含量变化，B.鄂茶10插穗叶片ABA含量变化，C.迎霜插穗基部ABA含量变化，D.迎霜插穗叶片ABA含量变化。纵坐标为内源ABA含量(ng/g)，横坐标为扦插后时间(月)。

图2为外源脱落酸处理茶树插穗基部后生根率的变化。CK为对照组，ABA为脱落酸浸泡处理8小时，EC10和YS分别为鄂茶10号和迎霜的缩写，*代表差异显著(P＜0.05)，外源脱落酸处理茶树插穗后能显著提高插穗生根率。

图3为脱落酸合成抑制剂处理茶树插穗基部后生根率的变化。CK为对照组，Na

图4为鄂茶10号GO富集分析结果。

图5为迎霜GO富集分析结果。

图6为TPM分析、FPKM分析和qRT-PCR分析的结果图。通过转录组分析鉴定到四个候选基因TEA021045、TEA021057、TEA031639和Novel.313。

图7为外源脱落酸处理茶树插穗基部对XET含量和酶活性的影响。A.外源脱落酸处理后插穗基部XET蛋白含量的变化，B.外源脱落酸处理后插穗基部XET酶活性变化。CK为对照组，TR为外源脱落酸处理组，EC10和YS分别为鄂茶10号和迎霜的缩写，*代表差异显著(P＜0.05)。

图8为纯化XET相关蛋白处理对茶树插穗基部后生根率的影响。T1、T2、T3和T4分别为TEA021045、TEA021057、TEA031639和Novel.313的纯化蛋白(全长)，CK为对照组；EC10和YS分别为鄂茶10号和迎霜的缩写。使用DUCAN进行差异显著性检验，不同小写字母间表示差异显著(P＜0.05)。

图9为XET粗酶液、IBA和XET粗酶液+IBA处理对茶树插穗基部后生根率的影响。CK为对照组，XET为XET粗酶液处理插穗基部8小时，IBA为吲哚丁酸处理插穗基部8小时，XET+IBA为XET粗酶液和吲哚丁酸共处理插穗基部8小时。

图10为蛋白截短实验设计方案和截短蛋白处理插穗基部后生根率的影响。A-D为蛋白截短实验设计方案，E为TEA021045截短蛋白处理茶树插穗，F为TEA021057截短蛋白处理茶树插穗，G为TEA031639截短蛋白处理茶树插穗，H为Novel.313截短蛋白处理茶树插穗。

具体实施方式

实施例1：表达纯化的茶树XETs促进茶树扦插生根

发明人所在课题组前期研究发现，ABA能促进茶树扦插生根，为了明确ABA在茶树扦插中的功能，我们测定了两个茶树品种(鄂茶10号、迎霜，下同)中的ABA含量(图1)，并外源使用ABA及其合成抑制Na

为了揭示ABA诱导茶树插穗生根的转录水平调控，我们提取ABA处理茶树插穗基部8h的RNA进行转录组测序，设置溶剂(1％乙醇)处理8h为对照。获得clean read后，我们进行了DEGs分析、维恩分析和聚类分析，随后DEGs被用于GO富集分析、TPM分析和FPKM分析，结果表明ABA处理后，茶树插穗基部细胞壁活动相关基因大量激活，有21个XET相关基因在鄂茶10号中上调表达，同时这些基因绝大部分也在迎霜中上调。转录组数据通过qRT-PCR验证，结果与转录组数据基本一致(图4、5、6)。这些结果说明ABA可能通过激活XET通路促进茶树扦插生根。为了验证XET蛋白水平和酶活性是否有受到外源脱落酸的影响，我们进行了ELISA实验，结果表明ABA处理后XET的蛋白含量和酶活性显著上升，说明ABA通过介导XET活性和含量来影响茶树插穗扦插生根(图7)。上述结果说明XET在茶树扦插过程中可能具有重要功能，为了验证该蛋白的具体功能，我们选择转录组数据中上调最明显的四个基因(TEA021045、TEA021057、TEA031639和Novel.313)克隆，克隆后进行真核表达纯化和外源处理茶树插穗验证。

1、基因克隆

通过3'-RACE和5'-RACE技术(rapid-amplification of cDNA ends)克隆TEA021045、TEA021057、TEA031639和Novel.313的cDNA序列。利用北京华越洋生物多糖多酚植物RNA提取试剂盒提取鄂茶10号RNA，逆转录得到3'-RACE和5'-RACE的模板。将PCR扩增产物纯化回收后连接至pJET1.2载体，并转化于大肠杆菌菌株DH5α，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性菌落，37℃过夜孵育后挑取适量单克隆菌落进行DNA测序，引物序列如表1所示。为了使毕赤酵母pPICZαA载体表达TEA021045、TEA021057、TEA031639和Novel.313融合蛋白，我们用New England Biolabs公司的Phusion聚合酶和HTG特异性引物扩增其cDNA，该引物在上游添加了5'Eco RI酶切位点，并用Xba I位点替换TEA021045、TEA021057、TEA031639和Novel.313的终止密码子，以编码其N端序列。PCR产物经纯化回收后连接至pJET1.2载体，转化后涂板并挑取阳性转化子。然后通过用Xba I完全消化和Eco RI部分消化从重组载体中切除TEA021045、TEA021057、TEA031639和Novel.313基因序列，胶回收后连接到pPICZαA载体中，并转化于大肠杆菌菌株DH5α中，得到阳性转化子。

表1：引物序列表

2、毕赤酵母真核表达

在pH 7.5的低盐(65mM氯化钠)LB培养基上使用40μg/ml zeocin(InVitrogen)筛选携带重组pPICZαA质粒的大肠杆菌。通过Sac I限制性内切酶消化使质粒线性化，并通过电转法将其转入毕赤酵母菌株SMD1168H，在含有100mg/l zeocin的低盐LB平板上进行筛选，通过DNA测序确认阳性菌落，并在补充有100mg/l zeocin、1％(w/v)甘油和0.4mg/l生物素的低盐LB培养基中过夜培养。培养完成后离心回收细胞并重悬于表达培养基(低盐LB培养基，含有100mg/l zeocin、1％(v/v)甲醇和0.4mg/l生物素)中。

重组TEA021045、TEA021057、TEA031639和Novel.313的C端带有6×His标签，可以利用Ni

3、插穗采集

从母本园的茶树母株上，采集无病虫害的半木质化枝条为材料，品种为鄂茶10号和迎霜，采集后置于温室大棚中覆盖防草布备用，温度不超过40℃，枝条存放备用时间不超过2天。

4、扦插基质准备

基质为泥炭土、珍珠岩和沙子的混合物，体积比为2:1:1，将混合均匀的基质放入育苗穴盘中备用，基质被甲基托布津(浓度为70％粉剂配置的700倍液体)喷施至湿润，经甲基托布津消毒后用大水清洗一次。

5、插穗处理

将采集的枝条修剪成含有一个生长点、带有半片叶片、长度为2-5cm的带芽茎端，修剪的插穗使用多菌灵(多菌灵溶液浓度为50％粉剂配置的1000倍液体)浸泡消毒，消毒完成后用清水洗涤一次备用；插穗的剪口为平行于叶片方向，上剪口高于生长点。

6、扦插

分别使用3种2mg/ml XET纯化蛋白溶液(TEA021045、TEA021057、TEA031639和Novel.313)浸泡处理完成的插穗基部8h，茎段垂直于基质表面插入基质，确保叶芽在基质上方，随后紧压基质，浇入定根水，使插穗与基质接触。

7、苗期管理

一是扦插后30天，是茶树插穗基部膨大时期，育苗基质相对含水量控制在80-90％，空气相对湿度保持在80-90％；二是温度控制：30℃是茶树插穗生根的温度，温度高于35℃加强水分管理；三是光照管理：使用70％遮光率的遮阳网进行遮阴管理，扦插后40天后，逐渐增强光照；四是病虫害防治：育苗期间防治茶蚜虫、茶小绿叶蝉、炭疽病病虫害。

将纯化完成的蛋白用于处理茶树插穗，并统计插穗的生根比率。结果表明(图8)，四种纯化蛋白均能显著提高茶树插穗扦插生根率，其中TEA031639和Novel.313在两个被试品种中均有最好的效果。

实施例2：XET粗提物促进茶树扦插生根

茶树扦插生根过程中，生长素类植物激素，如吲哚丁酸、萘乙酸等，是茶树生根的主效因子，已被广泛运用于生产实践中。而我们前期研究证明XET能软化细胞壁组分，因此XET可能具有协同其他植物激素提高茶树扦插生根率的潜力。为了验证该猜想，使用IBA、XET粗提物和两者同时处理茶树插穗，并统计生根率。

XET粗提物制备方法如下：1.5g植物茎端鲜样，加入8ml提取液(10mmol氯化钙，300mmol琥珀酸钠，20mmol抗坏血酸，15％甘油(v/v)，3％ PVPP(w/v))和适量石英砂冰浴研磨成匀浆，在冰上静置2h后，用神奇滤布过滤，在4℃、12000×g条件下离心5分钟，上清液为XET粗酶液，分装后储存于超低温冰箱并用于后续试验。酶液浓度通过BCA进行定量。其用于扦插试验方法同实施例1，XET粗酶液浓度为2mg/L，IBA浓度为100mg/L。

结果表明(图9)，XET和IBA单独使用均能显著提高茶树插穗扦插生根率，其中IBA效果较好，但两种处理间并无显著性差异；进一步地，两者同时使用时促进生根的效果最佳，且显著高于两者单独使用；这些结果说明XET促进茶树插穗的生根并不依赖于常规的生长素途径，且具有协同其它植物激素，提高茶树插穗生根率的作用。

实施例3：XETs的N端有强促扦插生根的能力

根据TEA021045、TEA021057、TEA031639和Novel.313的蛋白预测结构，本研究按图10A-D所示，设计了蛋白截短实验，截短引物如表2所示。下以TEA021045基因截短为例进行说明，其余基因截短类似于TEA021045；引物TEA021045/NTD-F和TEA021045/NTD-R扩增TEA021045的N端1-220个氨基酸，上游引物5’端添加EcoRI酶切位点，下游引物5’端添加KpnI酶切位点和终止密码子。引物TEA021045/CTD-F和TEA021045/CTD-R扩增TEA021045的C端221-293个氨基酸，上游引物5’端添加EcoRI酶切位点和起始密码子，下游引物5’端添加KpnI酶切位点。使用上述两对引物组合，实施例1中构建测序完成的pJET1.2-TEA021045的质粒为模板，PCR扩增TEA021045的截短基因序列TEA021045/NTD和TEA021045/CTD；PCR产物胶回收和双酶切(EcoRI和KpnI)后与同样双酶切的pJET1.2载体连接，并转化于大肠杆菌菌株DH5α，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性菌落，37℃过夜孵育后挑取适量单克隆菌落进DNA测序。后续构建表达载体和进行酵母真核表达同实施例1中所示。

表达完成的蛋白质被用于处理茶树插穗，随后用于扦插，具体操作如实施例1中所示。结果表明(图10E-H)，经XET基因N端纯化蛋白处理后的茶树插穗生根率均显著上升，而XET基因的C端纯化蛋白处理后，没有显著促进作用。说明在XETs促进茶树扦插生根的过程中为XETs的N端序列发挥作用。

表2：截短引物序列表

注：加粗字母为额外添加的起始密码子或终止密码子；下划线为额外添加的酶切位点。