一种检测农产品中邻苯二甲酸酯及其代谢物的方法

技术领域

本发明属于塑化剂残留检测技术领域，具体涉及一种结合UPLC-MS/MS测定农产品中邻苯二甲酸酯及其代谢物的方法。

背景技术

花生是我国重要的油料作物，地膜覆盖栽培是保障花生高产稳产一项不可缺少的重要措施。在地膜生产过程中邻苯二甲酸酯类作为添加剂被大量使用，随着塑料的老化，邻苯二甲酸酯类塑化剂会缓慢释放并最终进入土壤，很容易被植株吸收，由此可能引发的农产品质量安全以及人体健康风险备受国内学者的关注。

邻苯二甲酸酯的测定方法主要包括气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱法、液相色谱法、免疫快速分析法等。农产品通常参考国家标准《GB 5009.271-2016食品安全国家标准食品中邻苯二甲酸酯的测定》采用GC-MS进行18种邻苯二甲酸酯的测定，而且并未关注邻苯二甲酸酯类代谢物的测定。邻苯二甲酸酯代谢物通常不代表邻苯二甲酸酯毒性的消解，且其毒性反而更强。本方法采用溶剂提取，避免了其他方法繁琐的前处理过程，减少成本消耗，可以同时测定花生中25种邻苯二甲酸酯类塑化剂及其代谢物。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种结合UPLC-MS/MS测定农产品中25种邻苯二甲酸酯及其代谢物残留的方法。本发明所述方法快速、高效、简便，提取率、检出限和定量限均符合标准。

本发明所述检测农产品中邻苯二甲酸酯及其代谢物的方法，包括以下步骤：1)将农作物样品加入乙腈中进行超声提取，离心，取上清液氮吹，用甲醇定容，过滤，得到样品分析液；2)采用UPLC-MS/MS对步骤1)中获得的样品分析液进行18种邻苯二甲酸酯和7种邻苯二甲酸酯代谢物的定性、定量分析。

本发明所述邻苯二甲酸酯及其代谢物包括18种邻苯二甲酸酯及7种代谢物；具体地，18种邻苯二甲酸酯分别为：邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二正丁酯、邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯、邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯、邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯、邻苯二甲酸二戊酯、邻苯二甲酸二己酯、邻苯二甲酸丁基苄基酯、邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯、邻苯二甲酸二苯酯、邻苯二甲酸二正辛酯、邻苯二甲酸二壬酯、邻苯二甲酸二异壬酯、邻苯二甲酸二烯丙酯；7种邻苯二甲酸酯代谢物分别为：邻苯二甲酸单甲酯、邻苯二甲酸单乙酯、邻苯二甲酸单丁酯、邻苯二甲酸单苄酯、邻苯二甲酸单环己酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、邻苯二甲酸单异壬酯。

所述将农作物样品加入乙腈中进行超声提取，具体地，将农作物磨碎，以g/mL计，磨碎的农作物样品和乙腈的投加比例为1:8，涡旋1min后，超声提取20min。

所述离心为以4000rpm的转速离心5min，所述取上清液氮吹为取上清液以40℃的温度氮吹至近干，所述用甲醇定容至1ml，所述过滤为使用0.22μm的针式过滤器过滤。

所述定量分析为采用标准曲线法对18种邻苯二甲酸酯和7种邻苯二甲酸酯代谢物进行定量分析。

所述采用UPLC-MS/MS，具体地，采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，并采用0.1％甲酸水/甲醇作为流动相。

本发明的有益效果为：

1)本发明采用乙腈预处理的方法，提取18种邻苯二甲酸酯和7种邻苯二甲酸酯代谢物，减少了小柱净化程序，且提取率都能满足标准(70.2％-100.3％)，降低成本，缩短了提取时间，提高了效率，适用于大量样品的预处理。

2)本发明采用ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱，并采用0.1％甲酸水/甲醇作为流动相，18种邻苯二甲酸酯和7种邻苯二甲酸酯代谢物都能达到很好的灵敏度，25种邻苯二甲酸酯及其代谢物的检出限为0.1～100.0μg/kg，定量限为0.2～300μg/kg。

总之，本发明的方法简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确度高，检出限和定量限大大低于GB 5009.271-2016的要求，符合标准，非常适用于农产品，尤其是花生中邻苯二甲酸酯和邻苯二甲酸酯代谢物的测定，对于保障农产品质量安全，维护人体健康具有重要意义。

附图说明

图1为25种邻苯二甲酸酯及其代谢物的标准曲线，其中(1)邻苯二甲酸二己酯(DHXP)；(2)邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)；(3)邻苯二甲酸二乙酯(DEP)；(4)邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)；(5)邻苯二甲酸二甲酯(DMP)；(6)邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)；(7)邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)；(8)邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP)；(9)邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(DBEP)；(10)邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(BMPP)；(11)邻苯二甲酸二苯酯(DPhP)3-羟基克百威；(12)邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP)；(13)邻苯二甲酸二戊酯(DPP)；(14)邻苯二甲酸二烯丙酯(DAP)；(15)邻苯二甲酸二丁酯(DIBP)；(16)邻苯二甲酸二壬酯(DNP)；(17)邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)；(18)邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)；(19)邻苯二甲酸单环己酯(MCHP)；(20)邻苯二甲酸单乙酯(MEP)；(21)邻苯二甲酸单苄酯(MBzP)；(22)邻苯二甲酸单异壬酯(MiNP)；(23)邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)；(24)邻苯二甲酸单丁酯(MBP)；(25)邻苯二甲酸单甲酯(MMP)。

图2为18种邻苯二甲酸酯及7种代谢物的质谱图，其中：(1)邻苯二甲酸二己酯(DHXP)；(2)邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)；(3)邻苯二甲酸二乙酯(DEP)；(4)邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)；(5)邻苯二甲酸二甲酯(DMP)；(6)邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)；(7)邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)；(8)邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP)；(9)邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(DBEP)；(10)邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(BMPP)；(11)邻苯二甲酸二苯酯(DPhP)3-羟基克百威；(12)邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP)；(13)邻苯二甲酸二戊酯(DPP)；(14)邻苯二甲酸二烯丙酯(DAP)；(15)邻苯二甲酸二丁酯(DIBP)；(16)邻苯二甲酸二壬酯(DNP)；(17)邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)；(18)邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)；(19)邻苯二甲酸单环己酯(MCHP)；(20)邻苯二甲酸单乙酯(MEP)；(21)邻苯二甲酸单苄酯(MBzP)；(22)邻苯二甲酸单异壬酯(MiNP)；(23)邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)；(24)邻苯二甲酸单丁酯(MBP)；(25)邻苯二甲酸单甲酯(MMP)。

具体实施例

下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

下述各实施例中实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述药剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到；所述指标数据，如无特殊说明，均为常规测量方法。

实施例1

本实施例提供了本发明的方法检测邻苯二甲酸酯及其代谢物的灵敏度、精密度和回收率。

1材料和方法

1.1材料和试剂

邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP)、邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(BMPP)、邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP)、邻苯二甲酸二戊酯(DPP)、邻苯二甲酸二己酯(DHXP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)、邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(DBEP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、邻苯二甲酸二苯酯(DPhP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP)、邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)、邻苯二甲酸二烯丙酯(DAP)的标准品购自北京北方伟业计量技术研究院。邻苯二甲酸二丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)的标准品购自上海安谱实验科技股份有限公司(上海，中国)。邻苯二甲酸单甲酯(MMP)、邻苯二甲酸单乙酯(MEP)、邻苯二甲酸单丁酯(MBP)、邻苯二甲酸单苄酯(MBzP)、邻苯二甲酸单环己酯(MCHP)、邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)、邻苯二甲酸单异壬酯(MiNP)标准品购自AccuStandard公司(美国)。邻苯二甲酸酯原液(1000mg/L)和邻苯二甲酸酯代谢物原液(100mg/L)保存于-4℃。用于HPLC分析的甲醇、乙腈和甲酸均为HPLC级。制备了一系列用甲醇稀释的含有各种标准品混合物的标准溶液(1mg/L)。在整个研究过程中所有用水均来自Millipore公司的MilliQ-Plus超纯水系统(米尔福德，美国)。

1.2标准溶液配制

用18种邻苯二甲酸酯和7种邻苯二甲酸酯代谢物加入到甲醇中，制备浓度为5μg/mL的18种邻苯二甲酸酯和100μg/mL的7种邻苯二甲酸酯代谢物混合标准储备液，4℃保存。并用甲醇稀释制备一系列的标准工作液，使用标准工作液绘制相应标准溶液的标准曲线。

1.3样品提取和净化

花生样品的制备：将花生磨碎均质，取0.5g磨碎均质的样品于玻璃离心管，加入4mL乙腈，涡旋1min，超声提取20min，离心机4000rpm下离心5min，取上清液，40℃氮吹至近干，用甲醇定容至1mL，使用0.22μm的Biosharp BS-QT-013(13mm*0.22μm)针式过滤器过滤，装瓶待上机。

1.4仪器方法

色谱条件：waters I-class超高液相色谱仪，ACQUITYUPLC BEH C18(2.1mm×100mm，粒径1.7μm)，柱温：35℃，样品室温度20℃；进样体积：3μL；

流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：甲醇，流速：0.3mL/min。

梯度洗脱程序如下：0-1min：流动相B从20％线性增加到40％；1-3min，流动相B从40％线性增加到60％；3-5min：流动相B从60％线性增加到80％；5-7min：流动相B从80％线性增加到90％；7-9min：流动相B从90％线性增加到95％，平衡4min；13-13.5min：流动相B从95％线性减少到50％；13.5-14min：流动相B从50％线性减少到20％。

质谱条件：AB5500型三重四级杆串联质谱仪，电喷雾(ESI)离子源，正负离子扫描模式；各参数如下：离子喷雾电压：4.5kV，气帘气压力：35psi，雾化气压力：55psi，辅助加热气压力：55psi，离子源加热温度：550℃-600℃。

设置如表1所示的去簇电压及碰撞能量，使用Analyst1.6.2软件进行优化。采用多反应监测(MRM)模式采集数据，保证采集点充足(每个峰至少有12个点)。25种邻苯二甲酸酯及其代谢物的定量离子对和定性离子对如表1所示。

表125种邻苯二甲酸酯及其代谢物的MRM参数

/>

2方法验证

2.1分析方法

分析邻苯二甲酸酯及其代谢物需要建立标准曲线，每种物质的标准曲线选用5个浓度，通过绘制LC/MS/MS中每种邻苯二甲酸酯及其代谢物的峰面积(y轴)与浓度(x轴)的关系曲线，建立了每种邻苯二甲酸酯及其代谢物的标准曲线(见图1)。

计算标准溶液峰面积日内和日间的变化以及相对标准偏差来分析其精密度。用LOD和LOQ测定LC/MS/MS分析方法的灵敏度。

2.2方法验证

在5～12500ng/mL的浓度水平上添加不同的邻苯二甲酸酯及其代谢物建立标准曲线见表2，并给出了标准曲线的线性方程和检测限，在实验浓度范围内R值高于0.9990，有良好的线性，每种邻苯二甲酸酯及其代谢物的检测限和定量限分别是信噪比的3倍和10倍，样品中邻苯二甲酸酯及其代谢物的检出限为0.1～100.0μg/kg，定量限为0.2～300μg/kg。结果表明：该方法对花生中邻苯二甲酸酯及其代谢物的检测是灵敏的。

表2 25种邻苯二甲酸酯及其代谢物的线性、检出限和定量限

2.3精密度和回收率

加标回收率试验，在花生空白样品中进行低(100μg/kg)、中(200μg/kg)、高(400μg/kg)三个浓度水平上添加邻苯二甲酸酯及其代谢物的混合标准物质进行测定，来分析方法的准确度。

计算峰面积日内和日间的变化以及相对标准偏差来分析其精密度，表3给出了分析物的平均回收率和相对标准偏差。表3中可以看出，使用该方法所有邻苯二甲酸酯及其代谢物的平均回收率在70.2％-100.3％之间，所有相对标准偏差低于15％。

表3邻苯二甲酸酯及其代谢物分析方法的精密度和回收率

3.结果与讨论

3.1样品处理方法的优化

GB 5009.271-2016中食品中邻苯二甲酸酯提取后经过PSA/Silica复合填料玻璃柱净化上机，但应用该净化柱后，7种邻苯二甲酸酯代谢物大部分回收不到；也尝试应用固相萃取柱Oasis MAX、Oasis HLB、Sep-Pak Silica，均未达到满意效果，本方法减少了的净化步骤，实验证明：简化后的方法是检测花生中25种邻苯二甲酸酯及其代谢物的最佳预处理方法，各邻苯二甲酸酯及其代谢物回收率良好。

将样品充分粉碎混匀后准确称取0.5g(精确至0.0001g)于10mL具塞磨口离心管中，再加入4mL乙腈，涡旋1min，超声提取20min，4000r/min离心5min，收集上清液。40℃氮气吹干，加入1mL甲醇定容，0.22μm滤膜过滤后上机。同时设置空白对照。

3.2高液相色谱条件的优化

在建立MS/MS参数后，优化液相方法。比较了UPLC BEH C18柱和UPLC HSS T3柱的效果，并将0.1％乙酸加入到流动相中，调整甲醇、乙酸水的梯度，可以达到更好的灵敏度，如图2所示，用质谱法可以获得较好的分离效果。

4.结论

本发明建立一种同时快速提取并测定花生中25种邻苯二甲酸酯及其代谢物(邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二正丁酯、邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯、邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯、邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯、邻苯二甲酸二戊酯、邻苯二甲酸二己酯、邻苯二甲酸丁基苄基酯、邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯、邻苯二甲酸二苯酯、邻苯二甲酸二壬酯、邻苯二甲酸二异壬酯、邻苯二甲酸二烯丙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二正辛酯、邻苯二甲酸单甲酯、邻苯二甲酸单乙酯、邻苯二甲酸单丁酯、邻苯二甲酸单苄酯、邻苯二甲酸单环己酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、邻苯二甲酸单异壬酯)的UPLC-MS/MS方法。这种方法简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确度高，邻苯二甲酸酯的检出限和定量限显著低于国家标准GB5009.271-2016。

实施例2

本实施例提供了传统检测方法检测25种邻苯二甲酸酯及其代谢物的灵敏度、精密度和回收率。

1材料和方法

1.1材料、试剂、标准溶液配制同实施例1。

1.2样品提取和净化

花生样品的制备：准确称取试样0.5g(精确至0000.1g)于25mL具塞磨离心管中，加入125μL同位素内标使用液，加入2mL～5mL蒸馏水，涡旋混匀，再准确加人10mL正己烷，涡旋1min,剧烈振摇1min,超声提取30min,1000r/min离心5min,取上清液，供GC-MS分析。

1.3仪器方法

1.3.1仪器

气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)；分析天平：精度(0.0001g)；氮吹仪；涡旋振荡器；超声波发生器；离心机转速≥4000r/min；粉碎机；固相萃取(SPE)装置；固相萃取柱：PSA/Silica复合填料玻璃柱(1000mg，6mL)。

1.3.2方法

色谱柱：5％苯基-甲基聚硅氧烷石英毛细管色谱柱，柱长：30m，内径：0.25mm，膜厚：0.25μm，或性能相当者。进样口温度：260℃。

程序升温：初始柱温60℃，保持1min；以20℃/min升温至220℃，保持1min；再以5℃/min升温至250℃，保持1min；再以20℃/min升温至290℃，保持7.5min。

载气：高纯氮(纯度>99.999％)，流速：1.0mL/min；进样方式：不分流进样；进样量：1μL。

电离方式：电子轰击电离源(EI)；电离能量:70eV；传输线温度：280℃；离子源温度：230℃；监测方式：选择离子扫描(SIM)；溶剂延迟：7min。

实施例3

本实施例提供了传统方法与本发明提供的检测方法对实际样品的测定结果。

使用实施例1中提供的方法测定了54个采集的花生样品中邻苯二甲酸酯及其代谢物的残留量，邻苯二甲酸酯及其代谢物的污染率，阳性样品的平均值和最大值如表4所示。结果表明：54个花生样品中检测出7种邻苯二甲酸酯及其代谢物，污染率最高可以达到57.41％(邻苯二甲酸二戊酯)，其次是邻苯二甲酸单丁酯(31.48％)，邻苯二甲酸单异壬酯(29.63％)，有10个样品中检测出了邻苯二甲酸二戊酯，最大浓度可以达到611.90μg/kg。卫生部关于通报食品及食品添加剂邻苯二甲酸酯类物质最大残留量的函(卫办监督函〔2011〕551号)，食品、食品添加剂中的邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)最大残留量为0.3mg/kg。超标率达到了7.4％。

表4本发明提供方法对54个花生样品检测结果

上述结果表明，花生中邻苯二甲酸酯的污染水平比较高，本发明所提供的检测方法定性定量准确度高。

使用实施例2中提供的方法测定了54个采集的花生样品中邻苯二甲酸酯及其代谢物的残留量，邻苯二甲酸酯及其代谢物的污染率，阳性样品的平均值和最大值如表5所示。

表5传统检测方法对54个花生样品检测结果

结果表明：54个花生样品中检测出4种邻苯二甲酸酯，未能检测出邻苯二甲酸酯代谢物，污染率最高可以达到51.85％(邻苯二甲酸二戊酯)，有8个样品中检测出了邻苯二甲酸二正丁酯，最大浓度可以达到589.32μg/kg。

传统检测方法未能检测出邻苯二甲酸酯代谢物，未能检测出所有的邻苯二甲酸酯，检测出邻苯二甲酸酯及其代谢物的污染率，阳性样品的平均值和最大值均低于本发明所提供检测方法的结果。

传统的检测方法参考国家标准《GB 5009.271-2016食品安全国家标准食品中邻苯二甲酸酯的测定》，采用GC-MS进行18种邻苯二甲酸酯的测定，花生样品需经过SPE净化，而且传统的检测方法并未关注邻苯二甲酸酯类代谢物的测定，按国标净化后未能检测出邻苯二甲酸酯代谢物。而本发明所提供的检测方法，简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确度高，非常适用于农作物，尤其是花生中邻苯二甲酸酯和邻苯二甲酸酯代谢物的测定。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。