一种活萃因子冻干粉及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及A61K领域，尤其涉及一种活萃因子冻干粉及其制备方法和应用。

背景技术

随着社会的进步和经济的发展，医学领域的发展也再突飞猛进的进行，其不断的发展也不断的提高人类寿命，减少疾病痛苦，有效的提高了人们的生活幸福水平。这其中，再生医学更是近些年来医学领域发展较为迅猛的方向之一。再生医学自2012年以来便将更多的目光投向了干细胞方面的发展，相关干细胞领域的研究成果更是近些年来在包括诺贝尔奖在内的多项奖项中获奖。在干细胞当中，间充质干细胞被认为是可塑性最大的细胞，并且其所分泌的分泌因子具有极高的生物活性，可以促进细胞分化，其所分泌的细胞因子亦可帮助细胞再生，然而现有技术当中缺少对于间充质干细胞分泌因子良好的保存方法和产品。

现有技术(CN201810318819.0)提供了一种干细胞活性因子冻干粉剂，采用干细胞中提取出的干细胞活性因子与一系列的活性成分助剂进行简单的冻干和干燥部分制备了冻干粉剂制品，并声称冻干粉制剂在能够的保存干细胞活性因子的活性具有良好的制品效力。但是其加入的过多的蛋白质和多糖类的物质，容易对于冻干粉制剂的持久性保存性能产生一定的负面影响。

因此，亟需一种能够有效提取并保存细胞活性分泌因子的方法，并且制备出的保存粉剂需要具有优异的长时间保存性能和活性因子含量。

发明内容

为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种活萃因子冻干粉，成分至少包括干细胞分泌活性因子，质量占比0～10％的保护剂。

作为一种优选的方案，所述保护剂为甘露醇、玉米糊精。

作为一种优选的方案，所述保护剂为甘露醇、玉米糊精，质量比为8～2：1。

作为一种更优选的方案，所述保护剂为甘露醇、玉米糊精，所述的质量比为4：1。

作为一种优选的方案，所述干细胞为人源脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的至少一种。

本发明第二方面提供了一种上述冻干粉的制备方法，步骤至少包含以下几步：(1)间充质干细胞培养；(2)分泌因子储存；(3)分泌因子分装及冻干机预设定；(4)冻干机冻干；(5)真空干燥。

作为一种优选的方案，所述间充质干细胞培养为间充质干细胞3D扩增培养。

作为一种更优选的方案，所述间充质干细胞3D扩增培养的具体方法为：(1)准备3D生物反应器消毒，将反应器放入37°，5％二氧化碳培养箱中；(2)准备培养瓶，高压灭菌烘干，超净台内将其中一个侧臂瓶口打开，从侧臂瓶口放入3D微载体，加入细胞悬液体积的培养基；(3)每片微载体准备10～50万个干细胞，加入培养瓶中，将转瓶置于培养箱内的3D生物反应器上，放入37°，5％二氧化碳培养箱中，启动3D生物反应器搅拌功能；(4)选择恒速模式，设置转速为50～80rpm，观察搅拌是否稳定，不稳定进行中心位置调整使之稳定；(5)干细胞培养期间，或待微载体沉降后，将上清弃除再补充新鲜培养基；(6)培养后完成，将含细胞的微载体转入离心管中，待沉降后弃除培养基，裂解液轻轻混匀，37°孵育15～40min；(7)待微载体全部裂解后，加入双倍体积的终止液，充分混匀，终止裂解反应，再次离心1000～1500rpm，5～8分钟；(8)弃上清，加入等量PBS重悬细胞，再次离心1000～1500rpm，5～8分钟；重复一次后弃上清，根据需求，将细胞重悬至适当浓度；(9)收获细胞，并可依需求重复上述步骤直至预期代数细胞收获完毕。

作为一种优选的方案，所述培养基为无血清培养基。

作为一种优选的方案，所述培养基用量为每125mL瓶使用10片微载体，加入8～15mL培养基。

作为一种优选的方案，所述分泌因子储存的具体操作为：利用极低温保存法，结合冻干技术，提炼出干细胞活萃因子。

作为一种优选的方案，所述分泌因子分装及冻干机预设定的具体操作为：利用自动化将分泌活性因子和保护剂分装至西林瓶中，利用真空上盖，并预定设置冻干机参数，控制温度和湿度在适宜范围。

作为一种优选的方案，所述制备方法还包括真空干燥之后的研磨步骤；所述研磨步骤为将干燥后的冻干粉剂研磨至400～1000目。

作为一种更优选的方案，所述研磨步骤为将干燥后的冻干粉剂研磨至500～600目。

作为一种优选的方案，所述分泌因子分装及冻干机预设定中温度保持在20～30℃，湿度控制在45～55％。

作为一种更优选的方案，所述分泌因子分装及冻干机预设定中温度保持在25℃，湿度控制在50％。

作为一种优选的方案，所述间充质干细胞3D扩增培养中每代细胞培养周期为7～14天；间充质干细胞培养代数为2～8代。

作为一种优选的方案，所述冻干机冻干的具体操作为：先将该冻干机预冷降温冷凝，采用冷却点温度；设定冻干温度，采用客制化流程；逐步上升温度，直至温度跨越常温；常温将会作为温度控制点，再逐步将温度上升至设定温度。

本发明第三方面提供了一种上述活萃因子冻干粉的应用，包括所述活萃因子冻干粉在生物美容制剂、毛发毛囊再生制剂和皮肤抗衰领域中的应用。

本发明第四方面提供了一种上述活萃因子冻干粉的应用方法，采用将冻干粉剂溶解涂抹于表皮层或采用微针、滚针或水光针中任何一种方式，之后将活萃因子导入表皮深层或是真皮层。

有益效果：

1、本申请中，制备的一种干细胞分泌活萃因子的冻干粉，具有良好的干细胞活萃因子保存效果，维持良好的干细胞分泌因子的活性，并且制备的冻干粉剂能够在储存状态下保持2～3年的储存寿命进而正常使用。

2、本申请中还具体提供了一种间充质干细胞的3D扩增培养方法，相较于传统的干细胞繁殖培养方式，本申请中的3D扩增培养方法能够在相同的培养周期内，有效的提高间充质干细胞的培养效率，从而有效提高活萃因子冻干粉的制备效率。

3、本申请中制备的冻干粉因其具有良好的分泌活性因子的活性，能够有效的应用于肌肤修复、毛发再生等相关产品当中，具有优异的促进细胞再生效果，使其具有优异的产品效力。

附图说明

图1为本申请所制备活萃因子冻干粉的制备培养箱图示；

图2为本申请所制备活萃因子冻干粉的参数值图示。

具体实施方式

实施例1

实施例1第一方面提供了一种活萃因子冻干粉，成分为干细胞分泌活性因子，质量占比10％的保护剂。

本实施例中，保护剂为甘露醇，玉米糊精质量比为4：1。

本实施例中，所述干细胞为人源脐带间充质干细胞。

本实施例第二方面提供了一种上述冻干粉的制备方法，步骤包含以下几步：(1)间充质干细胞3D扩增培养；(2)分泌因子储存；(3)分泌因子分装及冻干机预设定；(4)冻干机冻干；(5)真空干燥；(6)研磨。

本实施例中，间充质干细胞3D扩增培养的具体方法为：(1)准备3D生物反应器消毒，将反应器放入37°，5％二氧化碳培养箱中；(2)准备培养瓶，高压灭菌烘干，超净台内将其中一个侧臂瓶口打开，从侧臂瓶口放入3D微载体，加入细胞悬液体积的培养基；(3)每片微载体准备30万个干细胞，加入培养瓶中，将转瓶置于培养箱内的3D生物反应器上，放入37°，5％二氧化碳培养箱中，启动3D生物反应器搅拌功能；(4)选择恒速模式，设置转速为60rpm，观察搅拌是否稳定，不稳定进行中心位置调整使之稳定；(5)干细胞培养期间，将上清弃除再补充新鲜培养基至原使用量；(6)培养后完成，将含细胞的微载体转入离心管中，待沉降后弃除培养基，裂解液轻轻混匀，37°孵育35min；(7)待微载体全部裂解后，加入双倍体积的盐酸终止液，充分混匀，终止裂解反应，再次离心1200rpm，6分钟；(8)弃上清，加入等量PBS重悬细胞，再次离心1200rpm，6分钟；重复一次后弃上清，根据需求，将细胞重悬至适当浓度；(9)收获细胞，重复上述步骤直至获得第4代干细胞，每代培养周期为10天。

本实施例中，培养基为无血清培养基；无血清培养基为源叶生物有限公司出售的Gibco no phenol red Medium培养基产品。

本实施例中，培养基用量为每125mL瓶使用10片微载体，加入10mL培养基。

本实施例中，分泌因子储存的具体操作为：利用极低温保存法，结合冻干技术，提炼出干细胞活萃因子。

本实施例中，分泌因子分装及冻干机预设定的具体操作为：利用自动化将分泌活性因子和保护剂分装至西林瓶中，利用真空上盖，并预定设置冻干机参数，控制温度为25℃和湿度在50％。

本实施例中，冻干机冻干的具体操作为：先将该冻干机预冷降温冷凝，采用冷却点温度；设定冻干温度为-80℃，采用客制化流程；逐步上升温度，直至温度跨越25℃；将25℃作为温度控制点，再逐步将温度上升至100℃。

本实施例中，研磨步骤为将干燥后的冻干粉剂研磨粉碎至550目。

实施例2

本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：培养基用量为每125mL瓶使用10片微载体，加入15mL培养基。

实施例3

本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：研磨步骤为将将干燥后的冻干粉剂研磨粉碎至400目。

对比例1

本对比例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：甘露醇、玉米糊精的质量比为2：1。

对比例2

本对比例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：培养基用量为每125mL瓶使用10片微载体，加入5mL培养基。

性能评价

bFGF含量：将所有实施例和对比例制得冻干粉使用30mg/mL的水启动测试活性，分别测试冻干粉在0.33微升，1毫升和再次调整赋形剂及水的比例后与2～8wt％的赋形剂混合后的2毫升的bFGF含量，每个实施例对比例测试5个试样，测得的数值的平均值记入表1。

表1

通过实施例1～3、对比例1～2和表1可以得知，本发明提供的一种活萃因子冻干粉及其制备方法和应用，制得的冻干粉具有良好的储存性能和干细胞分泌因子活性，并且能够有效的应用于肌肤修复品和生发品等产品中，具有优异的使用效果，适宜在干细胞和护肤保健品领域推广，具有广阔的发展前景。其中实施例1在具有最佳的制备原料配比和制备工艺等因素下获得了最佳性能指数。