RSV疫苗组合物、方法及其用途

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技术领域

本公开在一些方面涉及一种包含重组肽和蛋白质的免疫原性组合物，所述重组肽和蛋白质包含呼吸道合胞病毒(RSV)病毒抗原和免疫原，例如RSV F蛋白肽，所述免疫原性组合物用于治疗和/或预防RSV感染。

背景技术

呼吸道合胞病毒(RSV)导致成人和儿童呼吸道感染，是婴儿期和儿童期下呼吸道感染和住院治疗的主要原因。尽管RSV感染率高，但包括预防剂、治疗剂和疫苗在内的治疗手段却有限或不可用。需要改进的方法来治疗RSV。本文提供了满足这些和其它需要的组合物、方法、用途和制品。

发明内容

在一个方面，本文提供了一种包含多个重组多肽的蛋白质，各重组多肽包含连接到胶原蛋白C端前肽的呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白肽或其片段或表位，其中所述重组多肽的C端前肽形成了多肽间二硫键。在一些实施方式中，所述RSV属于A亚型或B亚型。在一些实施方式中，所述表位是线性表位或构象表位。

在一些实施方式中，本文公开了重组亚单位疫苗，所述重组亚单位疫苗包含RSV F蛋白或其片段的胞外结构域(例如，无跨膜结构域和胞质结构域)，所述胞外结构域与能够形成二硫键连接的同三聚体的胶原蛋白C前肽框内融合。所产生的重组亚单位疫苗如F三聚体可以从转染的细胞表达并纯化，并且预计呈三聚体形式的天然样构象。这解决了病毒抗原在表达为无跨膜结构域和/或胞质结构域的可溶性形式的重组肽或蛋白质时经常遇到的错误折叠问题。这种错误折叠的病毒抗原不能准确地保留天然病毒抗原构象，而且往往不能激发出中和抗体。

在一些实施方式中，所述F蛋白肽包含F1亚单位肽、F2亚单位肽或其任何组合，并且所述蛋白质包含三个重组多肽。在一些实施方式中，所述F蛋白肽包含信号肽、七肽重复序列C(HRC)肽、pep27肽、融合肽(FP)、七肽重复序列A(HRA)肽、结构域I肽、结构域II肽或七肽重复序列B(HRB)肽或其任何组合。在一些实施方式中，所述F蛋白肽包含F蛋白的F1亚单位但不包含F2亚单位，或相反。在一些实施方式中，所述F蛋白肽包含F蛋白的F1亚单位和F2亚单位，任选地不存在pep27，并且任选地其中所述F1亚单位和所述F2亚单位通过二硫键或人工引入的连接物连接。在一些实施方式中，所述F蛋白肽不包含跨膜(TM)结构域肽和/或胞质(CP)结构域肽。在一些实施方式中，所述F蛋白肽包含蛋白酶切割位点，其中所述蛋白酶任选地为弗林蛋白酶、胰蛋白酶、因子Xa、凝血酶或组织蛋白酶L。在一些实施方式中，所述F蛋白肽不包含蛋白酶切割位点，其中所述蛋白酶任选地为弗林蛋白酶、胰蛋白酶、因子Xa、凝血酶或组织蛋白酶L。

在一些实施方式中，所述F蛋白肽是可溶性的，或不直接结合到脂质双分子层，例如膜或病毒包膜。在一些实施方式中，F蛋白肽在所述蛋白质的重组多肽间是相同的或不同的。在一些实施方式中，所述F蛋白肽直接与C端前肽融合，或通过连接物如包含甘氨酸-X-Y重复序列的连接物连接到C端前肽，其中X和Y独立地为任何氨基酸，任选地为脯氨酸或羟脯氨酸。

在一些实施方式中，所述蛋白质是可溶性的，或不直接结合到脂质双分子层，例如膜或病毒包膜。在一些实施方式中，所述蛋白质能够形成包含F蛋白肽三聚体的莲座样寡聚物。在一些实施方式中，所述蛋白质能够结合到受试者的细胞表面附着因子或受体，任选地其中所述受试者是哺乳动物，如灵长类动物，例如人类。

在一些实施方式中，所述C端前肽属于人类胶原蛋白。在一些实施方式中，所述C端前肽包含proα1(I)、proα1(II)、proα1(III)、proα1(V)、proα1(XI)、proα2(I)、proα2(V)、proα2(XI)或proα3(XI)的C端多肽或其片段。在一些实施方式中，在所述重组多肽间所述C端前肽是相同或不同的。在一些实施方式中，所述C端前肽包含SEQ ID NO:48-63中的任一个或与其具有至少90％同一性、能够形成多肽间二硫键并使所述重组多肽三聚化的氨基酸序列。

在一些实施方式中，各重组多肽中的F蛋白肽呈融合前构象或融合后构象，任选地其中所述蛋白质包含莲座样寡聚物，所述莲座样寡聚物包含拐杖形棒状F蛋白肽三聚体。在上述实施方式中的任一个中，各重组多肽中的F蛋白肽可以包含SEQ ID NO:17-47中的任一个或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在上述实施方式中的任一个中，所述重组多肽可以包含SEQ ID NO:1-16中的任一个或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。在上述实施方式中的任一个中，所述重组多肽可以包含直接或间接地连接到SEQ ID NO:48-63中的任一个或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的SEQ ID NO:17-47中的任一个或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。

本文还提供了一种包含本文所提供的蛋白质的免疫原。本文提供了一种包含直接或间接地连接到纳米粒子的本文所提供的蛋白质的蛋白质纳米粒子。本文提供了一种包含本文所提供的蛋白质的病毒样粒子(VLP)。

本文还提供了一种分离的核酸，所述分离的核酸编码本文所提供的蛋白质的1、2、3个或更多个重组多肽。在一些实施方式中，编码F蛋白肽的多肽与编码胶原蛋白C端前肽的多肽框内融合。在一些实施方式中，本文所提供的分离的核酸可操作地连接到启动子。

在一些实施方式中，本文所提供的分离的核酸是DNA分子。在一些实施方式中，本文所提供的分离的核酸是RNA分子，任选地为mRNA分子，如核苷修饰mRNA、非扩增mRNA、自扩增mRNA或反式扩增mRNA。

本文还提供了一种包含本文所提供的分离的核酸的载体。在一些实施方式中，所述载体是病毒载体。

在一些方面，本文提供了一种包含本文所提供的载体的病毒、假病毒或细胞，任选地其中所述病毒或细胞具有重组基因组。在一些方面，本文提供了一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含本文所提供的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米粒子、VLP、分离的核酸、载体、病毒、假病毒或细胞，以及药学上可接受的载剂。

本文还提供了一种包含本文所提供的免疫原性组合物和任选的佐剂的疫苗，其中所述疫苗任选地为亚单位疫苗。在一些实施方式中，所述疫苗是预防性和/或治疗性疫苗。

在一些方面，本文提供了一种产生蛋白质的方法，所述方法包括：在宿主细胞中表达本文所提供的分离的核酸或载体以产生本文所提供的蛋白质；以及纯化所述蛋白质。本文提供了一种通过本文所提供的方法产生的蛋白质。

本文提供了在受试者中对RSV的F蛋白肽或其片段或表位产生免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的如本文所提供的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米粒子、VLP、分离的核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗以产生所述免疫应答。在一些实施方式中，本文所提供的方法用于治疗或预防RSV感染。在一些实施方式中，产生免疫应答抑制或减少了受试者中RSV的复制。在一些实施方式中，所述免疫应答包括细胞介导应答和/或体液应答，任选地包括产生一种或多种中和抗体，如多克隆抗体或单克隆抗体。在一些实施方式中，所述免疫应答针对RSV的F蛋白肽或其片段或表位，但不针对C端前肽。在一些实施方式中，给药于受试者不会由于所述受试者之前暴露于一种或多种RSV而导致抗体依赖性增强(ADE)。在一些实施方式中，当所述受试者随后暴露于一种或多种RSV时，所述给药不会导致抗体依赖性增强(ADE)。在一些实施方式中，所述方法还包括初免步骤和/或加强步骤。在一些实施方式中，所述给药步骤通过局部、经皮、皮下、皮内、口服、鼻内(例如鼻内喷雾)、气管内、舌下、颊、直肠、阴道、吸入、静脉内(例如静脉内注射)、动脉内、肌肉内(例如肌肉内注射)、心内、骨内、腹膜内、经粘膜、玻璃体内、视网膜下、关节内、关节周、局部或经表皮给药来进行。在一些实施方式中，所述有效量以单剂或者以一个或多个间期隔开的一系列剂量给药。在一些实施方式中，所述有效量在无佐剂的情况下给药。在一些实施方式中，所述有效量与佐剂一起给药。

本文提供了一种方法，所述方法包括向受试者给药有效量的本文所提供的蛋白质，以在所述受试者中产生针对RSV的中和抗体或中和抗血清。在一些实施方式中，所述受试者是哺乳动物，任选地为人类或非人灵长类动物。在一些实施方式中，所述方法还包括从所述受试者分离所述中和抗体或中和抗血清。在一些实施方式中，所述方法还包括通过被动免疫向人类受试者给药有效量的所分离的中和抗体或中和抗血清以预防或治疗RSV感染。在一些实施方式中，针对RSV的中和抗体或中和抗血清包含针对RSV F蛋白肽或其片段或表位的多克隆抗体，任选地其中所述中和抗体或中和抗血清不含或基本上不含针对胶原蛋白C端前肽的抗体。在一些实施方式中，所述中和抗体包含针对RSV F蛋白肽或其片段或表位的单克隆抗体，任选地其中所述中和抗体不含或基本上不含针对胶原蛋白C端前肽的抗体。

在一些方面，本文所提供的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米粒子、VLP、分离的核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗用于在受试者中诱导对RSV的免疫应答和/或用于治疗或预防RSV感染。

在一些方面，本文提供了本文所提供的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米粒子、VLP、分离的核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗的用途，用于在受试者中诱导对RSV的免疫应答和/或用于治疗或预防RSV感染。在一些方面，本文提供了本文所提供的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米粒子、VLP、分离的核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗的用途，其用于制备药物或预防药剂，所述药物或预防药剂用于在受试者中诱导针对RSV病毒的免疫应答和/或用于治疗或预防RSV感染。

本文还提供了分析样品的方法，所述方法包括：将样品与本文所提供的蛋白质接触，以及检测所述蛋白质与能够特异性结合到RSV的F蛋白肽或其片段或表位的分析物之间的结合。在一些实施方式中，所述分析物是识别F蛋白肽或其片段或表位的抗体、受体或细胞。在一些实施方式中，所述结合表明所述样品中存在所述分析物和/或所述样品来源的受试者中存在RSV感染。

本文提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本文所提供的蛋白质以及容纳或固定所述蛋白质的基材、衬垫或小瓶，任选地其中所述试剂盒是ELISA或测流测定用试剂盒。

附图说明

图1A-1C示出了包含RSV F蛋白肽的示例性融合肽的表达水平和纯化。图1A示出了包含与三聚化肽融合的细胞外F结构域的示例性融合肽的示意图。图1B示出了对无血清补料分批细胞培养的示例性融合肽表达的8％SDS-PAGE分析。在非还原条件下分离第1天至第12天的10mL无细胞条件培养基，然后进行考马斯蓝染色。图1C示出了通过SEC-HPLC对示例性融合肽进行的纯度评估，根据OD

图2A-2C示出了包含RSV F蛋白肽的示例性纯化融合肽的表征。图2A示出了在非还原和还原条件下对包含RSV F蛋白肽的示例性融合肽进行的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。上样2μg纯化蛋白质以便通过8％SDS-PAGE进行考马斯蓝染色，上样0.1μg纯化蛋白质以便通过使用分别对F和胶原蛋白前肽特异的抗体进行蛋白质印迹。图2B示出了包含RSV F蛋白肽的示例性融合肽蛋白的负染色电子显微照片，所述RSV F蛋白肽表现出呈个体形式或大部分为莲座样寡聚物的拐杖形分子。个体和莲座样分子的实例如下所示，并附有它们的结构图。图2C示出了通过对帕利珠单抗(palivizumab)和包含RSV F蛋白肽的示例性融合肽的生物层干涉法进行的结合研究。首先将5μg/mL帕利珠单抗固定在蛋白A传感器上，然后将传感器浸在不同浓度的示例性融合肽中以测量结合动力学。通过减去缓冲液参考值将所得曲线与1:1结合模型拟合，得到K

图3A-3E示出了用包含RSV F蛋白肽的示例性融合肽进行免疫接种保护免于RSV感染。图3A示出了实验方法的示意图：第0天和第21天免疫接种小鼠，然后第49天在收集血清后用RSV进行鼻内(i.n.)激惹。图3B示出了针对包含RSV F蛋白肽的纯化的示例性融合肽的血清抗F IgG ELISA滴度。图3C是病毒微量中和测定，示出了针对RSV感染的CPE形成提供50％抑制的血清中和抗体滴度。图3D示出了激惹后5天通过噬斑测定在免疫接种的小鼠的肺中得到的RSV滴度。值表示每克肺组织的噬斑数。图3E示出了通过血清样品稀释液测定的对帕利珠单抗与热灭活RSV(HI-RSV)粒子结合提供50％抑制的帕利珠单抗竞争性IgG滴度。值表示为log

图4示出了用包含RSV F蛋白肽的示例性融合肽进行免疫接种保护免于疫苗诱导性疾病增强。将激惹后5天收集的肺组织在10％中性缓冲福尔马林中固定，进行石蜡包埋，以5μm切片，用H&E染色，以200倍放大倍率拍照。

具体实施方式

在一些实施方式中，公开了呈共价连接的三聚体形式的来自RNA病毒的重组可溶性表面抗原的组合物和使用方法。在一些实施方式中，所产生的融合蛋白作为二硫键连接的同三聚体分泌，其在结构上更稳定，同时保留了天然样三聚体病毒抗原的构象，因此可以用作针对这些危险病原体的更有效的疫苗。

在一些实施方式中，本文公开了使用病毒抗原三聚体作为疫苗或作为多价疫苗的一部分来预防病毒感染的方法，所述方法使用或不使用佐剂或使用超过一种佐剂，任选地通过肌肉内注射或鼻内给药。

在一些实施方式中，本文公开了使用病毒抗原三聚体作为抗原，通过检测识别所述病毒抗原的抗体例如IgM或IgG如中和抗体来诊断病毒感染的方法。

在一些实施方式中，本文公开了使用病毒抗原三聚体作为抗原来产生可用于被动免疫的多克隆或单克隆抗体，例如用于治疗婴儿RSV感染的中和mAb的方法。

在一些实施方式中，本文公开了一种作为疫苗或作为多价疫苗一部分的病毒抗原三聚体，其中所述疫苗包括多种三聚体亚单位疫苗，所述多种三聚体亚单位疫苗包含同一病毒蛋白的的病毒抗原或包含一种或多种病毒或者同一病毒的一种或多种毒株的两种或更多种不同蛋白质的病毒抗原。

在一些实施方式中，本文公开了一种包含本文公开的病毒抗原三聚体的单价疫苗。在一些实施方式中，本文公开了一种包含本文公开的病毒抗原三聚体的二价疫苗。在一些实施方式中，本文公开了一种包含本文公开的病毒抗原三聚体的三价疫苗。在一些实施方式中，本文公开了一种包含本文公开的病毒抗原三聚体的四价疫苗。

在一些实施方式中，本文公开了一种包含本文公开的F三聚体的单价疫苗。在一些实施方式中，本文公开了一种包含本文公开的F三聚体的二价疫苗。在一些实施方式中，本文公开了一种包含至少一种包含第一F蛋白抗原的F三聚体和至少一种包含第二F蛋白抗原的F三聚体的二价疫苗。在一些实施方式中，所述第一和第二F蛋白抗原来自于一种或多种病毒物种或毒株/亚型的相同F蛋白，或者来自一种或多种病毒物种或同一病毒物种的一种或多种毒株/亚型的两种或更多种不同的F蛋白。在一些实施方式中，本文公开了一种包含本文公开的F三聚体的三价疫苗。在一些实施方式中，本文公开了一种包含至少一种包含第一F蛋白抗原的F三聚体、至少一种包含第二F蛋白抗原的F三聚体，以及至少一种包含第三F蛋白抗原的F三聚体的三价疫苗。在一些实施方式中，所述第一、第二和第三F蛋白抗原来自于一种或多种病毒物种或毒株/亚型的相同F蛋白，或来自于一种或多种病毒物种或者同一病毒物种的一种或多种毒株/亚型的两种、三种或更多种不同的F蛋白。在一些实施方式中，本文公开了一种包含本文公开的F三聚体的四价疫苗。在一些实施方式中，本文公开了一种包含至少一种包含第一F蛋白抗原的F三聚体、至少一种包含第二F蛋白抗原的F三聚体、至少一种包含第三F蛋白抗原的F三聚体，以及至少一种包含第四F蛋白抗原的F三聚体的四价疫苗。在一些实施方式中，所述第一、第二、第三和第四F蛋白抗原来自于一种或多种病毒物种或毒株/亚型的相同F蛋白，或来自于一种或多种病毒物种或者同一病毒物种的一种或多种毒株/亚型的两种、三种、四种或更多种不同的F蛋白。

本文提供了用于例如预防性、治疗性治疗RSV感染的包含RSV病毒抗原或免疫原的融合肽和蛋白质的免疫原性组合物、方法和用途。呼吸道合胞病毒(RSV)被视为婴儿和幼儿急性下呼吸道感染(ALRTI)的主要原因，每年在全世界造成7,000至20,000多名儿童死亡。RSV感染是发展中国家婴儿死亡的第二大常见原因。此外，RSV可以在老年人和免疫受损人群中导致严重疾病。尽管RSV引起了疾病负荷，但目前还没有获得批准的疫苗。有效的预防性人源化mAb帕利珠单抗

尽管进行了数十年研究，但RSV疫苗开发由于种种原因一直不成功。例如，RSV候选疫苗的生产、稳定性和有效性问题一直难以克服，特别地，安全性是一个主要问题，因为人们认识到福尔马林灭活RSV(FI-RSV)疫苗介导疫苗诱导的疾病增强(VED)。

本文所提供的包含RSV病毒抗原和免疫原的蛋白质，包括重组多肽和融合蛋白，可用于有效且安全地治疗(例如治疗性地、预防性地)RSV感染。例如，本文提供的包含RSV病毒抗原和免疫原的蛋白质治疗RSV感染，而无需考虑VED和/或抗体依赖性增强(ADE)。此外，本文所提供的包含RSV病毒抗原和免疫原的蛋白质容易生产，并在高胁迫条件如高温、极端pH以及高渗透压和低渗透压下表现出稳定性。因此，本文所提供的蛋白质和免疫原性组合物规避并满足了阻碍RSV疫苗开发的生产、稳定性、安全性和有效性问题。

在一些方面，本文所提供的RSV病毒抗原和免疫原包含RSV糖蛋白(F)，本文也称为RSV F蛋白肽或肽。RSV F蛋白肽是一种介导膜和病毒渗透到宿主细胞中的同三聚体I型跨膜蛋白。RSV F蛋白肽合成为F0原蛋白前体，在两个位点被弗林蛋白酶切割后转化为二硫键连接的F1和F2成熟形式。RSV F蛋白肽在RSV A和B毒株间高度保守。中和抗体如帕利珠单抗靶向F的抗原位点，并对RSV感染引起的呼吸道疾病提供保护。

在一些实施方式中，包含RSV病毒抗原或免疫原的蛋白质，例如RSV F蛋白肽，能够产生免疫应答，例如对RSV F肽蛋白的免疫应答。在一些实施方式中，免疫应答抑制或减少受试者例如患者中RSV的复制。在一些实施方式中，免疫应答包括产生一种或多种中和抗体，如多克隆和/或单克隆抗体。在一些实施方式中，中和抗体抑制或减少受试者例如患者中RSV的复制。在一些实施方式中，向受试者给药蛋白质(例如呈免疫原性组合物形式)不会因受试者先前暴露于RSV而导致抗体依赖性增强(ADE)。在一些方面，包含RSV病毒抗原和免疫原，例如RSV F蛋白肽的蛋白质用作疫苗。

在一些实施方式中，RSV病毒抗原和免疫原，例如RSV F蛋白肽，连接到蛋白质或肽以形成融合蛋白或重组多肽。在一些实施方式中，RSV病毒抗原或免疫原所连接的蛋白质或肽能够与蛋白质或肽，如融合蛋白或重组多肽的蛋白质或肽缔合，例如共价或非共价连接。因此，在一些情况下，RSV病毒抗原或免疫原所连接的蛋白质或肽是多聚体化结构域。

在一些实施方式中，RSV病毒抗原和免疫原，如RSV F蛋白肽，连接到胶原蛋白前肽，如胶原蛋白前肽C端，以形成融合肽或重组多肽。因此，在一些实施方式中，本文所提供的蛋白质包含重组多肽，所述重组多肽含有连接到胶原蛋白C端前肽的RSV病毒抗原和免疫原，例如RSV F蛋白肽或其片段或表位。在一些实施方式中，胶原蛋白前肽来源于人α1胶原蛋白C前肽，并能够自身三聚化。

在一些实施方式中，将RSV病毒抗原和免疫原，如RSV F蛋白肽连接到胶原蛋白前肽，如胶原蛋白前肽C端，有助于蛋白质产生免疫应答的能力。例如，重组蛋白的产生可以保留RSV F蛋白肽的三级和四级结构，这可能对RSV F蛋白肽的天然构象的稳定性，进而对能够诱导免疫应答的蛋白质(例如中和抗体)的表面上抗原位点的可及性很重要。此外，将RSVF蛋白肽连接到能够自身三聚化的蛋白质或肽允许重组蛋白聚集，从而模拟病毒包膜上的RSV F蛋白肽的天然同三聚体结构。

在一些实施方式中，将RSV F蛋白肽连接到胶原蛋白C端前肽产生了自身三聚化的重组多肽。在一些实施方式中，本文提供的蛋白质包含多个自身三聚化的RSV F蛋白肽和胶原蛋白重组多肽的前肽，任选地其中所述多个重组蛋白形成了例如莲座状(参见例如图2B)的结构。在一些实施方式中，重组蛋白的三聚体特性有助于蛋白质的稳定性。在一些实施方式中，多个自身三聚化重组蛋白的宏观结构(例如莲座状)有助于蛋白质的稳定性。在一些实施方式中，重组蛋白的三聚体特性和多个自身三聚化重组蛋白的宏观结构(例如莲座状)有助于蛋白质的稳定性。在一些实施方式中，重组蛋白的三聚体特性有助于蛋白质产生免疫应答的能力。在一些实施方式中，多个自身三聚化重组蛋白的宏观结构(例如莲座状)有助于蛋白质产生免疫应答的能力。在一些实施方式中，重组蛋白的三聚体特性和多个自身三聚化重组蛋白的宏观结构有助于蛋白质产生免疫应答的能力。

本文还提供了包含本文所提供的蛋白质的免疫原性组合物，产生本文所提供的蛋白质的方法，用本文所提供的蛋白质和组合物治疗受试者的方法，以及试剂盒。

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本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应被视为限制所述主题。

I.病毒抗原和免疫原

呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿急性下呼吸道感染的最常见原因，也是老年人的主要疾病负荷。尽管在半个世纪前就表征了RSV病毒，但目前还没有针对RSV的疫苗，而且20世纪60年代给药福尔马林灭活RSV的儿童中疫苗介导的疾病增强阻碍了开发工作。在RSV候选疫苗的抗原生产、纯度、稳定性和效力方面的挑战也一直是开发的障碍。

在一些实施方式中，本文所提供的蛋白质包含RSV病毒抗原和/或免疫原。在一些实施方式中，RSV病毒抗原和/或免疫原能够促进或刺激细胞介导应答和/或体液应答。在一些实施方式中，应答(例如细胞介导应答或体液应答)包括产生抗体，例如中和抗体。在一些实施方式中，针对病毒抗原和/或免疫原的中和抗体(NAb)通过阻断易感细胞的感染提供了针对RSV暴露的适应性免疫防御。在一些实施方式中，疫苗针对若干种病毒的功效归因于和/或与其诱导NAb的能力相关。在一些实施方式中，RSV病毒抗原或免疫原是本文所公开的RSV F蛋白肽。

RSV F蛋白肽是呼吸道合胞病毒(RSV)的包膜糖蛋白。RSV F蛋白肽翻译为单一前体多肽(命名为F0)。RSV F蛋白介导病毒进入细胞中和细胞与细胞融合，是中和抗体的靶标，并且在RSV A和B毒株间高度保守。F0可以在Arg109和Arg136处被细胞弗林蛋白酶切割为三个片段，较短的F2多肽在N端通过两个二硫键共价连接到较长的F1多肽，后者具有在N端的18个氨基酸的融合结构域和在C端附近的疏水性跨膜区；并释放中间的27个氨基酸的片段。中和单克隆抗体帕利珠单抗和莫他珠单抗(motavizumab)结合到RSV F抗原位点II(Asn258-Val278)，并且已经被证明对高风险和足月婴儿的下呼吸道和上呼吸道RSV疾病具有保护作用。结合这些中和抗体的RSV F表位多肽的结构比线性肽大，帕利珠单抗以纳摩尔亲和力而莫他珠单抗以皮摩尔亲和力与RSV F结合。建模预测完全程度的帕利珠单抗和莫他珠单抗结合分别需要来自一个或两个RSV F原聚体的氨基酸。因此，保留RSV F三级和四级结构在开发保留该重要中和区域的天然构象的RSV F疫苗中可能非常重要。

在一些实施方式中，所述F0前体多肽的长度为574个氨基酸，如SEQ ID NO:31所示。

在一些实施方式中，所述F0前体多肽的长度为574个氨基酸，如SEQ ID NO:32所示。

在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含残基102处的脯氨酸或丙氨酸。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基102处和/或附近的替换、缺失和/或插入。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含残基218处的谷氨酸或丙氨酸。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基218处和/或附近的替换、缺失和/或插入。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含残基379处的缬氨酸或异亮氨酸。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基379处和/或附近的替换、缺失和/或插入。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含残基447处的缬氨酸或甲硫氨酸。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基447处和/或附近的替换、缺失和/或插入。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含残基102处的脯氨酸或丙氨酸、残基218处的谷氨酸或丙氨酸、残基379处的缬氨酸或异亮氨酸和残基447处的缬氨酸或甲硫氨酸中的任一个或多个处和/或附近的替换、缺失和/或插入。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基102、218、379和447中任一个或多个处和/或附近的替换、缺失和/或插入。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的其它残基中任一个或多个处和/或附近的替换、缺失和/或插入。

在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基106、107、108和/或109处和/或附近的替换、缺失和/或插入。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含残基108和/或109处的谷氨酰胺或天冬酰胺。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含残基108和109处的谷氨酰胺。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含残基108和109处的天冬酰胺。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基131、132、133、134、135和/或136处和/或附近的替换、缺失和/或插入。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基131、132、133、134、135和/或136处和/或附近的甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基131、132、133、134、135和/或136处的谷氨酰胺。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基133、135和136处的谷氨酰胺。

在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基109、136、161和/或215处和/或附近的替换、缺失和/或插入。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基109、136、161和/或215中任一个或多个处的丙氨酸或脯氨酸。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基109处的丙氨酸。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基136处的丙氨酸。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基109和136处的丙氨酸。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基161处的脯氨酸。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基215处的脯氨酸。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基161和215处的脯氨酸。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基109和136处的丙氨酸以及残基161和215处的脯氨酸。

在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基131-154中任一个或多个处和/或附近的替换、缺失和/或插入。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基131-154中的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个或更多个的缺失。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基137-154中任一个或多个的缺失。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基137-146中任一个或多个的缺失。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含SEQ ID NO:31或32的残基133、135和136处的谷氨酰胺和残基137-146的缺失。

在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含F0前体的氨基酸1-25，其是信号肽MELLILKANAITTILTAVTFCFASG(SEQ ID NO:33)。在一些实施方式中，所述前体多肽F0形成了前体三聚体。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽被一个或多个细胞蛋白酶水解切割，例如在保守弗林蛋白酶一致切割位点处，以产生Pep 27多肽(也称为p27)、F1多肽和F2多肽。在一些实施方式中，Pep 27多肽(例如，F0前体的氨基酸110-136)被切除，在一些方面，没有成为成熟RSV F三聚体的一部分。在一些实施方式中，F2多肽(本文可以替代地称为“F2”或“F2亚单位肽”)包含F0前体的氨基酸残基26-109。在一些实施方式中，F1多肽(本文可替代地称为“F1”或“F1亚单位肽”)包含F0前体的氨基酸残基137-574，并可包含细胞外区(例如残基137-524)、跨膜结构域(例如残基525-550)和胞质结构域(例如残基551-574)。

在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含F1和F2多肽，二者通过二硫键连接以形成异二聚体，称为RSV F“原聚体”。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽包含形成RSVF三聚体的三个原聚体，因此它是所述三个原聚体的同三聚体。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽是成熟RSV F三聚体。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽是膜结合型。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽不是膜结合型。在一些实施方式中，本文的RSV F蛋白肽是可溶性的并缺乏跨膜区和胞质区或其片段。例如，可以通过在氨基酸513(通过去除514起的氨基酸)、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523或524处截短RSV F蛋白来实现向可溶性形式转化。在自然界中，成熟RSV F三聚体介导病毒和细胞膜融合。成熟RSV F三聚体的融合前构象(本文可称为“pre-F”或融合前)高度不稳定(亚稳定)。然而，一旦RSV病毒与细胞膜对接后，RSV F蛋白三聚体就进行一系列构象变化并过渡到高度稳定的融合后(“post-F”)构象。

在一些实施方式中，RSV病毒抗原或免疫原包含信号肽(SP)(例如SEQ ID NO:31或32的氨基酸1-22)或其片段和/或突变序列、七肽重复序列C(HRC)(例如F2，它可以是SEQ IDNO:31或32的氨基酸23-109)或其片段和/或突变序列、弗林蛋白酶切割位点(FCS)(例如在SEQ ID NO:31或32的氨基酸109/110之间的交界处)或其片段和/或突变序列、27聚体片段(pep27)(例如SEQ ID NO:31或32的氨基酸110-136)或其片段和/或突变序列、推定融合肽(FP)(例如SEQ ID NO:31或32的氨基酸137-155)或其片段和/或突变序列、七肽重复序列A(HRA)(例如SEQ ID NO:31或32的氨基酸156-214)或其片段和/或突变序列、结构域I和II(例如SEQ ID NO:31或32的氨基酸215-476)或其片段和/或突变序列、七肽重复序列B(HRB)(例如SEQ ID NO:31或32的氨基酸477-524)或其片段和/或突变序列、跨膜(TM)结构域(例如，SEQ ID NO:31或32的氨基酸525-550)或其片段和/或突变序列、和/或胞质(CP)结构域(例如，SEQ ID NO:31或32的氨基酸551-574)或其片段和/或突变序列的任何合适的组合。

在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原是RSV A亚型的RSV F蛋白肽。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原是RSV A2亚型的RSV F蛋白肽。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原是RSV B亚型的RSV F蛋白肽。在一些情况下，所述RSV F蛋白肽在RSV亚型间保守。

在一些情况下，所述RSV病毒抗原或免疫原是RSV F蛋白肽的片段。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原是RSV F蛋白肽的表位。在一些实施方式中，所述表位是线性表位。在一些实施方式中，所述表位是构象表位。在一些实施方式中，所述表位是中和表位位点，例如位点I、II或IV。在一些实施方式中，RSV F蛋白肽或其片段的所有中和表位都作为RSV病毒抗原或免疫原存在。

在一些情况下，例如当所述RSV病毒抗原或免疫原是RSV F蛋白肽的片段时，仅存在所述RSV F蛋白肽的单个亚单位。

在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原是或包含F1亚单位肽。在一些实施方式中，所述F1亚单位肽是或包含野生型F蛋白的137-574的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原是或包含F2亚单位肽。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含含有信号肽、七肽重复序列C(HRC)肽、pep27肽、融合肽(FP)、七肽重复序列A(HRA)肽、结构域I肽、结构域II肽或七肽重复序列B(HRB)肽或其任何组合的RSV F蛋白肽。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含含有信号肽的RSV F蛋白肽。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含含有pep27肽的RSV F蛋白肽。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含含有融合肽(FP)(又称为融合结构域(FD))的RSV F蛋白肽。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含含有信号肽、pep27肽和融合肽(FP)的RSV F蛋白肽。

在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含含有F蛋白的F1亚单位和F2亚单位的RSV F蛋白肽。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含含有F蛋白的F1亚单位肽和F2亚单位肽而不含pep 27肽的RSV F蛋白肽。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含含有F蛋白的F1亚单位肽、F2亚单位肽和pep 27肽的RSV F蛋白肽。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含含有F蛋白的F1亚单位肽、F2亚单位肽、pep 27肽和FP的RSV F蛋白肽。

在一些情况下，例如当所述病毒抗原或免疫原包含RSV F蛋白肽的F1亚单位肽和F2亚单位肽二者时，F1和F2亚单位是连接的。在一些实施方式中，F1和F2亚单位通过二硫键连接。在一些实施方式中，F1和F2亚单位通过人工引入的连接物连接。在一些实施方式中，F1和F2亚单位通过pep27肽连接。例如，在一些实施方式中，从N端到C端的方向是或包含F2-pep27-F1。在一些实施方式中，从N端到C端的方向是或包含F2-pep27-FP-F1(F2-pep27-FD-F1)。在一些实施方式中，FP被视为F1亚单位肽的结构特征。

在一些情况下，RSV病毒抗原或免疫原是不含跨膜(TM)结构域肽的RSV F蛋白肽。在一些情况下，所述RSV F蛋白不含胞质(CP)结构域肽。在一些情况下，所述RSV F蛋白不含TM结构域肽或CP结构域肽。

在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含含有蛋白酶切割位点的RSV F蛋白肽。在一些实施方式中，所述蛋白酶切割位点对蛋白酶弗林蛋白酶的切割特异。在一些实施方式中，所述蛋白酶切割位点对蛋白酶胰蛋白酶的切割特异。在一些实施方式中，所述蛋白酶切割位点对蛋白酶因子Xa的切割特异。在一些实施方式中，所述蛋白酶切割位点对蛋白酶组织蛋白酶L的切割特异。

在一些情况下，所述RSV病毒抗原或免疫原包含不含蛋白酶切割位点的RSV F蛋白肽。在一些情况下，所述RSV病毒抗原或免疫原包含不含对蛋白酶弗林蛋白酶的切割特异的蛋白酶切割位点的RSV F蛋白肽。在一些情况下，所述RSV病毒抗原或免疫原包含不含对蛋白酶胰蛋白酶的切割特异的蛋白酶切割位点的RSV F蛋白肽。在一些情况下，所述RSV病毒抗原或免疫原包含不含对蛋白酶因子Xa的切割特异的蛋白酶切割位点的RSV F蛋白肽。在一些情况下，所述RSV病毒抗原或免疫原包含不含对蛋白酶组织蛋白酶L的切割特异的蛋白酶切割位点的RSV F蛋白肽。

在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含可溶性RSV F蛋白肽。在一些实施方式中，所述可溶性RSV F蛋白肽缺乏TM结构域肽和CP结构域肽。在一些实施方式中，所述可溶性RSV F蛋白肽不结合到脂质双分子层，如膜或病毒包膜。

在一些实施方式中，所述RSV F蛋白肽由经过密码子优化的核酸序列产生。在一些实施方式中，所述RSV F蛋白肽由未经过密码子优化的核酸序列产生。

在一些实施方式中，所述RSV F蛋白肽可以包含本领域已知的任何F蛋白序列，如美国专利号10,017,543公开的那些序列，该美国专利出于所有目的以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原是或包含具有SEQ ID NO:31或32的1-520的氨基酸序列的RSV F蛋白肽。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原是或包含具有SEQ ID NO:31或32的26-520的氨基酸序列的RSV F蛋白肽。

在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原是或包含F2的序列、pep27的序列和F1的序列(如F2-pep27-F1)。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含融合肽暴露并具有融合后构象。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含弗林蛋白酶切割位点突变。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含弗林蛋白酶位点I突变(例如R109A)和/或弗林蛋白酶位点II突变(例如R136A)，在这些实例中的一些中，所述RSV病毒抗原或免疫原具有融合后构象，而在其它实例中，所述RSV病毒抗原或免疫原具有融合前构象。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含弗林蛋白酶位点I突变和弗林蛋白酶位点II突变(例如R109A/R136A)，在这些实例中的一些中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含全长F0，无融合肽暴露并具有融合前构象。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含一个或多个突变，所述突变防止形成长螺旋和/或稳定α4-α5铰链环。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含一个或多个突变，所述突变保留融合前构象。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含一个或多个突变，所述突变改善了表达。在一些实施方式中，位置161、182和215的替换(例如，用脯氨酸)引起更高表达水平，E161P和S215P还增加了蛋白质稳定性。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含E161P和/或S215P并具有融合前构象。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原包含R109A、R136A、E161P和/或S215P并具有融合前构象。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:17所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:17的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:18所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:18的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:19所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:19的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:20所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:20的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:21所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:21的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:22所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:22的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:23所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:23的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:24所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:24的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:25所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:26所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:27所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:27的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:28所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:28的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:29所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:29的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:30所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:30的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:31所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:31的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:32所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:32的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:33所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:33的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:34所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:34的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:35所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ IDNO:35的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:36所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:36的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:37所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:37的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:38所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:38的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:39所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:39的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:40所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:40的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:41所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:41的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:42所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:42的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:43所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:43的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:44所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:44的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:45所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:45的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:46所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:46的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含SEQ ID NO:47所示的序列。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原包含与SEQ ID NO:47的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置上包含替换、缺失和/或插入的序列。

在一些实施方式中，本文的病毒抗原或免疫原可以包含RSV糖蛋白(G)或其片段、变体或突变体；RSV小疏水性蛋白(SH)或其片段、变体或突变体；RSV融合蛋白(F)或其片段、变体或突变体；RSV基质蛋白(M)或其片段、变体或突变体；RSV核蛋白(N)或其片段、变体或突变体；RSV磷蛋白(P)或其片段、变体或突变体；RSV“大”蛋白(L)或其片段、变体或突变体；M2-1蛋白或其片段、变体或突变体；RSV M2-2蛋白或其片段、变体或突变体；RSV NS-1蛋白或其片段、变体或突变体；或RSV Ns-2蛋白或其片段、变体或突变体；或其任何组合。

在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原由经过密码子优化的核酸序列产生。在一些实施方式中，所述病毒抗原或免疫原由未经过密码子优化的核酸序列产生。

在一些实施方式中，本文所提及的RSV病毒抗原或免疫原可以包括包含所述病毒抗原或免疫原的重组多肽或融合多肽。术语病毒抗原或免疫原可用于指包含RSV病毒抗原或免疫原的蛋白质。在某些情况下，所述RSV病毒抗原或免疫原是如本文所提供的RSV蛋白肽。

II.重组肽和蛋白质

设想了本文提供的RSV病毒抗原和免疫原，例如RSV F蛋白肽(参见第I节)可以与其它蛋白质或肽组合，例如连接，以形成重组多肽，包括融合肽。在一些实施方式中，本文提供的个体重组多肽(例如单体)缔合形成重组多肽的多聚体，例如三聚体。在一些实施方式中，个体重组多肽单体的缔合通过共价相互作用发生。在一些实施方式中，个体重组多肽单体的缔合通过非共价相互作用发生。在一些实施方式中，相互作用(例如共价或非共价)受RSV病毒抗原或免疫原(例如RSV F蛋白肽)所连接的蛋白质或肽影响。在一些实施方式中，例如当RSV病毒抗原或免疫原是如本文所述的RSV F蛋白肽时，可以选择其将要连接的蛋白质或肽，以便保留糖蛋白的天然同三聚体结构。这可能有利于激起对RSV F蛋白肽的强烈且有效的免疫原性应答。例如，保留和/或保持RSV病毒抗原或免疫原(例如RSV F蛋白肽)的天然构象可以改善或允许接近能够产生免疫应答的抗原位点。在一些情况下，包含本文所述的RSV F蛋白肽(例如参见第I节)的重组多肽在本文中替代地称为重组RSV F抗原、重组RSVF免疫原或重组RSV F蛋白。

还设想了在一些情况下，所述重组多肽或其多聚化重组多肽聚集或可以聚集以形成包含多个RSV病毒抗原和/或免疫原重组多肽的蛋白质。此类蛋白质的形成可能有利于对RSV病毒抗原和/或免疫原产生强烈且有效的免疫原性应答。例如，包含多个重组多肽的蛋白质的形成以及因此多个RSV病毒抗原(例如RSV F蛋白肽)的形成可以保留病毒抗原的三级和/或四级结构，从而允许加强针对天然结构的免疫应答。在一些情况下，聚集可以赋予RSV病毒抗原或免疫原结构稳定性，进而可以接近能够促进免疫应答的潜在抗原位点。

1.融合肽和重组多肽

在一些实施方式中，RSV病毒抗原或免疫原可以在其C端连接(C端连接)到三聚化结构域，以促进单体三聚化。在一些实施方式中，三聚化稳定了呈三聚体构象的RSV病毒抗原或免疫原(例如RSV F蛋白肽)的膜近端状况。

促进可溶性重组蛋白稳定三聚体的外源多聚化结构域的非限制性实例包括：GCN4亮氨酸拉链(Harbury等人,1993 Science 262:1401-1407)、来自肺表面活性蛋白的三聚化基序(Hoppe等人,1994 FEBS Lett 344:191-195)、胶原蛋白(McAlinden等人,2003 J BiolChem 278:42200-42207)和噬菌体T4次要纤维蛋白折叠子(Miroshnikov等人,1998Protein Eng 11:329-414)，其中任一种都可以连接到本文所述的重组RSV病毒抗原或免疫原(例如，通过连接到RSV F肽的C端)，以促进重组病毒抗原或免疫原的三聚化。另参见美国专利号7,268,116、7,666,837、7,691,815、10,618,949、10,906,944和10,960,070，以及US2020/0009244，这些专利出于所有目的以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方式中，可以使用一个或多个肽连接物(如gly-ser连接物，例如10个氨基酸的甘氨酸-丝氨酸肽连接物)连接重组病毒抗原或免疫原与多聚化结构域。所述三聚体可以包括本文所述的任何稳定化突变(或其组合)，只要重组病毒抗原或免疫原三聚体保留所需特性(例如，融合前构象)即可。

为了在治疗上可行，用于生物药物设计的所需的三聚化蛋白部分应当满足以下标准。理想地，它应当是天然分泌蛋白质的一部分，如免疫球蛋白Fc，在循环中也很丰富(无毒)，来源于人类(缺少免疫原性)，相对稳定(半衰期长)，并能够有效地自身三聚化(通过链间共价二硫键加强)，因此三聚化RSV病毒抗原或免疫原结构稳定。

胶原蛋白属于纤维蛋白家族，是细胞外基质的主要组分。它是哺乳动物中最丰富的蛋白质，占体内总蛋白质的近25％。胶原蛋白在骨骼、肌腱、皮肤、角膜、软骨、血管和牙齿形成中起主要结构作用。胶原蛋白I、II、III、IV、V和XI的纤维类型都合成为较大的三聚体前体，称为前胶原蛋白，其中由数百个“G-X-Y”重复序列(或甘氨酸重复序列)组成的中心不间断三螺旋结构域侧接有非胶原结构域(NC)、N前肽和C前肽。C端和N端延伸在前胶原蛋白分泌后都受到蛋白水解处理，这一事件触发了成熟蛋白组装成胶原蛋白原纤维，由此形成不溶性细胞基质。BMP-1是一种蛋白酶，它识别甘氨酸重复序列与胶原蛋白C前结构域之间的交界附近的前胶原蛋白的特定肽序列，并负责除去前肽。发现I型胶原蛋白的脱落三聚体C前肽在正常成年人类血清中的浓度在50-300ng/mL的范围内，儿童的水平高得多，表明骨形成活跃。在具有家族性高血清I型胶原蛋白C前肽浓度的人中，所述水平可以高达1-6μg/mL，无明显异常，表明C前肽无毒。对胶原蛋白三聚体C前肽的结构研究表明，它是一种三叶结构，其中所有三个亚单位在其N端附近的联结区中聚在一起，连接到前胶原蛋白分子的其余部分。这种待融合的蛋白质在一个方向上伸出的几何形状类似于Fc二聚体的几何形状。

I型、IV型、V型和XI型胶原蛋白主要组装成由两个α-1链和一个α-2链(对于I型、IV型、V型)或三个不同的序列上高度同源的链(对于XI型)组成的异源三聚体形式。II型和III型胶原蛋白都是α-1链的同三聚体。对于I型胶原蛋白这种最丰富的胶原蛋白形式，也形成稳定的α(I)同三聚体，并以可变水平存在于不同的组织中。这些胶原蛋白C前肽链中大部分当单独在细胞中过度表达时可以自身组装成同三聚体。虽然首先合成N前肽结构域，但分子组装成三聚体胶原蛋白始于C前肽的相互配准缔合。认为C前肽复合物通过形成链间二硫键来稳定化，但二硫键形成对于适合的链配准的必要性还不清楚。重复甘氨酸三螺旋，然后以拉链样方式从缔合的C端传播到N端。这一认识已经通过使用重组DNA技术交换不同胶原蛋白链的C前肽而产生了非天然类型的胶原蛋白基质。非胶原蛋白如细胞因子和生长因子也被融合到原胶原蛋白或成熟胶原蛋白的N端以形成新的胶原蛋白基质，此举旨在允许非胶原蛋白从细胞基质缓慢释放。然而，在这两种情况下，都需要在重组胶原蛋白原纤维组装成不溶性细胞基质之前切割C前肽。

尽管以前已描述其他蛋白质三聚化结构域例如来自于酵母的GCN4、噬菌体T4的次要纤维蛋白和大肠杆菌(Escherichia coli)的天冬氨酸转氨甲酰酶的三聚化结构域允许异源蛋白的三聚化，但这些三聚化蛋白质均不是天然的人类蛋白，它们也不是天然分泌的蛋白质。因此，任何三聚体融合蛋白都必须在细胞内产生，这不仅可能导致天然分泌蛋白(如可溶性受体)折叠不正确，而且还使得难以从数以千计的其它细胞内蛋白中纯化这种融合蛋白。此外，使用这种非人类蛋白质三聚化结构域(例如来自酵母、噬菌体和细菌)进行三聚体生物药物设计的致命缺点是它们在人体中的假定免疫原性，使得这种融合蛋白在它们注射到人体中后不久就变得无效。

因此，如本文所述在重组多肽中使用胶原蛋白具有许多优点，包括：(1)胶原蛋白是哺乳动物体内分泌的最丰富的蛋白质，占体内总蛋白质的近25％；(2)胶原蛋白的主要形式自然作为三聚体螺旋存在，它们的球状C前肽负责引发三聚化；(3)发现成熟胶原蛋白水解释放的胶原蛋白三聚体C前肽自然以亚微克/毫升水平存在于哺乳动物血液中，并且已知对身体无毒性；(4)胶原蛋白的线性三螺旋区域可以作为连接物包括在内，预测每个残基的间距为

在一些实施方式中，RSV病毒抗原或免疫原连接到胶原蛋白C端前肽以形成重组多肽。在一些实施方式中，所述重组多肽的C端前肽形成了多肽间二硫键。在一些实施方式中，所述重组蛋白质形成了三聚体。在一些实施方式中，所述RSV病毒抗原或免疫原是如第I节所述的RSV F蛋白肽。

在一些实施方式中，所述C端前肽属于人类胶原蛋白。在一些实施方式中，所述C端前肽包含proα1(I)、proα1(II)、proα1(III)、proα1(V)、proα1(XI)、proα2(I)、proα2(V)、proα2(XI)或proα3(XI)的C端多肽或其片段。在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含proα1(I)的C端多肽。

在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是与SEQ ID NO:48的序列具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是与SEQ ID NO:49的序列具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽呈现与SEQID NO:50的序列具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是与SEQ ID NO:51的序列具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是与SEQ ID NO:52的序列具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是与SEQ ID NO:53的序列具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是与SEQ ID NO:54的序列具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是与SEQ ID NO:55的序列具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是与SEQ IDNO:56的序列具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是与SEQ ID NO:57的序列具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是与SEQ ID NO:58的序列具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含SEQID NO:59所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是与SEQ ID NO:59的序列具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是与SEQ ID NO:60的序列具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是与SEQ ID NO:61的序列具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是与SEQ IDNO:62的序列具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述C端前肽是与SEQ ID NO:63的序列具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含胶原蛋白三聚化结构域(例如，人α1(I)胶原蛋白的C前肽)的氨基酸序列，其中BMP-1位点中天冬氨酸(D)替换为天冬酰胺(N)，例如其中RA

在一些实施方式中，所述C端前肽是或包含作为SEQ ID NO:48-63中任一个的片段的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述C端前肽可以包含含有甘氨酸-X-Y重复序列的序列，其中X和Y独立地为任何氨基酸，或与其具有至少85％、90％、92％、95％或97％同一性，能够形成多肽间二硫键并使所述重组多肽三聚化的氨基酸序列。在一些实施方式中，X和Y独立地为脯氨酸或羟脯氨酸。

在其中RSV F肽蛋白(例如RSV病毒抗原或免疫原，例如参见第I节)连接到C端前肽以形成重组多肽的一些情况下，，所述重组多肽形成了三聚体，从而产生RSV F蛋白肽的同三聚体。在一些实施方式中，三聚化重组多肽含有拐杖形棒状的F蛋白肽三聚体。在一些实施方式中，三聚化重组多肽的RSV F蛋白肽呈融合前构象。在一些实施方式中，三聚化重组多肽的RSV F蛋白肽呈融合后构象。在一些实施方式中，所述构象状态允许接近F蛋白肽上的不同抗原位点。在一些实施方式中，所述抗原位点是表位，如线性表位或构象表位。具有所述三聚化重组多肽的一个优点是可以加强针对各种潜在不同抗原位点的免疫应答。

在一些实施方式中，三聚化重组多肽包括含有相同病毒抗原或免疫原的个体重组多肽。在一些实施方式中，三聚化重组多肽包括各自包含与其他重组多肽不同的病毒抗原或免疫原的个体重组多肽。在一些实施方式中，三聚化重组多肽包括个体重组多肽，其中所述个体重组多肽之一包含不同于其它重组多肽的病毒抗原或免疫原。在一些实施方式中，三聚化重组多肽包括个体重组多肽，其中所述个体重组多肽中的两个包含相同病毒抗原或免疫原，并且所述病毒抗原或免疫原不同于其余重组多肽所包含的病毒抗原或免疫原。

在一些实施方式中，所述重组多肽包含第I节所述的任何RSV病毒抗原或免疫原。在一些实施方式中，所述重组多肽包括第I节所述的任何RSV病毒抗原或免疫原，其如本文所述那样连接到如本文所述的胶原蛋白C端前肽。

在一些实施方式中，所述重组多肽或所述融合蛋白包含连接到SEQ ID NO:48-63中任一个所示的第二序列的SEQ ID NO:17-47中任一个所示的第一序列，其中所述第一序列的C端直接连接到所述第二序列的N端。

在一些实施方式中，所述重组多肽或所述融合蛋白包含连接到SEQ ID NO:48-63中任一个所示的第二序列的SEQ ID NO:17-47中任一个所示的第一序列，其中所述第一序列的C端间接地连接到所述第二序列的N端，例如通过连接物。在一些实施方式中，所述连接物包含含有甘氨酸-X-Y重复序列的序列。

在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:1所示的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置如102、106、107、108、109、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、161、215、218、379或447(相对于SEQ ID NO:31或32的氨基酸位置)或其任何组合上包含替换、缺失和/或插入的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:1的变体，所述变体包括选自P102A、R109A、R136A、E161P、E218A、S215P、I379A和M447V的任一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变或其任何组合。

在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:2所示的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置如102、106、107、108、109、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、161、215、218、379或447(相对于SEQ ID NO:31或32的氨基酸位置)或其任何组合上包含替换、缺失和/或插入的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:2的变体，所述变体包括选自P102A、R109A、R136A、E161P、E218A、S215P、I379A和M447V的任一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变或其任何组合。

在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:3所示的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置如102、106、107、108、109、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、161、215、218、379或447(相对于SEQ ID NO:31或32的氨基酸位置)或其任何组合上包含替换、缺失和/或插入的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:3的变体，所述变体包括选自P102A、R109A、R136A、E161P、E218A、S215P、I379A和M447V的任一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变或其任何组合。

在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:4所示的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含与SEQ ID NO:4的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置如102、106、107、108、109、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、161、215、218、379或447(相对于SEQ ID NO:31或32的氨基酸位置)或其任何组合上包含替换、缺失和/或插入的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:4的变体，所述变体包括选自P102A、R109A、R136A、E161P、E218A、S215P、I379A和M447V的任一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变或其任何组合。

在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:5所示的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含与SEQ ID NO:5的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置如102、106、107、108、109、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、161、215、218、379或447(相对于SEQ ID NO:31或32的氨基酸位置)或其任何组合上包含替换、缺失和/或插入的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:5的变体，所述变体包括选自P102A、R109A、R136A、E161P、E218A、S215P、I379A和M447V的任一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变或其任何组合。

在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:6所示的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置如102、106、107、108、109、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、161、215、218、379或447(相对于SEQ ID NO:31或32的氨基酸位置)或其任何组合上包含替换、缺失和/或插入的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:6的变体，所述变体包括选自P102A、R109A、R136A、E161P、E218A、S215P、I379A和M447V的任一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变或其任何组合。

在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:7所示的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含与SEQ ID NO:7的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置如102、106、107、108、109、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、161、215、218、379或447(相对于SEQ ID NO:31或32的氨基酸位置)或其任何组合上包含替换、缺失和/或插入的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:7的变体，所述变体包括选自P102A、R109A、R136A、E161P、E218A、S215P、I379A和M447V的任一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变或其任何组合。

在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:8所示的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置如102、106、107、108、109、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、161、215、218、379或447(相对于SEQ ID NO:31或32的氨基酸位置)或其任何组合上包含替换、缺失和/或插入的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:8的变体，所述变体包括选自P102A、R109A、R136A、E161P、E218A、S215P、I379A和M447V的任一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变或其任何组合。

在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:9所示的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含与SEQ ID NO:9的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置如102、106、107、108、109、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、161、215、218、379或447(相对于SEQ ID NO:31或32的氨基酸位置)或其任何组合上包含替换、缺失和/或插入的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:9的变体，所述变体包括选自P102A、R109A、R136A、E161P、E218A、S215P、I379A和M447V的任一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变或其任何组合。

在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:10所示的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含与SEQ ID NO:10的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置如102、106、107、108、109、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、161、215、218、379或447(相对于SEQ ID NO:31或32的氨基酸位置)或其任何组合上包含替换、缺失和/或插入的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:10的变体，所述变体包括选自P102A、R109A、R136A、E161P、E218A、S215P、I379A和M447V的任一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变或其任何组合。

在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:11所示的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含与SEQ ID NO:11的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置如102、106、107、108、109、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、161、215、218、379或447(相对于SEQ ID NO:31或32的氨基酸位置)或其任何组合上包含替换、缺失和/或插入的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:11的变体，所述变体包括选自P102A、R109A、R136A、E161P、E218A、S215P、I379A和M447V的任一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变或其任何组合。

在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:12所示的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含与SEQ ID NO:12的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置如102、106、107、108、109、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、161、215、218、379或447(相对于SEQ ID NO:31或32的氨基酸位置)或其任何组合上包含替换、缺失和/或插入的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:12的变体，所述变体包括选自P102A、R109A、R136A、E161P、E218A、S215P、I379A和M447V的任一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变或其任何组合。

在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:13所示的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含与SEQ ID NO:13的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置如102、106、107、108、109、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、161、215、218、379或447(相对于SEQ ID NO:31或32的氨基酸位置)或其任何组合上包含替换、缺失和/或插入的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:13的变体，所述变体包括选自P102A、R109A、R136A、E161P、E218A、S215P、I379A和M447V的任一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变或其任何组合。

在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:14所示的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含与SEQ ID NO:14的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置如102、106、107、108、109、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、161、215、218、379或447(相对于SEQ ID NO:31或32的氨基酸位置)或其任何组合上包含替换、缺失和/或插入的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:14的变体，所述变体包括选自P102A、R109A、R136A、E161P、E218A、S215P、I379A和M447V的任一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变或其任何组合。

在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:15所示的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含与SEQ ID NO:15的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置如102、106、107、108、109、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、161、215、218、379或447(相对于SEQ ID NO:31或32的氨基酸位置)或其任何组合上包含替换、缺失和/或插入的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:15的变体，所述变体包括选自P102A、R109A、R136A、E161P、E218A、S215P、I379A和M447V的任一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变或其任何组合。

在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:16所示的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含与SEQ ID NO:16的序列具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或多个氨基酸位置如102、106、107、108、109、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、161、215、218、379或447(相对于SEQ ID NO:31或32的氨基酸位置)或其任何组合上包含替换、缺失和/或插入的序列。在一些实施方式中，所述重组多肽是或包含SEQ ID NO:16的变体，所述变体包括选自P102A、R109A、R136A、E161P、E218A、S215P、I379A和M447V的任一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变或其任何组合。

如上文所指出，在一些实施方式中，本文提供的重组多肽不仅缔合形成三聚体，而且还可以聚集或被聚集以产生包含多个重组多肽的蛋白质。在一些实施方式中，所形成的蛋白质具有宏观结构。在一些情况下，宏观结构可以赋予RSV病毒抗原或免疫原重组多肽结构稳定性，进而可以接近能够促进免疫应答的潜在抗原位点。

在一些实施方式中，三聚化重组多肽聚集以形成含有多个三聚化重组多肽的蛋白质。在一些实施方式中，所述多个三聚化重组多肽形成了具有宏观结构的蛋白质。在一些实施方式中，所述蛋白质包括包含拐杖形棒状F蛋白肽三聚体的莲座样寡聚物。

在一些实施方式中，本文提供了一种复合物，所述复合物包含选自SEQ ID NO:1-16的重组多肽或其片段、变体或突变体的任何合适的组合。在一些实施方式中，本文提供了一种复合物，所述复合物包含选自SEQ ID NO:1-16的重组多肽或其片段、变体或突变体的三聚体，其中所述重组多肽通过多肽间二硫键三聚化以形成所述三聚体。

在一些实施方式中，本文所述的包含多个重组多肽的蛋白质是免疫原。在一些实施方式中，本文所述的包含多个重组多肽的蛋白质包含在纳米粒子中。例如，在一些实施方式中，所述蛋白质直接连接到纳米粒子，例如蛋白质纳米粒子。在一些实施方式中，所述蛋白质间接地连接到纳米粒子。在一些实施方式中，本文所述的包含多个重组多肽的蛋白质包含在病毒样粒子(VLP)中。

2.多核苷酸和载体

还提供了编码本文所提供的RSV抗原或免疫原和重组多肽的多核苷酸(核酸分子)，以及用于基因工程改造细胞以表达此类RSV抗原或免疫原和重组多肽的载体。

在一些实施方式中，提供了编码本文所提供的重组多肽的多核苷酸。在一些方面，所述多核苷酸含有单个核酸序列，如编码重组多肽的核酸序列。在其它情况下，所述多核苷酸含有编码包含特定RSV病毒抗原或免疫原的重组多肽的第一核酸序列和编码包含不同的RSV病毒抗原或免疫原的重组多肽的第二核酸序列。

在一些实施方式中，编码重组多肽的多核苷酸含有至少一个启动子，所述启动子可操作地连接以控制所述重组多肽的表达。在一些实施方式中，所述多核苷酸含有两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制所述重组多肽的表达。

在一些实施方式中，例如，当所述多核苷酸含有两个或更多个核酸编码序列，如编码包含不同RSV病毒抗原或免疫原的重组多肽的序列时，至少一个启动子可操作地连接以控制所述两个或更多个核酸序列的表达。在一些实施方式中，所述多核苷酸含有两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制所述重组多肽的表达。

在一些实施方式中，所述重组多肽的表达是诱导性的或条件性的。因此，在一些方面，编码重组多肽的多核苷酸含有条件性启动子、增强子或反式激活子。在一些这种方面，所述条件性启动子、增强子或反式激活子是诱导性启动子、增强子或反式激活子，或者抑制性启动子、增强子或反式激活子。例如，在一些实施方式中，可以使用诱导性或条件性启动子使重组多肽的表达局限于具体的微环境。在一些实施方式中，通过暴露于外源因子如热、辐射或药物来调控由诱导性或条件性启动子驱动的表达。

在多核苷酸含有多于一个编码重组多肽的核酸序列的情况下，所述多核苷酸还可以在一个或多个核酸序列之间包括编码肽的核酸序列。在一些情况下，位于核酸序列之间的核酸编码的肽在翻译过程中或翻译后隔开了核酸序列的翻译产物。在一些实施方式中，所述肽含有内部核糖体进入位点(IRES)、自切割肽或导致核糖体跳跃的肽，如T2A肽。

在一些实施方式中，将编码重组多肽的多核苷酸引入含有培养细胞(例如宿主细胞)的组合物中，如通过逆转录病毒转导、转染或转化。在一些实施方式中，这可以允许表达(例如，产生)重组多肽。在一些实施方式中，所表达的重组多肽被纯化。

在一些实施方式中，本文提供的多核苷酸(核酸分子)编码如本文所述的RSV病毒抗原或免疫原。在一些实施方式中，本文提供的多核苷酸(核酸分子)编码包含RSV病毒抗原或免疫原的重组多肽，例如本文所述的RSV F肽蛋白。

还提供了含有如本文所述的核酸分子的载体或构建体。在一些实施方式中，所述载体或构建体含有一个或多个启动子，所述启动子可操作地连接到编码重组多肽的核酸分子以驱动其表达。在一些实施方式中，所述启动子可操作地连接到一个或多于一个核酸分子，例如编码含有不同RSV病毒抗原或免疫原的重组多肽的核酸分子。

在一些实施方式中，所述载体是病毒载体。在一些实施方式中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方式中，所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。在一些实施方式中，所述逆转录病毒载体是γ逆转录病毒载体。

在一些实施方式中，所述载体或构建体包括单个启动子，所述启动子驱动多核苷酸的一个或多个核酸分子的表达。在一些实施方式中，此类启动子可以是多顺反子(双顺反子或三顺反子，参见例如美国专利号6,060,273)。例如，在一些实施方式中，转录单元可以工程改造为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，由此允许通过来自单个启动子的信号共表达基因产物(例如，编码不同的重组多肽)。在一些实施方式中，本文提供的载体是双顺反子的，从而允许所述载体含有和表达两个核酸序列。在一些实施方式中，本文提供的载体是三顺反子的，从而允许所述载体含有和表达三个核酸序列。

在一些实施方式中，单个启动子指导RNA表达，所述RNA在单个开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如编码嵌合信号传导受体和编码重组受体)，所述基因通过编码自切割肽(例如2A序列)或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶)的序列彼此隔开。所述ORF因此编码单个多肽，所述多肽在翻译过程中(在2A的情况下)或翻译后被加工成个体蛋白质。在一些情况下，所述肽如T2A可能导致核糖体跳过(核糖体跳跃)合成2A元件C端的肽键，导致2A序列末端与下一个下游肽分开(参见例如de Felipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)；以及deFelipe等人,Traffic 5:616-626(2004))。许多2A元件是本领域已知的。可用于本文公开的方法和核酸的2A序列的实例包括但不限于美国专利公开号20070116690所述的来自口蹄疫病毒(F2A)、马甲型鼻炎病毒(E2A)、明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna)(T2A)和猪捷申病毒-1(P2A)的2A序列。

在一些实施方式中，所述载体包含在病毒中。在一些实施方式中，所述病毒是假病毒。在一些实施方式中，所述病毒是病毒样粒子。在一些实施方式中，所述载体包含在细胞中。在一些实施方式中，包含载体的病毒或细胞含有重组基因组。

III.免疫原性组合物和制剂

在一些实施方式中，本文提供了一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含重组多肽的三聚体或所述三聚体中任两种或更多种的组合，所述重组多肽包含选自SEQ IDNO:1-16的序列。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物的单位剂量可以包括约10μg至约100μg所述RSV F抗原，优选约25μg至约75μg所述RSV F抗原，优选约40μg至约60μg所述RSVF抗原或约50μg所述RSV F抗原。在一些实施方式中，所述剂量含有3μg所述RSV F抗原。在其它实施方式中，所述剂量含有9μg所述RSV F抗原。在其它实施方式中，所述剂量含有30μg所述RSV F抗原。

在一些情况下，可能需要组合所公开的免疫原与诱导对其它因子的保护性应答的其它药品(例如疫苗)。例如，包括本文所述的重组RSV F抗原(例如三聚体或蛋白质)的组合物可以与美国免疫接种咨询委员会(Advisory Committee on Immunization Practices，ACIP；cdc.gov/vaccines/acip/index.html)针对目标年龄组(例如大约1至6个月大的婴儿)建议的其它疫苗如流感疫苗或水痘带状疱疹疫苗同时(通常分开)或依次给药。因此，所公开的包括本文所述的重组RSV F抗原的免疫原可以与例如针对乙肝(HepB)、白喉、破伤风和百日咳(DTaP)、肺炎球菌(PCV)、b型流感嗜血杆菌(Hib)、脊髓灰质炎、流感和轮状病毒的疫苗同时或依次给药。

多价或联合疫苗针对多种病原体提供保护。在某些情况下，多价疫苗可以针对同一病原体的多种毒株或菌株提供保护。在某些情况下，多价疫苗针对多种病原体提供保护，例如联合疫苗Tdap，其针对破伤风、百日咳和白喉的菌株提供保护。多价疫苗对于最小化提供针对多种病原体或病原毒株或菌株的保护所需的免疫接种次数、降低给药成本和提高覆盖率是非常理想的。例如，这在给婴儿或儿童接种时可能特别有用。

在一些实施方式中，例如包含本文所述的免疫原性组合物的疫苗是多价疫苗。在一些实施方式中，用于并入本发明的多价疫苗组合物的抗原材料来源于A型或B型RSV或其组合。用于并入本发明的多价疫苗组合物的抗原可以来源于一株RSV或者多个毒株，例如，两个至五个毒株，以便提供更广泛的保护范围。在一个实施方式中，用于并入本发明的多价疫苗组合物的抗原来源于多株RSV病毒。其它可用的抗原包括活病毒、减毒病毒和灭活病毒，如灭活脊髓灰质炎病毒(Jiang等人,J.Biol.Stand.,(1986)14:103-9)、甲型肝炎病毒减毒株(Bradley等人,J.Med.Virol.,(1984)14:373-86)、减毒麻疹病毒(James等人,N.Engl.J.Med.,(1995)332:1262-6)，以及百日咳病毒表位(例如ACEL-IMUNErM无细胞DTP，Wyeth-Lederle疫苗和儿童用药)。

在一些方面，本文提供的疫苗是通用疫苗。在一些实施方式中，通用疫苗是针对同一病毒的多个毒株，如多个RSV毒株提供保护的疫苗。开发一种有效的通用RSV疫苗将降低例如季节性疫苗配制的成本和劳动力，并允许更鲁棒的大流行防范。

在一些方面，通用疫苗是包含来源于不同病毒株的多个表位的疫苗。在一些方面，通用疫苗包含在不同病毒株间保守的单个表位。例如，通用疫苗可以基于RSV F蛋白的相对保守结构域。

还提供了包含所公开的免疫原(例如，所公开的重组RSV F抗原或者编码所公开的重组RSV F抗原的原聚体的核酸分子)和药学上可接受的载剂的免疫原性组合物。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含本文提供的三聚化重组多肽和任选的药学上可接受的载剂。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含含有本文提供的多个三聚化重组多肽的蛋白质和任选的药学上可接受的载剂。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含本文提供的蛋白质纳米粒子和任选的药学上可接受的载剂。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含本文提供的VLP和任选的药学上可接受的载剂。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含本文提供的分离的核酸和任选的药学上可接受的载剂。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含本文提供的载体和任选的药学上可接受的载剂。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含本文提供的病毒和任选的药学上可接受的载剂。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含本文提供的假病毒和任选的药学上可接受的载剂。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含本文提供的细胞和任选的药学上可接受的载剂。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物如本文所述的免疫原性组合物是疫苗。在一些实施方式中，所述疫苗是预防性疫苗。在一些实施方式中，所述疫苗是治疗性疫苗。在一些实施方式中，所述疫苗是预防性疫苗和治疗性疫苗。此类药物组合物可以通过普通技术人员已知的各种给药模式给药到受试者，例如肌肉内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、关节内、腹膜内、鼻内、舌下、扁桃体、口咽或其它肠胃外和粘膜途径。在若干个实施方式中，包括一种或多种所公开的免疫原的药物组合物是免疫原性组合物。制备可给药组合物的实际方法将是本领域技术人员已知或显而易见的，并且更详细描述于如《Remington制药学》(Remingtons Pharmaceutical Sciences)第19版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1995的出版物中。

因此，免疫原，例如重组RSV F抗原，例如本文所述的三聚体、蛋白质，可以与药学上可接受的载剂一起配制，以帮助保留生物活性，同时还有助于增加在可接受的温度范围内储存期间的稳定性。可能的载剂包括但不限于生理平衡培养基、磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)、各种类型的润湿剂、低温保护添加剂或稳定剂如蛋白质、肽或水解物(例如白蛋白、明胶)、糖(例如蔗糖、乳糖、山梨醇)、氨基酸(例如谷氨酸钠)或其它保护剂。所得水溶液可以被原样或冻干包装使用。冻干制剂在给药前与无菌溶液组合以供单次或多次给药。

配制的组合物，尤其是液体制剂，可以含有抑细菌剂以防止或最小化储存期间的降解，包括但不限于有效浓度(通常为1％w/v)的苯甲醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。一些患者可能忌用抑细菌剂；因此，冻干制剂可以在含有或不含此类成分的溶液中重构。

本公开的免疫原性组合物可以根据需要含有药学上可接受的媒剂物质以接近生理条件，如pH调节和缓冲剂、渗涨度调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨醇单月桂酸酯和油酸三乙醇胺。所述免疫原性组合物可以任选地包括佐剂来增强宿主的免疫应答。合适的佐剂有例如toll样受体激动剂、铝剂、AlPO

对于疫苗组合物，合适的佐剂的实例包括例如氢氧化铝、卵磷脂、弗氏佐剂、MPL

在一些实施方式中，本发明的免疫原性组合物可以含有佐剂制剂，包括水包油乳液形式的可代谢油(例如角鲨烯)和α生育酚，以及聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)。在一些实施方式中，所述佐剂制剂可以包含约2％至约10％角鲨烯、约2至约10％α生育酚(例如，D-α生育酚)和约0.3至约3％聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。在一些实施方式中，所述佐剂制剂可以包含约5％角鲨烯、约5％生育酚和约0.4％聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。在一些实施方式中，本公开的免疫原性组合物可以含有3-O-脱酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)和水包油乳液形式的佐剂，该佐剂含有可代谢油、α生育酚和聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。在一些实施方式中，本公开的免疫原性组合物可以含有QS21(皂树(Quillajasaponaria Molina)提取物：级分21)、3D-MPL和水包油乳液，其中所述水包油乳液包含可代谢油、α生育酚和聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。在一些实施方式中，本公开的免疫原性组合物可以含有QS21、3D-MPL和水包油乳液，其中所述水包油乳液具有以下组成：可代谢油如角鲨烯、α生育酚和吐温-80。在一些实施方式中，本公开的免疫原性组合物可以含有脂质体组合物形式的佐剂。

在一些实施方式中，本公开的免疫原性组合物可以含有佐剂制剂，所述佐剂制剂包含可代谢油(例如角鲨烯)、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)和Span 85。在一些实施方式中，所述佐剂制剂可以包含约5％(w/v)角鲨烯、约0.5％(w/v)聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯和约0.5％(w/v)Span 85。

在一些实施方式中，本公开的免疫原性组合物可以含有例如呈纳米粒子组合物形式的佐剂制剂，所述佐剂制剂包含皂树皂苷、胆固醇和磷脂。在一些实施方式中，本公开的免疫原性组合物可以含有分开纯化的皂树级分的混合物，随后与胆固醇和磷脂一起配制。

在一些实施方式中，本公开的免疫原性组合物可以含有选自MF59

在一些实施方式中，本公开的免疫原性组合物可以含有toll样受体9(TLR9)激动剂，其中所述TLR9激动剂是长度为8至35个核苷酸且包含未甲基化胞苷-磷酸-鸟苷(也称为CpG或胞嘧啶-磷酸-鸟苷)基序的寡核苷酸，所述RSV抗原和所述寡核苷酸在所述免疫原性组合物中的存在量能有效刺激有需要的哺乳动物受试者如人类受试者对RSV抗原的免疫应答。TLR9(CD289)识别微生物DNA中发现的未甲基化胞苷-磷酸-鸟苷(CpG)基序，后者可以使用合成的含CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)进行模拟。已知CpG-ODN增强抗体产生并刺激T辅助1(Th1)细胞应答(Coffman等人,Immunity,33:492-503,2010)。最佳寡核苷酸TLR9激动剂通常含有遵循以下通式的回文序列：5'-嘌呤-嘌呤-CG-嘧啶-嘧啶-3'，或5'-嘌呤-嘌呤-CG-嘧啶-嘧啶-CG-3'。美国专利号6,589,940，该美国专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方式中，所述CpG寡核苷酸是线性的。在其它实施方式中，所述CpG寡核苷酸是环形的或包括发夹环。所述CpG寡核苷酸可以是单链或双链的。在一些实施方式中，所述CpG寡核苷酸可以含有修饰。修饰包括但不限于3'OH或5'OH基团的修饰、核苷酸碱基的修饰、糖组分的修饰和磷酸基团的修饰。修饰的碱基可以包括在所述CpG寡核苷酸的回文序列中，只要修饰的碱基通过沃森-克里克碱基配对来保持对其自然补体的相同特异性(例如，所述回文部分仍是自身互补的)即可。在一些实施方式中，所述CpG寡核苷酸包含非典型碱基。在一些实施方式中，所述CpG寡核苷酸包含修饰的核苷。在一些实施方式中，修饰的核苷选自2'-脱氧-7-脱氮鸟苷、2'-脱氧-6-硫代鸟苷、阿拉伯糖基鸟苷、2'-脱氧-2'取代-阿拉伯糖基鸟苷和2'-O-取代-阿拉伯糖基鸟苷。所述CpG寡核苷酸可以含有磷酸基团的修饰。例如，除了磷酸二酯键以外，磷酸修饰还包括但不限于膦酸甲酯、硫代磷酸酯、磷酰胺(桥接或非桥接)、磷酸三酯和二硫代磷酸酯，并且可以以任何组合使用。还可以使用其它非磷酸酯键。在一些实施方式中，所述寡核苷酸仅包含硫代磷酸酯骨架。在一些实施方式中，所述寡核苷酸仅包含磷酸二酯骨架。在一些实施方式中，所述寡核苷酸在磷酸酯骨架中包含磷酸酯键的组合，如磷酸二酯键和硫代磷酸酯键的组合。具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸可能比具有磷酸二酯骨架的寡核苷酸更具免疫原性，注射到宿主体内后似乎更抗降解(Braun等人,J Immunol,141:2084-2089,1988；以及Latimer等人,Mol Immunol,32:1057-1064,1995)。本公开的CpG寡核苷酸包括至少一个、两个或三个核苷酸间硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，当多个CpG寡核苷酸分子存在于包含至少一种赋形剂的药物组合物中时，硫代磷酸酯键的两种立体异构体都存在于多个CpG寡核苷酸分子中。在一些实施方式中，所述CpG寡核苷酸的所有核苷酸间键都是硫代磷酸酯键，或换言之，所述CpG寡核苷酸具有硫代磷酸酯骨架。

任何适合的CpG寡脱氧核苷酸(ODN)或其组合可以在本公开中用作佐剂。例如，K型ODN(也被称为B型)编码硫代磷酸酯骨架上的多个CpG基序。K型ODN可以基于下述序列：

示例性CpG ODN例如CpG 7909(5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’)和CpG 1018(5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’)是已知的，并公开在美国专利号7,255,868、7,491,706、7,479,285、7,745,598、7,785,610、8,003,115、8,133,874、8,114,418、8,222,398、8,333,980、8,597,665、8,669,237、9,028,845和10,052,378，申请公布US 2020/0002704，和Bode等，“作为疫苗佐剂的CpG DNA”(CpG DNA as a vaccine adjuvant)，Expert Rev Vaccines(2011),10(4):499-511中，所有这些文献为所有目的整体通过参考并入本文。

一种或多种佐剂可以组合使用，并且可以包括但不限于氢氧化铝(铝盐)、水包油乳液、油包水乳液、脂质体和微粒，如聚(丙交酯-共-乙交酯)微粒(Shah等人,Methods Mol,1494:1-14,2017)。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物还包含吸附RSV抗原的铝盐佐剂。在一些实施方式中，所述铝盐佐剂包含非晶态羟基磷酸硫酸铝、氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾中的一种或多种。在一些实施方式中，所述铝盐佐剂包含氢氧化铝和磷酸铝中的一种或两种。在一些实施方式中，所述铝盐佐剂包含氢氧化铝。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物的单位剂量包含约0.25至约0.50mg Al

在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含药学上可接受的赋形剂，包括例如溶剂、增量剂、缓冲剂、渗涨度调节剂和防腐剂(Pramanick等人,Pharma Times,45:65-77,2013)。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物可以包含发挥溶剂、增量剂、缓冲剂和渗涨度调节剂中一种或多种的功能的赋形剂(例如，盐水中的氯化钠可以同时作为水性媒剂和渗涨度调节剂)。

在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包含水性媒剂作为溶剂。合适的媒剂包括例如无菌水、盐水溶液、磷酸盐缓冲盐水和林格氏液。在一些实施方式中，所述组合物是等渗的。

所述免疫原性组合物可以包含缓冲剂。缓冲剂控制pH以抑制活性剂在加工、储存和任选的重构过程中的降解。合适的缓冲剂包括例如盐，包括乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或硫酸盐。其它合适的缓冲剂包括例如氨基酸如精氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸。所述缓冲剂还可以包含盐酸或氢氧化钠。在一些实施方式中，所述缓冲剂保持所述组合物的pH在6至9的范围内。在一些实施方式中，所述pH大于(下限)6、7或8。在一些实施方式中，所述pH小于(上限)9、8或7。即，所述pH在约6至9的范围内，其中下限小于上限。

所述免疫原性组合物可以包含渗涨度调节剂。合适的渗涨度调节剂包括例如右旋糖、甘油、氯化钠、丙三醇和甘露糖醇。

所述免疫原性组合物可以包含增量剂。当所述药物组合物在给药前冻干时，增量剂特别有用。在一些实施方式中，所述增量剂是一种保护剂，有助于在冷冻或喷雾干燥期间和/或储存期间稳定和防止活性剂降解。合适的增量剂是糖(单糖、二糖和多糖)，如蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖和棉子糖。

所述免疫原性组合物可以包含防腐剂。合适的防腐剂包括例如抗氧化剂和抗微生物剂。然而，在优选实施方式中，所述免疫原性组合物是在无菌条件下制备并且在单次使用容器中，因此不需要包括防腐剂。

在一些实施方式中，所述组合物可以提供为无菌组合物。所述药物组合物通常含有有效量的所公开的免疫原，并且可以通过常规方法制备。通常，每一剂免疫原性组合物中免疫原的量选择为诱导免疫应答而无显著不良副作用的量。在一些实施方式中，所述组合物可以以单位剂型提供以用于在受试者中诱导免疫应答。单位剂型含有合适的单次预选剂量以供给药到受试者，或者两个或更多个预选单位剂量的合适的标记或测量的多份，和/或用于给药单位剂量或多份单位剂量的计量机制。在其它实施方式中，所述组合物还包括佐剂。

IV.诱导免疫应答的方法

在一些实施方式中，本文提供了一种在受试者中对RSV表面抗原产生免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的包含选自SEQ ID NO:1-16的重组多肽的复合物。在一些实施方式中，本文提供了一种在受试者中对RSV表面抗原产生免疫应答的方法，其中所述表面抗原包含F蛋白或其抗原片段，所述方法包括向所述受试者给药有效量的包含选自SEQ ID NO:1-16的重组多肽的复合物。在一些实施方式中，本文提供了一种在受试者中对RSV表面抗原产生免疫应答的方法，其中所述表面抗原包含选自SEQ ID NO:17-47的序列，所述方法包括向所述受试者给药有效量的包含选自SEQ ID NO:1-16的重组多肽的复合物。在一些实施方式中，本文提供了一种在受试者中对RSV表面抗原产生免疫应答的方法，其中所述表面抗原包括RSV的F蛋白或其抗原片段，任选地，所述表面抗原包含SEQ IDNO:17-47中任一个或多个的序列或其抗原片段，所述方法包括向所述受试者给药有效量的包含含有SEQ ID NO:1-16中任一个所示的序列的重组多肽的复合物。

在一些实施方式中，本文提供了一种在受试者中对RSV表面抗原产生免疫应答的方法，其中所述表面抗原包含F蛋白或其抗原片段，所述方法包括向所述受试者给药有效量的包含含有选自SEQ ID NO:1-16的序列的重组多肽的复合物或任两种或更多种复合物的组合。

所公开的免疫原(例如重组RSV F抗原，例如本文所述的三聚体、蛋白质、编码所公开的重组RSV F抗原的原聚体的核酸分子(如RNA分子)或载体，或包含所公开的重组RSV F抗原的蛋白质纳米粒子或病毒样粒子)可以给药到受试者，以在所述受试者中诱导对相应RSV F抗原的免疫应答。在一个特定实例中，所述受试者是人。所述免疫应答可以是保护性免疫应答，例如抑制后续感染相应RSV的应答。诱导免疫应答还可以用于治疗或抑制与相应RSV相关的感染和疾病。

在一些实施方式中，可以选择已经或有感染RSV风险(例如由于暴露或可能暴露于RSV)的受试者进行治疗。在给药所公开的免疫原后，可以监测所述受试者的感染情况或与RSV相关的症状或二者。

旨在用本公开的治疗剂和方法治疗的典型受试者包括人类，以及非人灵长类动物和其它动物。为了鉴定根据本公开的方法预防或治疗的受试者，采用公认的筛查方法来确定与目标或疑似疾病或疾患相关的风险因素，或确定受试者的现有疾病或疾患的状况。这些筛查方法包括例如确定可能与目标或疑似疾病或疾患相关的环境、家庭、职业和其它此类风险因素的常规检查，以及检测和/或表征RSV感染的诊断方法，如各种ELISA和其它免疫测定方法。这些和其它常规方法允许临床医生使用本公开的方法和药物组合物选择需要治疗的患者。根据这些方法和原则，组合物可以根据本文的教导或其它常规方法给药，作为独立的预防或治疗方案，或作为其它治疗的后续、辅助或协调治疗方案。

所公开的免疫原，例如RSV F抗原，例如三聚体、蛋白质的给药可用于预防性或治疗性目的。当预防性地提供时，所公开的治疗剂是在任何症状之前，例如在感染之前提供。所公开的治疗剂的预防性给药用于预防或改善任何继发感染。在治疗性地提供时，所公开的治疗剂是在疾病或感染症状发作时或之后，例如在出现与RSV F抗原对应的RSV感染症状之后，或在诊断为RSV感染之后提供。所述治疗剂因此可以在预期暴露于RSV之前提供，以便在暴露或疑似暴露到所述病毒后或在感染实际开始后减弱感染和/或相关疾病症状的预计的严重性、持续时间或程度。

本文所述的免疫原及其免疫原性组合物以有效诱导或增强受试者(优选为人类)对RSV F抗原的免疫应答的量提供给所述受试者。所公开的免疫原的实际剂量将根据诸多因素而变化，如受试者的疾病指征和特定状态(例如，受试者的年龄、体型、健康状况、症状程度、易感因素等)、给药时间和途径、并行给药的其它药物或治疗，以及用于在受试者中引发所需的活性或生物应答的组合物的特定药理学。可以调整剂量方案，以提供最佳的预防性或治疗性应答。

包括一种或多种所公开的免疫原的免疫原性组合物可用于协调(或初免-加强)疫苗接种方案或组合制剂。在某些实施方式中，新的组合免疫原性组合物和协调免疫接种方案采用单独的免疫原或制剂，各自针对引发抗病毒免疫应答，如对RSV F抗原的免疫应答。引发抗病毒免疫应答的单独免疫原性组合物可以组合在于单个免疫接种步骤中给药到受试者的多价免疫原性组合物中，或者它们可以在协调(或初免-加强)免疫接种方案中分开(在单价免疫原性组合物中)给药。

可以进行几次加强，并且每次加强可以是不同的所公开的免疫原。在某些实例中，加强可以是与另一次加强或初免相同的免疫原。所述初免和加强可以作为单剂或多剂给药，例如可以在数天、数周或数月内向受试者给药两剂、三剂、四剂、五剂、六剂或更多剂。也可以进行多次加强，例如1至5次(例如1、2、3、4或5次加强)或更多次。在一系列顺序免疫接种中可以使用不同剂量。例如，在第一次免疫接种中相对大的剂量，然后在加强中使用相对较小的剂量。

在某些实施方式中，所述加强可以在初免后约2周、约3至8周或约4周，或在初免后约几个月给药。在某些实施方式中，所述加强可以在初免后约5、约6、约7、约8、约10、约12、约18、约24个月或初免后更多或更少的时间给药。也可以在适合的时间点使用定期额外加强，以增强受试者的“免疫记忆”。选择的疫苗接种参数例如制剂、剂量、方案等的充分性，可以通过在免疫计划过程中从所述受试者获取血清的等分试样并测定抗体滴度来确定。此外，可以监测所述受试者的临床状况以发现所需的效果，例如感染的预防或疾病状态的改善(例如病毒载量的降低)。如果此类监测表明疫苗接种是次优的，则可以用额外的免疫原性组合物剂量加强所述受试者，并且可以以预期增强免疫应答的方式修改疫苗接种参数。

在某些实施方式中，所述初免-加强方法可以包括向受试者提供DNA初免和蛋白质加强疫苗接种方案。所述方法可以包括核酸分子或蛋白质的两次或更多次给药。

对于蛋白质治疗剂，通常，每剂人类剂量包含1-1000μg蛋白质，如约1μg至约100μg，例如约1μg至约50μg，如约1μg、约2μg、约5μg、约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约40μg或约50μg。

免疫原性组合物中所利用的量基于受试者群体(如婴儿或老年人)进行选择。通过标准研究，包括观察受试者的抗体滴度和其它应答，可以确定特定组合物的最佳剂量。据了解，免疫原性组合物中的所公开的免疫原，如所公开的重组RSV F抗原(例如三聚体、蛋白质)、病毒载体或核酸分子的治疗有效量可以包括给药单剂在引发免疫应答方面无效但给药多剂后有效的量，例如在初免-加强给药方案中。

在给药本公开所公开的免疫原后，受试者的免疫系统通常通过产生对所述免疫原中包括的RSV F蛋白肽特异的抗体来响应所述免疫原性组合物。此类应答表明向所述受试者递送了免疫有效剂量。

在一些实施方式中，在评估有效剂量/免疫接种方案的背景下确定受试者的抗体应答。在大部分情况下，评估从所述受试者获得的血清或血浆中的抗体滴度就足够了。关于是否给药加强接种和/或改变给药到个体的治疗剂的量的决定可能至少部分基于抗体滴度水平。抗体滴度水平可以基于例如免疫结合测定法，所述免疫结合测定法测量血清中与抗原(包括例如重组RSV F抗原，例如三聚体、蛋白质)结合的抗体浓度。

无需完全消除或减少或预防RSV感染，所述方法才算有效。例如，与不存在免疫原时的RSV感染相比，用一种或多种所公开的免疫原引发对RSV的免疫应答可以使RSV感染减少或抑制所需的量，例如至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％乃至至少100％(消除或预防可检测的感染细胞)。在其它实施例中，可以通过所公开的方法减少或抑制RSV复制。无需完全消除RSV复制，所述方法才算有效。例如，与不存在免疫原时的RSV复制相比，使用一种或多种所公开的免疫原引发的免疫应答可以使相应RSV的复制减少所需的量，例如至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％乃至至少100％(消除或预防可检测的RSV复制)。

在一些实施方式中，在给药佐剂的同时向受试者给药所公开的免疫原。在其它实施方式中，在给药佐剂之后并足以诱导免疫应答的时间量内向受试者给药所公开的免疫原。

一种给药核酸的方法是用质粒DNA，如用哺乳动物表达质粒直接免疫接种。通过核酸构建体免疫接种是本领域中众所周知的，并教导于例如在美国专利号5,643,578(描述了通过引入编码所需抗原的DNA来引发细胞介导的应答或体液应答使脊椎动物免疫的方法)以及美国专利号5,593,972和5,817,637(描述了可操作地连接编码抗原的核酸序列与使其能够表达的调控序列)。美国专利号5,880,103描述了将编码免疫原性肽或其它抗原的核酸递送到生物体的若干种方法。所述方法包括脂质体递送核酸(或合成肽本身)和免疫刺激构建体或ISCOMS

在一些实施方式中，使用质粒DNA疫苗在受试者中表达所公开的免疫原。例如，编码所公开的免疫原的核酸分子可以给药到受试者，以诱导对RSV F抗原的免疫应答。在一些实施方式中，所述核酸分子可以包括在用于DNA免疫接种的质粒载体如pVRC8400载体上(描述于Barouch等人,J.Virol,79,8828-8834,2005，该文献以引用的方式并入本文)。

在另一种使用核酸进行免疫接种的方法中，所公开的重组RSV F抗原，例如三聚体、蛋白质，可以通过减毒病毒宿主或载体或细菌载体进行表达。重组痘苗病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒、逆转录病毒、巨细胞病毒或其它病毒载体可用于表达所述肽或蛋白质，从而诱导CTL应答。例如，美国专利号4,722,848描述了可用于免疫接种方案的痘苗病毒载体和方法。BCG(卡介苗)提供了另一种用于表达肽的载体(参见Stover,Nature 351:456-460,1991)。

在一个实施方式中，将编码所公开的重组RSV F抗原的核酸直接引入到细胞中。例如，可以通过标准方法将核酸负载到金微球体上，并通过诸如Bio-Rad的HELIOS

例如，可以通过标准方法将核酸负载到金微球体上，并通过诸如Bio-Rad的HELIOS

在另一个实施方式中，基于mRNA的免疫接种方案可用于将编码所公开的重组RSVF抗原的核酸直接递送到细胞中。在一些实施方式中，基于mRNA的基于核酸的疫苗可以提供对前述方法的有效替代方案。mRNA疫苗排除了关于DNA整合到宿主基因组中的安全性问题，并且可以直接在宿主细胞质中翻译。此外，RNA的简单无细胞体外合成避免了与病毒载体相关的制造复杂性。可用于递送编码所公开的重组RSV F抗原的核酸的基于RNA的疫苗接种的两种示例性形式包括常规非扩增mRNA免疫接种(参见例如Petsch等人,“体外合成的特异性mRNA疫苗针对HIV病毒感染的保护性功效”(Protective efficacy of in vitrosynthesized,specific mRNA vaccines against influenza A virus infection),Nature biotechnology,30(12):1210-6,2012)和自扩增mRNA免疫接种(参见例如Geall等人,“自扩增型RNA疫苗的非病毒递送”(Nonviral delivery of self-amplifying RNAvaccines),PNAS,109(36):14604-14609,2012；Magini等人,“表达多种保守流感抗原的自扩增型mRNA疫苗针对同源和异亚型病毒激惹提供保护”(Self-Amplifying mRNA VaccinesExpressing Multiple Conserved Influenza Antigens Confer Protection againstHomologous and Heterosubtypic Viral Challenge),PLoS One,11(8):e0161193,2016；以及Brito等人,“自扩增型mRNA疫苗”(Self-amplifying mRNA vaccines),Adv Genet.,89:179-233,2015)。

在一些实施方式中，向受试者给药治疗有效剂量的一种或多种所公开的免疫原在所述受试者中诱导了中和免疫应答。为了评估中和活性，在受试者免疫接种后，可以在适当的时间点从所述受试者收集血清，冷冻并储存以进行中和试验。测定中和活性的方法对本领域普通技术人员是已知的，并在本文中进一步描述，包括但不限于噬斑减少中和(PRNT)测定法、微量中和测定法、基于流式细胞术的测定法、单周期感染测定法。在一些实施方式中，可以使用一组RSV假病毒来测定血清中和活性。

在一些实施方式中，向受试者给药治疗有效剂量的一种或多种所公开的免疫原在所述受试者中诱导了中和免疫应答。为了评估中和活性，在受试者免疫接种后，可以在适当的时间点从所述受试者收集血清，冷冻并储存以进行中和试验。测定中和活性的方法对本领域普通技术人员是已知的，并在本文中进一步描述，包括但不限于噬斑减少中和(PRNT)测定法、微量中和测定法、基于流式细胞术的测定法、单周期感染测定法。在一些实施方式中，可以使用一组RSV假病毒来测定血清中和活性。

在一些实施方式中，通过本文所公开的免疫原诱导的中和免疫应答产生了针对RSV的中和抗体。在一些实施方式中，本文的中和抗体结合到RSV或其组分的细胞受体或辅助受体。核仁素是RSV的进入辅助受体，而且还介导流感病毒、副流感病毒、一些肠道病毒和引起土拉菌血症的细菌的细胞进入。融合前RSV-F糖蛋白与胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)的结合还可能触发蛋白激酶Cζ(PKCζ)的激活，从而从细胞核招募核仁素到胞质膜以结合病毒体上的RSV-F。在一些实施方式中，所述病毒受体或辅助受体是副粘病毒受体或辅助受体，优选肺炎病毒受体或辅助受体，更优选人RSV受体或辅助受体。例如，CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5和/或CCR8受体可能涉及人类RSV感染。RhoA是宿主细胞RSV受体或辅助受体的另一个实例。在一些实施方式中，本文的中和抗体在体外、在原位和/或在体内调节、减少、拮抗、减轻、阻断、抑制、消除和/或干扰至少一种RSV活性或结合或者RSV受体活性或结合，如RSV释放、RSV受体信号传导、膜RSV切割、RSV活性、RSV产生和/或合成。在一些实施方式中，本文公开的免疫原诱导针对RSV的中和抗体，所述中和抗体调节、减少、拮抗、减轻、阻断、抑制、消除和/或干扰RSV与RSV受体或辅助受体如核仁素、IGF1R、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR8和/或RhoA的结合。

V.制品或试剂盒

还提供了含有所提供的重组多肽、蛋白质和免疫原性组合物的制品或试剂盒。所述制品可以包括容器和处于所述容器上或与所述容器相伴的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、试管、IV输液袋等。所述容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。在一些实施方式中，所述容器具有无菌接入端口。示例性容器包括静脉内输液袋、小瓶，包括具有可通过注射用针头刺穿的塞子的那些。所述制品或试剂盒还可以包括指示所述组合物可用于治疗特定疾患，如本文所述的疾患(例如，RSV感染)的包装插页。替代地，或另外地，所述制品或试剂盒还可以包括包含药学上可接受的缓冲剂的另一个或相同容器。它还可以包括其它材料，如其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和/或注射器。

所述标签或包装插页可以指示所述组合物用于治疗个体的RSV感染。在所述容器上或与所述容器相伴的标签或包装插页可以指示关于制剂重构和/或使用的指导。所述标签或包装插页还可以指示所述制剂可用于或旨在用于皮下、静脉内或其它给药模式，以用于治疗或预防个体的RSV感染。

在一些实施方式中，所述容器容纳有组合物本身或与可有效治疗、预防和/或诊断所述疾患的另一种组合物的组合。所述制品或试剂盒可以包括(a)第一容器，其中含有组合物(即，第一药物)，其中所述组合物包括所述免疫原性组合物或其蛋白质或重组多肽；以及(b)第二容器，其中含有组合物(即，第二药物)，其中所述组合物包括其他药剂，如佐剂或其它治疗剂，所述制品或试剂盒还包括所述标签或包装插页上关于用所述第二药物以有效量治疗所述受试者的说明。

术语

除非另有定义，否则本文所用的所有专用术语、符号以及其它技术和科学术语的含义旨在与要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。在一些情况下，为了清楚和/或便于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文包括此类定义不必被视为表示与本领域的通常理解有实质性差异。

术语“多肽”和“蛋白质”可互换用于指代氨基酸残基聚合物，并且不限制最小长度。多肽(包括所提供的受体和其它多肽，例如连接物或肽)可以包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。在一些方面，多肽可以含有关于本源或天然序列的修饰，只要蛋白质保持所需的活性即可。这些修饰可以是故意的，如通过定点诱变，也可以是偶然的，如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增带来的错误。

如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人类或其它动物，通常是人类。在一些实施方式中，给药一种或多种药剂、细胞、细胞群或组合物的受试者(例如患者)是哺乳动物，通常是灵长类动物，如人类。在一些实施方式中，灵长类动物是猴或猿。受试者可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成年和老年受试者。在一些实施方式中，受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物。

如本文所用，“治疗”(及其语法变化形式)是指完全或部分改善或减轻疾病或疾患或病症，或与之相关的症状、不良反应或结果、或表型。治疗的理想效果包括但不限于预防疾病发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。所述术语并不意味着完全治愈疾病或完全消除任何症状或者对所有症状或后果有效。

如本文所用，“延缓疾病发展”意指延迟、阻碍、减缓、迟滞、稳定、抑制和/或推迟疾病(如癌症)的发展。取决于疾病史和/或所治疗的个体，该延缓的时间长度可能不同。在一些实施方式中，充分或显著的延缓实际上可以涵盖预防，因为个体不会罹患疾病。例如，可以延缓晚期癌症，如转移的发展。

如本文所用，“预防”包括针对可能易患疾病但尚未被诊断患有疾病的受试者的疾病发生或复发提供预防。在一些实施方式中，所提供的细胞和组合物用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。

如本文所用，“抑制”功能或活性是指当与除目标条件或参数以外在其它方面相同的条件相比或者与另一条件相比时，降低功能或活性。例如，抑制肿瘤生长的细胞使肿瘤生长速率与不存在所述细胞时的肿瘤生长速率相比有所降低。

在给药的背景下，药剂例如药物制剂、细胞或组合物的“有效量”是指有效实现所需的结果如治疗性或预防性结果所必需的剂量/量和时间段的量。

药剂例如药物制剂、细胞或组合物的“治疗有效量”是指有效实现所需的治疗结果如治疗疾病、疾患或病症和/或治疗的药代动力学或药效学效果所必需的剂量和时间段的量。治疗有效量可以根据诸多因素如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重以及给药的细胞群而变化。在一些实施方式中，所提供的方法包括以有效量(例如，治疗有效量)给药所述细胞和/或组合物。

“预防有效量”是指有效实现所需的预防结果所必需的剂量和时间段的量。通常但不是必需的，因为预防剂量在疾病前或疾病早期阶段用于受试者，因此预防有效量小于治疗有效量。在肿瘤负担较低的情况下，一些方面的预防有效量会高于治疗有效量。

如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。本文提及“约”某个值或参数包括(并描述)了针对该值或参数本身的实施方式。

如本文所用，除非上下文另外清楚指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。例如，“一个”或“一种”意指“至少一个(种)”或“一个(种)或多(种)”。

贯穿本公开内容，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅为了方便和简洁，不应当被视为对所要求保护的主题的范围的刚性限制。因此，范围的描述应当被视为已经明确公开了所有可能的子范围以及该范围内的个别数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的各居间值以及该所述范围内的任何其它所述或居间值都涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，仅受所述范围内任何明确排除的限制。在所述范围包括一个或多个限值时，排除那些被包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在所要求保护的主题内。这适用于任何范围宽度。

如本文所用，组合物是指两种或更多种包括细胞在内的产品、物质或化合物的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊状物、水溶液、非水溶液或其任何组合。

如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖与它连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制核酸结构的载体以及并入到已经引入它的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。

示例性实施方式

实施方式1.一种包含多个重组多肽的蛋白质，各重组多肽包含连接到胶原蛋白C端前肽的呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白肽或其片段或表位，其中所述重组多肽的C端前肽形成了多肽间二硫键。

实施方式2.根据实施方式1所述的蛋白质，其中所述RSV属于A亚型或B亚型。

实施方式3.根据实施方式1或2所述的蛋白质，其中所述表位是线性表位或构象表位。

实施方式4.根据实施方式1至3中任一项所述的蛋白质，其中所述F蛋白肽包括F1亚单位肽、F2亚单位肽或其任何组合，所述蛋白质包含三个重组多肽。

实施方式5.根据实施方式1至4中任一项所述的蛋白质，其中所述F蛋白肽包含信号肽、七肽重复序列C(HRC)肽、pep27肽、融合肽(FP)、七肽重复序列A(HRA)肽、结构域I肽、结构域II肽或七肽重复序列B(HRB)肽或其任何组合。

实施方式6.根据实施方式1至5中任一项所述的蛋白质，其中所述F蛋白肽包含所述F蛋白的F1亚单位但不包含F2亚单位，或相反。

实施方式7.根据实施方式1至6中任一项所述的蛋白质，其中所述F蛋白肽包含所述F蛋白的F1亚单位和F2亚单位，任选地不存在pep27，任选地其中所述F1亚单位和所述F2亚单位通过二硫键或人工引入的连接物连接。

实施方式8.根据实施方式1至7中任一项所述的蛋白质，其中所述F蛋白肽不包含跨膜(TM)结构域肽和/或胞质(CP)结构域肽。

实施方式9.根据实施方式1至8中任一项所述的蛋白质，其中所述F蛋白肽包含蛋白酶切割位点，其中所述蛋白酶任选地为弗林蛋白酶、胰蛋白酶、因子Xa或组织蛋白酶L。

实施方式10.根据实施方式1至8中任一项所述的蛋白质，其中所述F蛋白肽不包含蛋白酶切割位点，其中所述蛋白酶任选地为弗林蛋白酶、胰蛋白酶、因子Xa或组织蛋白酶L。

实施方式11.根据实施方式1至10中任一项所述的蛋白质，其中所述F蛋白肽是可溶性的或不直接结合到脂质双分子层，例如膜或病毒包膜。

实施方式12.根据实施方式1至11中任一项所述的蛋白质，其中在所述蛋白质的重组多肽间所述F蛋白肽是相同或不同的。

实施方式13.根据实施方式1至12中任一项所述的蛋白质，其中所述F蛋白肽直接与所述C端前肽融合，或通过连接物如包含甘氨酸-X-Y重复序列的连接物与所述C端前肽连接，其中X和Y独立地为任何氨基酸，任选地为脯氨酸或羟脯氨酸。

实施方式14.根据实施方式1至13中任一项所述的蛋白质，所述蛋白质是可溶性的或不直接结合到脂质双分子层，例如膜或病毒包膜。

实施方式15.根据实施方式1至14中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质能够形成包含F蛋白肽三聚体的莲座样寡聚物。

实施方式16.根据实施方式1至15中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质能够结合到受试者的细胞表面附着因子或受体，任选地其中所述受试者是哺乳动物，如灵长类动物，例如人类。

实施方式17.根据实施方式1至16中任一项所述的蛋白质，其中所述C端前肽属于人类胶原蛋白。

实施方式18.根据实施方式1至17中任一项所述的蛋白质，其中所述C端前肽包含proα1(I)、proα1(II)、proα1(III)、proα1(V)、proα1(XI)、proα2(I)、proα2(V)、proα2(XI)或proα3(XI)的C端多肽或其片段。

实施方式19.根据实施方式1至18中任一项所述的蛋白质，其中在所述重组多肽间所述C端前肽是相同或不同的。

实施方式20.根据实施方式1至19中任一项所述的蛋白质，其中所述C端前肽包含SEQ ID NO:48或与其具有至少90％同一性，能够形成多肽间二硫键并使所述重组多肽三聚化的氨基酸序列。

实施方式21.根据实施方式1至19中任一项所述的蛋白质，其中所述C端前肽包含SEQ ID NO:49或与其具有至少90％同一性，能够形成多肽间二硫键并使所述重组多肽三聚化的氨基酸序列。

实施方式22.根据实施方式1至19中任一项所述的蛋白质，其中所述C端前肽包含SEQ ID NO:50或与其具有至少90％同一性，能够形成多肽间二硫键并使所述重组多肽三聚化的氨基酸序列。

实施方式23.根据实施方式1至19中任一项所述的蛋白质，其中所述C端前肽包含SEQ ID NO:51或与其具有至少90％同一性，能够形成多肽间二硫键并使所述重组多肽三聚化的氨基酸序列。

实施方式24.根据实施方式1至19中任一项所述的蛋白质，其中所述C端前肽包含SEQ ID NO:52或与其具有至少90％同一性，能够形成多肽间二硫键并使所述重组多肽三聚化的氨基酸序列。

实施方式25.根据实施方式1至19中任一项所述的蛋白质，其中所述C端前肽包含SEQ ID NO:53或与其具有至少90％同一性，能够形成多肽间二硫键并使所述重组多肽三聚化的氨基酸序列。

实施方式26.根据实施方式1至19中任一项所述的蛋白质，其中所述C端前肽包含SEQ ID NO:54或与其具有至少90％同一性，能够形成多肽间二硫键并使所述重组多肽三聚化的氨基酸序列。

实施方式27.根据实施方式1至19中任一项所述的蛋白质，其中所述C端前肽包含SEQ ID NO:55-59中的任一个或与其具有至少90％同一性，能够形成多肽间二硫键并使所述重组多肽三聚化的氨基酸序列。

实施方式28.根据实施方式1至19中任一项所述的蛋白质，其中所述C端前肽包含SEQ ID NO:60或与其具有至少90％同一性，能够形成多肽间二硫键并使所述重组多肽三聚化的氨基酸序列。

实施方式29.根据实施方式1至19中任一项所述的蛋白质，其中所述C端前肽包含SEQ ID NO:61-63中的任一个或与其具有至少90％同一性，能够形成多肽间二硫键并使所述重组多肽三聚化的氨基酸序列。

实施方式30.根据实施方式1至29中任一项所述的蛋白质，其中所述C端前肽包含含有连接到SEQ ID NO:48-63中任一个的N端的甘氨酸-X-Y重复序列的氨基酸序列，其中X和Y独立地为任何氨基酸，任选地为脯氨酸或羟脯氨酸，或与其具有至少90％同一性，能够形成多肽间二硫键并使所述重组多肽三聚化的氨基酸序列。

实施方式31.根据实施方式1至30中任一项所述的蛋白质，其中各重组多肽中的所述F蛋白肽呈融合前构象或融合后构象，任选地其中所述蛋白质包括包含拐杖形棒状F蛋白肽三聚体的莲座样寡聚物。

实施方式32.根据实施方式1至31中任一项所述的蛋白质，其中各重组多肽中的所述F蛋白肽包含SEQ ID NO:17-47中的任一个或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。

实施方式33.根据实施方式1至31中任一项所述的蛋白质，其中所述重组多肽包含SEQ ID NO:1-16中的任一个或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。

实施方式34.一种免疫原，所述免疫原包含根据实施方式1至33中任一项所述的蛋白质。

实施方式35.一种蛋白质纳米粒子，所述蛋白质纳米粒子包含直接或间接地与纳米粒子连接的根据实施方式1至33中任一项所述的蛋白质。

实施方式36.一种病毒样粒子(VLP)，所述病毒样粒子包含根据实施方式1至33中任一项所述的蛋白质。

实施方式37.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据实施方式1至33中任一项所述的蛋白质的1、2、3个或更多个重组多肽。

实施方式38.根据实施方式37所述的分离的核酸，其中编码所述F蛋白肽的多肽与编码所述胶原蛋白C端前肽的多肽框内融合。

实施方式39.根据实施方式37或38所述的分离的核酸，所述分离的核酸与启动子可操作地连接。

实施方式40.根据实施方式37至39中任一项所述的分离的核酸，所述分离的核酸是DNA分子。

实施方式41.根据实施方式37至39中任一项所述的分离的核酸，所述分离的核酸是RNA分子，任选地为mRNA分子如核苷修饰mRNA、非扩增mRNA、自扩增mRNA或反式扩增mRNA。

实施方式42.一种载体，所述载体包含根据实施方式37至41中任一项所述的分离的核酸。

实施方式43.根据实施方式42所述的载体，所述载体是病毒载体。

实施方式44.一种包含根据实施方式42或43所述的载体的病毒、假病毒或细胞，任选地其中所述病毒或细胞具有重组基因组。

实施方式45.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含根据实施方式1至44中任一项所述的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米粒子、VLP、分离的核酸、载体、病毒、假病毒或细胞，以及药学上可接受的载剂。

实施方式46.一种疫苗，所述疫苗包含根据实施方式45所述的免疫原性组合物和任选的佐剂，其中所述疫苗任选地为亚单位疫苗，和/或任选地其中所述疫苗是预防性和/或治疗性疫苗。

实施方式47.根据实施方式46所述的疫苗，其中所述疫苗包含多种不同的佐剂。

实施方式48.一种产生蛋白质的方法，所述方法包括：在宿主细胞中表达根据实施方式37至43中任一项所述的分离的核酸或载体以产生根据实施方式1至33中任一项所述的蛋白质；以及纯化所述蛋白质。

实施方式49.根据实施方式48所述的方法产生的蛋白质。

实施方式50.一种在受试者中对RSV的F蛋白肽或其片段或表位产生免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的根据实施方式1至47和49中任一项所述的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米粒子、VLP、分离的核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗以产生所述免疫应答。

实施方式51.根据实施方式50所述的方法，所述方法用于治疗或预防RSV感染。

实施方式52.根据实施方式50或51所述的方法，其中产生所述免疫应答抑制或减少了所述受试者中RSV的复制。

实施方式53.根据实施方式50至52中任一项所述的方法，其中所述免疫应答包括细胞介导应答和/或体液应答，任选地包括产生一种或多种中和抗体，如多克隆抗体或单克隆抗体。

实施方式54.根据实施方式50至53中任一项所述的方法，其中所述免疫应答针对所述RSV的F蛋白肽或其片段或表位，但不针对所述C端前肽。

实施方式55.根据实施方式50至54中任一项所述的方法，其中所述给药不会由于所述受试者先前暴露于一种或多种RSV而引起抗体依赖性增强(ADE)。

实施方式56.根据实施方式50至55中任一项所述的方法，其中所述给药不会在所述受试者随后暴露于一种或多种RSV时引起抗体依赖性增强(ADE)。

实施方式57.根据实施方式50至56中任一项所述的方法，所述方法还包括初免步骤和/或加强步骤。

实施方式58.根据实施方式50至57中任一项所述的方法，其中所述给药步骤通过局部、经皮、皮下、皮内、口服、鼻内(例如鼻内喷雾)、气管内、舌下、颊、直肠、阴道、吸入、静脉内(例如静脉内注射)、动脉内、肌肉内(例如肌肉内注射)、心内、骨内、腹膜内、经粘膜、玻璃体内、视网膜下、关节内、关节周、局部或经表皮给药来进行。

实施方式59.根据实施方式50至58中任一项所述的方法，其中所述有效量以单剂或以一个或多个间期隔开的一系列剂量给药。

实施方式60.根据实施方式50至59中任一项所述的方法，其中所述有效量在无佐剂的情况下给药。

实施方式61.根据实施方式50至59中任一项所述的方法，其中所述有效量与佐剂一起给药。

实施方式62.一种方法，所述方法包括向受试者给药有效量的根据实施方式1至33中任一项所述的蛋白质，以在所述受试者中产生针对RSV的中和抗体或中和抗血清。

实施方式63.根据实施方式62所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物，任选地为人类或非人灵长类动物。

实施方式64.根据实施方式62或63所述的方法，所述方法还包括从所述受试者分离所述中和抗体或中和抗血清。

实施方式65.根据实施方式64所述的方法，所述方法还包括通过被动免疫向人类受试者给药有效量的所分离的中和抗体或中和抗血清以预防或治疗RSV感染。

实施方式66.根据实施方式62至65中任一项所述的方法，其中针对所述RSV的所述中和抗体或中和抗血清包含针对所述RSV F蛋白肽或其片段或表位的多克隆抗体，任选地其中所述中和抗体或中和抗血清不含或基本上不含针对所述胶原蛋白C端前肽的抗体。

实施方式67.根据实施方式62至65中任一项所述的方法，其中所述中和抗体包含针对所述RSV F蛋白肽或其片段或表位的单克隆抗体，任选地其中所述中和抗体不含或基本上不含针对所述胶原蛋白C端前肽的抗体。

实施方式68.根据实施方式1至47和49中任一项所述的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米粒子、VLP、分离的核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗，用于在受试者中诱导对RSV的免疫应答，和/或用于治疗或预防RSV感染。

实施方式69.根据实施方式1至47和49中任一项所述的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米粒子、VLP、分离的核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗的用途，用于在受试者中诱导对RSV的免疫应答，和/或用于治疗或预防RSV感染。

实施方式70.根据实施方式1至47和49中任一项所述的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米粒子、VLP、分离的核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗的用途，用于制造药物或预防剂，所述药物或预防剂用于在受试者中诱导对RSV的免疫应答，和/或用于治疗或预防RSV感染。

实施方式71.一种分析样品的方法，所述方法包括：将样品与根据实施方式1至33中任一项所述的蛋白质接触，以及检测所述蛋白质与能够特异性结合到所述RSV的所述F蛋白肽或其片段或表位的分析物之间的结合。

实施方式72.根据实施方式71所述的方法，其中所述分析物是识别所述F蛋白肽或其片段或表位的抗体、受体或细胞。

实施方式73.根据实施方式71或72所述的方法，其中所述结合表明所述样品中存在所述分析物，和/或所述样品所来源的受试者感染了所述RSV。

实施方式74.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据实施方式1至33中任一项所述的蛋白质以及容纳或固定所述蛋白质的基材、衬垫或小瓶，任选地其中所述试剂盒是ELISA或测流测定试剂盒。

实施例

包括以下实施例仅用于说明目的，而非旨在限制本发明的范围。

实施例1：包含RSV F蛋白肽的重组多肽的产生

产生了包含RSV F蛋白肽的重组多肽的分泌形式作为候选疫苗。

RSV F糖蛋白构建体来源于RSV A2毒株(登录号AAC55970)。对编码F蛋白肽的残基1至520的序列进行了密码子优化，合成并亚克隆到编码人α1胶原蛋白C前肽的哺乳动物表达载体中的Hind III和BglⅡ位点。图1A示出了示例性重组多肽的示意图。

将重组质粒转染到GH-CHO(dfhr-)细胞中，选择无次黄嘌呤胸腺嘧啶(HT)(Invitrogen)，随MTX(Sigma)浓度增加逐步扩增基因以便在使用CD007-4 TM1培养基(Jianshun Biosciences)的无血清培养下高滴度表达融合蛋白。示例性重组多肽通过与Endo180亲和结合，使用盐梯度洗脱进行初步纯化，然后在Superdex 200凝胶过滤柱(GEHealthcare)上进一步纯化。通过尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)，根据制造商的说明书(SepaxTechnologies)测定包含RSV F肽的示例重组多肽的纯度。

在无血清补料分批培养过程中，发现二硫键连接的融合肽(例如三聚体)的生产滴度高达约0.15g/L(图1B)。含有三聚化重组多肽的条件培养基首先通过与蛋白A色谱柱预捕获的Fc标记的胶原蛋白受体uPARAP/Endo180(甘露糖受体家族的成员)亲和结合(Thomas等人,(2005)J.Biol.Chem.280,22596-22605)，然后进行凝胶过滤色谱来进行纯化。SEC-HPLC分析表明示例性重组多肽三聚体的纯度是约95％(图1C)。

在8％SDS-PAGE上在非还原或还原条件下分离纯化的示例性三聚化重组多肽(0.1μg)并转移到PVDF膜。用含5％脱脂乳的PBS阻断后，将膜用小鼠抗RSV F单克隆抗体(Millipore)或帕利珠单抗(AbbVie)和兔抗I型原胶原蛋白C前肽(CICP)多克隆抗体(Millipore)孵育。上样2μg纯化的示例性重组多肽三聚体以进行考马斯蓝染色。图2A示出了融合肽表达为共价连接的三聚体蛋白质。

通过使用对F和三聚化肽特异的抗体进行蛋白质印迹分析进一步证实了该纯化的重组多肽的结构特征和完整性(图2A)。

通过负染色电子显微术分析纯化的重组多肽三聚体。将纯化的重组多肽稀释到50ug/mL，并施加到已在12mA下辉光放电20s的碳涂层400CU网格上5s。网格用1％(w/v)甲酸双氧铀负染色20秒。通过在120KeV操作的FEI Tecnai spirit电子显微镜采集样品，以180,000倍放大倍率拍摄显微照片。图2B示出了蛋白质中聚集的重组多肽三聚体，宏观结构主要呈莲座样寡聚物形式，这与对全长F蛋白的观察结果类似(Calder等人,(2000)Virology271,122-131；Smith等人,(2012)PloS One 7,e50852)。莲座中的分子是拐杖形棒，它们较宽的末端从中心向外突出，与所报告的F融合后构象一致(Swanson等人,(2011)Prot.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108,9619-9624)。

通过fortebio OCTET QKe系统(Pall)，使用生物层干涉法(BLI)测量单克隆抗体帕利珠单抗与示例性重组多肽三聚体的亲和结合。将5μg/mL帕利珠单抗直接固定在蛋白A传感器上，然后在PBS中平衡并放入含有融合肽的2倍稀释液(从20μg/mL开始)的孔中。通过浸入PBS中来进行解离，使用数据分析软件，通过减去缓冲液参考值将数据处理成1:1结合模型。

帕利珠单抗与纯化的示例性重组多肽的结合亲和力表现出小于1皮摩尔的K

实施例2：包含RSV F蛋白肽的重组多肽的功能表征

为了评估如实施例1所述产生的示例性重组多肽的免疫原性和保护功效，随机分组的BALB/c小鼠在第0天和第21天用三种剂量(1、6和30μg)之一的有或无铝剂吸附(Imject铝剂佐剂(Thermo Scientifc))的示例性融合多肽经肌肉内免疫接种两次。用PBS免疫接种的另一组充当对照组。在第49天收集血清，然后用1×10

用酶联免疫吸附测定(ELISA)评价血清。简而言之，96孔板在4℃下用2μg/mL纯化的示例性融合肽(在PBS中)包覆过夜，并用1mg/mL BSA阻断。将板用PBST洗涤，随后与血清的连续2倍稀释液(1:64至1:262,144)一起室温孵育2小时。通过HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(SouthernBiotech)室温检测结合的抗体1小时。用TMB(Thermo)开展酶促反应并通过加入2M HCl终止酶促反应并记录450nm下的吸光度。使用相同稀释度的PBS免疫接种小鼠血清作为阴性对照组，抗体滴度定义为导致OD RSV F三聚体与OD PBS的比率为2.0的血清稀释度。

血清分析显示，用示例性重组多肽免疫接种的所有组都具有高水平的RSV F蛋白肽特异性抗体，并表现出剂量依赖性和佐剂依赖性方式(图3B)。通过微量中和测定来测量抗F抗体的中和活性。

使用HeLa细胞和RSV A2毒株进行RSV微量中和测定。血清在56℃下加热灭活30分钟，并连续稀释在96孔细胞培养板中的无血清DMEM中(50μL/孔)。向板中加入相等体积的病毒(1,000pfu/mL，在无血清DMEM制备)，将血清/病毒混合物在37℃孵育1小时。向板中加入含大约5×10

微量中和测定表明，示例性重组多肽诱导的抗F抗体具有有效的RSV中和活性，在相同剂量的示例性重组多肽下，与铝剂佐剂共同注射诱导了更高的中和抗体滴度。这些结果与抗F抗体的结果一致(图3C)。

通过在病毒激惹后第5天测定肺部的病毒复制来评估示例性重组多肽的保护功效。鼻内RSV激惹后五天将小鼠处死，对所收集的左肺进行称重并在1mL无血清DMEM中形成匀浆。通过在4℃以1,000×g离心10分钟使匀浆澄清，根据上述方法通过噬斑测定来滴定肺样品中的病毒。

结果表明，所有示例性重组多肽免疫接种的小鼠都完全被保护免于RSV复制并且没能检测到病毒，而PBS免疫接种的对照组显示出高水平的肺内病毒载量(图3D)。

由于抗原位点II在示例性重组多肽上是暴露的(参见实施例1和图2C)，因此进行了帕利珠单抗竞争性ELISA，以确定示例性重组多肽诱导的抗体是否针对该位点。

使用包覆5×10

在存在或不存在铝剂佐剂的情况下，在从用RSV F三聚体免疫接种的小鼠收集的所有血清样品都观察到对帕利珠单抗与热灭活RSV(HI-RSV)粒子结合的抑制(图3E)。这些结果证明，示例性融合肽免疫接种所诱导的中和抗体可以至少通过靶向病毒的抗原位点II而有效地防止受激惹小鼠肺中的RSV复制。

因为FI-RSV疫苗接种意外地增强了疾病严重程度(Kim等人,(1969)Am.J,Epidemiol.89,422-434；Chin等人,(1969)Am.J.Epidemiol.89,449-463)，因此安全性监测是RSV候选疫苗开发的首要任务(Murata,Y.(2009)Clin.Lab.Med.29,725-739)。对激惹后5天从免疫接种的小鼠获得的肺组织进行组织学检查，以评估示例性重组多肽的安全性。

将所收集的右肺组织固定在10％中性缓冲福尔马林中，石蜡包埋，以5μm切片，用H&E染色以进行组织病理学评估。在尼康显微镜下以200倍放大倍率拍摄照片。

H&E染色显示PBS免疫接种的对照组表现出一定程度的肺泡炎、细支气管周炎和血管周炎，并伴有明显的炎性细胞浸润(图4)。相比之下，无论存在或不存在铝剂佐剂，在任何剂量的示例性重组多肽免疫接种的动物中都出现有限的免疫细胞浸润并且没有明显病理变化(图4)。这一结果支持示例性重组多肽免疫接种能保护免于RSV感染后疫苗介导的增强疾病。

本发明不希望在范围上局限于特定的所公开的实施方式，所公开的实施方式是为了例如说明本发明的各个方面而提供。所述组合物和方法的各种修改将从本文的描述和教导中显而易见。这些变化可以在不脱离本公开的真实范围和精神的情况下实施，并且希望落在本公开的范围内。

序列

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序列表

<110> 四川三叶草生物制药有限公司

<120> RSV疫苗组合物、方法及其用途

<130> 16576-20002.42

<140> 尚未分配

<141> 同时随同提交

<150> PCT/CN2021/087045

<151> 2021-04-13

<150> PCT/CN2020/095295

<151> 2020-06-10

<160> 63

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

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<211> 806

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<211> 520

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<210> 23

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<211> 520

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<210> 26

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<400> 26

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Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

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<210> 27

<211> 495

<212> PRT

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<220>

<223> 合成构建体

<400> 27

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202530

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Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys

485 490 495

<210> 28

<211> 520

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 28

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1 5 1015

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505560

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65707580

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859095

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100 105 110

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115 120 125

Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Ala Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

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180 185 190

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<210> 29

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 29

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1 5 1015

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202530

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505560

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<210> 30

<211> 520

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 30

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 1015

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Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

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Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

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<210> 31

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 31

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<210> 32

<211> 574

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<220>

<223> 合成构建体

<400> 32

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165 170 175

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180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

195 200 205

Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Ala Thr Val Ile Glu Phe Gln

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Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

325 330 335

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355 360 365

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370 375 380

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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<210> 33

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 33

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1 5 1015

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2025

<210> 34

<211> 84

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 34

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1 5 1015

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202530

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<210> 35

<211> 84

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 35

Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser

1 5 1015

Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile

202530

Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp

354045

Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala

505560

Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn

65707580

Arg Ala Arg Arg

<210> 36

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 36

Arg Ala Arg Arg

1

<210> 37

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 37

Arg Ala Arg Ala

1

<210> 38

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 38

Glu Leu Pro Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr

1 5 1015

Asn Val Thr Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg

2025

<210> 39

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 39

Lys Lys Arg Lys Arg Arg

1 5

<210> 40

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 40

Lys Lys Arg Lys Arg Ala

1 5

<210> 41

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 41

Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val

1 5 1015

Ala Val Ser

<210> 42

<211> 388

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 42

Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val

1 5 1015

Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys

202530

Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly

354045

Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp

505560

Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn

65707580

Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu

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100 105 110

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130 135 140

Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val

145 150 155 160

Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro

165 170 175

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180 185 190

Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp

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210 215 220

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225 230 235 240

Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp

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260 265 270

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275 280 285

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Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu

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340 345 350

Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala

355 360 365

Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys

370 375 380

Ser Thr Thr Asn

385

<210> 43

<211> 388

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 43

Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val

1 5 1015

Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys

202530

Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly

354045

Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp

505560

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65707580

Ile Ala Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu

859095

Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser

100 105 110

Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met

115 120 125

Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile

130 135 140

Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val

145 150 155 160

Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro

165 170 175

Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu

180 185 190

Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp

195 200 205

Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val

210 215 220

Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro

225 230 235 240

Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp

245 250 255

Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr

260 265 270

Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala

275 280 285

Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp

290 295 300

Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu

305 310 315 320

Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu

325 330 335

Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe

340 345 350

Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala

355 360 365

Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys

370 375 380

Ser Thr Thr Asn

385

<210> 44

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 44

Ile Met Ile Thr Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser

1 5 1015

Leu Ile Ala Val Gly Leu Leu Leu Tyr Cys

2025

<210> 45

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 45

Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser Lys Asp Gln Leu Ser Gly

1 5 1015

Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn

20

<210> 46

<211> 365

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 46

Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu

1 5 1015

Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val

202530

Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu

354045

Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr

505560

Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg

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Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met

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Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr

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Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln

115 120 125

Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr

130 135 140

Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys

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Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn

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Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly

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Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile

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Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly

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Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser

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Asn Lys Gly Met Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val

290 295 300

Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile

305 310 315 320

Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser

325 330 335

Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg

340 345 350

Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys

355 360 365

<210> 47

<211> 365

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 47

Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu

1 5 1015

Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val

202530

Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu

354045

Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Ala Thr

505560

Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg

65707580

Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met

859095

Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr

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Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln

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Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr

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Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys

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Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn

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180 185 190

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Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly

245 250 255

Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys

260 265 270

Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser

275 280 285

Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val

290 295 300

Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile

305 310 315 320

Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser

325 330 335

Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg

340 345 350

Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys

355 360 365

<210> 48

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 48

Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu Lys

1 5 1015

Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser Arg

202530

Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys His Ser Asp

354045

Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Asn Leu

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Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr Cys Val

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Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp Pro Ala Asp Val

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Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr Met Asp Gln Gln

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Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Gln Gly Ser Asn Glu Ile

165 170 175

Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr Val

180 185 190

Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile Glu

195 200 205

Tyr Lys Thr Thr Lys Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala Pro

210 215 220

Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly Pro

225 230 235 240

Val Cys Phe Leu

<210> 49

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 49

Arg Ser Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr

1 5 1015

Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly

202530

Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys His

354045

Ser Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys

505560

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65707580

Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr Ile

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130 135 140

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Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Gln Gly Ser Asn

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Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val

180 185 190

Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val

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210 215 220

Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val

225 230 235 240

Gly Pro Val Cys Phe Leu

245

<210> 50

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 50

Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr

1 5 1015

Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

202530

Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln

354045

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505560

Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu

65707580

Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser

859095

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Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Asn

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Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr Cys

130 135 140

Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr Ile Ser

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Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu Ser Met Thr

165 170 175

Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp Pro Ala Asp

180 185 190

Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu Ala Ser

195 200 205

Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr Met Asp Gln

210 215 220

Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Gln Gly Ser Asn Glu

225 230 235 240

Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr

245 250 255

Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile

260 265 270

Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala

275 280 285

Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly

290 295 300

Pro Val Cys Phe Leu

305

<210> 51

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 51

Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr

1 5 1015

Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

202530

Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln

354045

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Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu

65707580

Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser

859095

Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys His Ser

100 105 110

Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Asn

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Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr Cys

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Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu Ser Met Thr

165 170 175

Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp Pro Ala Asp

180 185 190

Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu Ala Ser

195 200 205

Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr Met Asp Gln

210 215 220

Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Gln Gly Ser Asn Glu

225 230 235 240

Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr

245 250 255

Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile

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Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala

275 280 285

Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly

290 295 300

Pro Val Cys Phe Leu

305

<210> 52

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 52

Arg Ser Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly

1 5 1015

Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro

202530

Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu

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Ala Asn Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr

65707580

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Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu Ser

165 170 175

Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp Pro

180 185 190

Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu

195 200 205

Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr Met

210 215 220

Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Gln Gly Ser

225 230 235 240

Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser

245 250 255

Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr

260 265 270

Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp

275 280 285

Val Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp

290 295 300

Val Gly Pro Val Cys Phe Leu

305 310

<210> 53

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 53

Gly Ser Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly

1 5 1015

Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro

202530

Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu

354045

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505560

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65707580

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Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys

100 105 110

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115 120 125

Cys Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu

130 135 140

Thr Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu Ser

165 170 175

Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp Pro

180 185 190

Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu

195 200 205

Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr Met

210 215 220

Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Gln Gly Ser

225 230 235 240

Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser

245 250 255

Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr

260 265 270

Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp

275 280 285

Val Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp

290 295 300

Val Gly Pro Val Cys Phe Leu

305 310

<210> 54

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 54

Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu Lys

1 5 1015

Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser Arg

202530

Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys His Ser Asp

354045

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505560

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859095

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<220>

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<400> 60

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<210> 61

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 61

Glu Pro Met Asp Phe Lys Ile Asn Thr Asp Glu Ile Met Thr Ser Leu

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Val Cys Phe Leu

<210> 62

<211> 245

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<213> 人工序列

<220>

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<400> 62

Ser Glu Pro Met Asp Phe Lys Ile Asn Thr Asp Glu Ile Met Thr Ser

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Ala Ser Gly Asn Val Lys Lys Ala Leu Lys Leu Met Gly Ser Asn Glu

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210 215 220

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Pro Val Cys Phe Leu

245

<210> 63

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 63

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130 135 140

Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Met Asp

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Gln Ala Ser Gly Asn Val Lys Lys Ala Leu Lys Leu Met Gly Ser Asn

165 170 175

Glu Gly Glu Phe Lys Ala Glu Gly Asn Ser Lys Phe Thr Tyr Thr Val

180 185 190

Leu Glu Asp Gly Cys Thr Lys His Thr Gly Glu Trp Ser Lys Thr Val

195 200 205

Phe Glu Tyr Arg Thr Arg Lys Ala Val Arg Leu Pro Ile Val Asp Ile

210 215 220

Ala Pro Tyr Asp Ile Gly Gly Pro Asp Gln Glu Phe Gly Val Asp Val

225 230 235 240

Gly Pro Val Cys Phe Leu

245