一种来源于凡纳对虾血蓝蛋白的降低血氨毒性及浓度的降解片段PvHMCs27及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种来源于凡纳对虾血蓝蛋白的降低血氨毒性及浓度的降解片段PvHMCs27及其应用。

背景技术

氨氮、亚硝酸盐和硝酸盐是水体中最常见的无机氮，这些无机氮对水生生物非常重要，同时它们可能具有较强的毒性。尤其是氨氮，作为水体中的营养盐，其不仅是监测环境污染的重要指标之一，也可以反映生物体生存状况。氨氮的存在形式有两种：NH

发明内容

本发明的目的在于，解决水产养殖环境中的氨氮累积对对虾造成不良影响问题。

经过研究发现，对虾血蓝蛋白可能与谷氨酰胺转氨酶存在相互作用，并发现血蓝蛋白可以通过调控凡纳对虾肝胰腺中抗氧化系统而影响ROS水平。这些研究结果提示对虾血蓝蛋白可响应氨氮胁迫的过程。鉴于对虾血蓝蛋白可以通过基因多态性，翻译后修饰及降解形成具有免疫学活性的降解片段以发挥其多种多样的生物学功能。因此，通过寻找发现具有降低对虾血氨毒性和浓度的血蓝蛋白降解片段PvHMCs27，添加到饲料中增强对虾体质，以提高对虾抗氨氮的能力，能较好地解决水产养殖环境中的氨氮累积对对虾造成不良影响问题。

一种来源于凡纳对虾血蓝蛋白降低血氨毒性及浓度的降解片段PvHMCs27，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种上述来源于凡纳对虾血蓝蛋白降低血氨毒性及浓度的降解片段PvHMCs27的编码基因，如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供一种上述编码基因的表达盒。

本发明还提供一种上述编码基因的重组菌。

目前，节肢动物尤其是对虾尚无细胞系层面，因此，为得到该蛋白片段，本发明通过将降解片段PvHMCs27的PCR产物纯化后转化到大肠杆菌中进行培养，筛选构建了HMCs27的原核表达菌株。

本发明还提供一种上述编码基因的重组载体。

本发明还提供上述来源于凡纳对虾血蓝蛋白降低血氨毒性及浓度的降解片段PvHMCs27、上述编码基因或上述重组载体在制备降低血氨毒性及浓度的产品中的用途。

本发明还提供一种用于降低血氨毒性及浓度的产品，含有上述来源于凡纳对虾血蓝蛋白降低血氨毒性及浓度的降解片段PvHMCs27、上述编码基因或上述重组载体中的一种或多种。

进一步的，上述产品包括注射剂，可以用于虾蟹类、特别是对虾的免疫调理或增强。

进一步的，上述产品包括饲料添加剂。

进一步的，上述产品包括含有所述饲料添加剂的饲料。

本发明的降低血氨毒性和浓度降解片段PvHMCs27可以采用本领域技术人员已知的方法进行原核表达和纯化。

与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：

本发明从氨氮胁迫12h的凡纳对虾血浆中，通过双向电泳联合生物质谱等方法，分离鉴定到约13.70kDa来源于血蓝蛋白的降解片段PvHMCs27，通过De novo质谱测序等方法获得PvHMCs27的全部氨基酸序列信息，根据PvHMCs27氨基酸序列相对应的核苷酸，设计引物，克隆得到PvHMCs27核苷酸序列，并构建到原核表达载体转化到大肠杆菌中，通过诱导表达并纯化得到重组PvHMCs27。在此基础之上，进一步分析体内注射PvHMCs27前后联合氨氮胁迫后对对虾的影响，发现该降解片段一方面可以通过提高对虾抗氧化系统，增强组织修复相关酶的表达进而降低血氨对肝胰腺的氧化损伤程度，进而提高氨氮胁迫下对虾的存活率。另一方面可以促进TCA循环，产生较多的二氧化碳，降低体内pH值，中和体内较多的NH

附图说明

图1为实施例1分离得到本发明的降低血氨毒性及浓度的血蓝蛋白降解片段PvHMCs27的2-DE图；

图2为本发明的降低血氨毒性及浓度的降解片段PvHMCs27和对照GST的SDS-PAGE图；

图3为本发明的降低血氨毒性及浓度的降解片段PvHMCs27注射对虾并联合氨氮胁迫下，凡纳对虾的存活情况分析图；

图4为本发明的降低血氨毒性及浓度的降解片段PvHMCs27注射对虾并联合氨氮胁迫下，对虾肝胰腺转录组中差异表达基因的GO注释分析图；

图5为本发明的降低血氨毒性及浓度的降解片段PvHMCs27注射对虾并联合氨氮胁迫下，对虾肝胰腺转录组中差异表达基因的KEGG注释分析图；

图6为本发明的降低血氨毒性及浓度的降解片段PvHMCs27注射对虾并联合氨氮胁迫下，对Cu-Zn SOD(superoxide dismutase[Cu-Zn]-like)、CAT(catalase-like)、GPX(glutathione peroxidase-like)、GST(glutathione S-transferase)、Cyt C(cytochromec)、IDH(isocitrate dehydrogenase)、trypsin、chymotrypsin等抗氧化、代谢和水解相关基因的qPCR分析图；

图7为本发明的降低血氨毒性及浓度的降解片段PvHMCs27注射对虾并联合氨氮胁迫下，对CAT(过氧化氢酶)、SOD(超氧化物歧化酶)、T-AOC(总抗氧化能力)等酶活性影响分析图；

图8为本发明的降低血氨毒性及浓度的降解片段PvHMCs27注射对虾并联合氨氮胁迫下，对血氨含量和血浆pH的变化影响分析图；

图9为本发明的降低血氨毒性及浓度的降解片段PvHMCs27注射对虾并联合氨氮胁迫下，对血浆ALT和GST含量变化影响分析图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：与降低血氨毒性及浓度有关的对虾血蓝蛋白降解肽段的分离和鉴定

(1)将氯化铵添加到10‰海水中，并配将其配制成氨氮终浓度为150mg/L，对照组使用无任何处理的10‰海水，在氨氮胁迫下养殖对虾12h后，抽取对虾血淋巴。用75％酒精棉球擦拭对虾头胸甲后缘，一次性注射器从对虾心脏抽取血淋巴并与抗凝剂(1:1)混合。4℃，800g离心10min，去除血细胞，取上清。4℃，32000rpm超速离心10h，去除大部分完整的血蓝蛋白，取上清。预冷丙酮沉淀，去除不溶性蛋白，并用上样缓冲液溶解，于-20℃保存备用。

(2)采用BCA法测定蛋白浓度。首先在96孔板各孔中加入20μl不同浓度的BSAProtein Standard、待测样品和空白对照，然后依次向各孔中加入200μl BCA工作液，混合均匀；37℃放置30min，自然冷却至室温；使用酶标仪测定562nm波长(或540～590nm波长)下的吸光值；根据蛋白标准品浓度和吸光值，制作蛋白浓度标准曲线；最后根据蛋白浓度标准曲线和样品稀释倍数计算样品的蛋白浓度。

(3)双向电泳第一向等电聚焦。取150μl水化上样缓冲液(使用前加入0.01g DTT，5μl Bio-Lyte 3-10)，加入200μg蛋白样品充分混匀，离心除去气泡。沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液需连贯。将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，确保胶条与电极紧密接触。在每根胶条上覆盖1ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序：50V主动水化12h，250V慢速除盐1h，1000V慢速除盐2h，4000V线性升压2h，4000V快速聚焦至32000Vh，500V保持24h。聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向Tricine-SDS-PAGE电泳，或者将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存备用。

(4)双向电泳第二向Tricine-SDS-PAGE。参照

(5)比对实验组和对照组2-D电泳图，如图1所示，可以发现氨氮胁迫对虾12h后的血淋巴中29kDa以下的小分子肽段明显比对照组多，使用美国Bio-Rad公司提供的PDQuest8.0软件进行凝胶图像分析，并寻找表达差异蛋白点。

(6)质谱鉴定。将差异显著(上调或下调)的蛋白点挖胶，送至汕头大学医学院进行质谱分析，鉴定是何种蛋白。

实施例2：与降低血氨毒性及浓度有关的对虾血蓝蛋白降解肽段分子特征分析

(1)根据质谱结果，将鉴定为血蓝蛋白且具有显著性差异的蛋白点进行切胶回收。

(2)将蛋白胶点送至深圳微纳菲进行De novo质谱测序。

(3)在测序结果中，成功获得PvHMCs27降解片段全长122个氨基酸序列的全部信息，其理论Mw为13.70kDa，与血蓝蛋白小亚基M端277–398个氨基酸100％匹配。PvHMCs27的氨基酸组如下：

Lys-Tyr-Gly-Gly-Gln-Phe-Pro-Ala-Arg-Pro-Asp-Asn-Val-Lys-Phe-Glu-Asp-Val-Asp-Asp-Val-Ala-Arg-Ile-Arg-Asp-Met-Val-Ile-Val-Glu-Ser-Arg-Ile-Arg-Asp-Ala-Ile-Ala-His-Gly-Tyr-Ile-Val-Asp-Ser-Glu-Gly-Lys-His-Ile-Asp-Ile-Ser-Asn-Glu-Lys-Gly-Ile-Asp-Ile-Leu-Gly-Asp-Ile-Ile-Glu-Ser-Ser-Leu-Tyr-Ser-Pro-Asn-Val-Gln-Tyr-Tyr-Gly-Ala-Leu-His-Asn-Thr-Ala-His-Ile-Val-Leu-Gly-Arg-Gln-Gly-Asp-Pro-His-Gly-Lys-Phe-Asp-Leu-Pro-Pro-Gly-Val-Leu-Glu-His-Phe-Glu-Thr-Ala-Thr-Arg-Asp-Pro-Ser-Phe-Phe-Arg-Leu-His

实施例3：PvHMCs27基因克隆与原核表达

(1)根据多肽的N端和C端序列，定位至血蓝蛋白小亚基M端277–398氨基酸序列中，结合核苷酸序列：AAGTATGGAGGTCAGTTCCCTGCTCGTCCTGACAATGTTAAATTCGAAGATGTGGACGATGTTGCTCGAATTCGAGATATGGTCATCGTGGAGAGTCGAATTCGTGATGCCATTGCCCATGGCTATATAGTTGACAGTGAGGGCAAACACATTGACATCAGTAATGAGAAAGGTATTGACATTCTTGGTGATATCATCGAATCCTCACTATACAGTCCCAACGTGCAGTACTATGGAGCTTTACATAACACTGCCCATATTGTACTAGGCCGTCAAGGGGATCCTCATGGAAAGTTTGATTTACCACCTGGTGTGCTGGAACACTTCGAAACTGCCACCCGTGATCCCAGCTTCTTCCGGCTTCAC，设计PCR引物，用肝胰腺的cDNA为模板进行PCR扩增。目的条带使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(上海生工)回收纯化，方法参见试剂盒说明手册，并测浓度，用于下一步实验。

(2)纯化后的PCR产物和pGEX-6p-1用限制性内切酶进行酶切，胶回收后测浓度，并用T4连接酶于16℃过夜酶连。连接产物转化大肠杆菌菌株BL21中，并在含有100μg/mL氨苄青霉素(AMP)的LB固体培养基上，于37℃倒置培养。

(3)挑取单菌落，于含100μg/mL Amp的LB液体培养基37℃中培养。并进行菌液PCR验证，根据验证结果，部分送至华大科技测序验证序列的正确性。并依据测序结果，保留序列正确的菌种。在菌液中加入终浓度为20％的甘油，-20℃保存备用。

(4)将测序正确的菌株用于诱导表达。测序正确的菌株按1：100的比例加入液体LB培养基中(含AMP 100μg/mL)；37℃，180rpm摇床培养至OD600为0.6左右时加入IPTG至终浓度0.05mM，同时取出1mL菌液作为未诱导对照；将在37℃诱导16h后的菌液转移至离心管中，4℃ 5000g离心20min，收集菌体；加入适量超声破碎缓冲液(含50mM Tris，5mM EDTA，100mMNaCl，pH8.0，现加1mM PMSF)重悬浮菌体；置于冰上超声破碎菌体；4℃ 20000g离心30min，分别收集上清和沉淀；进行SDS-PAGE分析，验证是否有诱导表达。

(5)将含有目的片段的包涵体通过8M尿素变性2h，4℃透析液(50mM Tris-HCL,50mM NaCl,10％Glycine,10％Glycerol,pH 8.0)透析48h(24h换一次透析液)，收集透析后的蛋白液。

(6)采用GST柱材(GE Heathercare，US)纯化GST标签的PvHMCs27(简写为rGST-HMCs27，下同)。

(7)采用PreScission Protease(GE Healthcare，US)将GST标签去除，获得原核表达蛋白PvHMCs27。

(8)按照上述步骤将转化了pGEX-6P-1质粒的大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达，用GST柱材纯化GST标签蛋白，采用10mM的还原性谷胱甘肽将GST从柱材上特异性洗脱下来，-20℃保存备用。

SDS-PAGE分析如图2所示：得到纯化的重组GST蛋白(rGST)和重组PvHMCs27(rGST-HMCs27)。

实施例4：rGST-PvHMCs27注射联合氨氮胁迫对对虾存活情况分析

(1)将重组表达的降解片段PvHMCs27用灭菌的0.01M PBS(pH7.4)稀释至50μg/mL(阴性对照为重组表达的GST：50μg/mL)，用无菌的1ml注射器取100μl重组蛋白液于第二腹节处注射对虾。

(2)随后进行氨氮(150mg/L)胁迫实验，并于0,6,12,18,24,30h记录对虾存活情况，

结果如图3所示，发现注射降解片段PvHMCs27并联合氨氮胁迫24h，对虾存活率显著提升。

实施例5：rGST-PvHMCs27注射联合氨氮胁迫对对虾肝胰腺转录组影响分析

(1)采用与实施例4相同的处理条件对凡纳对虾进行养殖。

(2)于24h随机挑选5只凡纳对虾，取肝胰腺组织，采用Trizol法提取肝胰腺总RNA，经过分子胶电泳和浓度测定后，送至上海美吉生物公司进行转录组测序分析。

结果如图4-5所示，利用GO数据库对rGST-HMCs27注射前后联合氨氮胁皮条件下检测到的差异973个基因进行分析，基因被注释到三大分类中(细胞组成:Cellularcomponent；分子功能:Molecular function；生物学过程:Biological process)，对其进一步分类，共获得20项功能亚类。其中，在细胞组成分类中，细胞膜组分(membrane part)、细胞组分(cell part)两个二级分类中注释到的基因最多，分别为222、115条。在分子功能分类中，主要富集在催化活性(catalytic activity)、结合(binding)两个功能亚类中，分别富集到211、209个基因。在生物学过程分类中，主要富集到细胞过程(cellular process)、代谢过程(metabolic process)两个亚类，分别富集到149、137个基因(图4)。

采用KEGG对前面获得的973条差异基因进行通路注释，结果发现，287、506个上调、下调表达基因共计793条基因被注释到对应的通路。其中，信号转导(Signaltransduction,上调、下调表达基因分别为22、43个)注释最多，其次还包括碳水化合物代谢(Carbohydrate metabolism,上调、下调表达基因共计31、32个)，内分泌系统(Endocrinesystem,上调、下调表达基因共计15、36个)，神经退行性疾病(Neurodegenerativedisease,上调、下调表达基因共计14、34个)，消化系统(Digestive system,上调、下调表达基因共计16、31个)，癌症概述(Cancer:overview,上调、下调表达基因共计11、35个)，运输和分解代谢(Transport and catabolism,上调、下调表达基因共计14、28个)，免疫系统(Immune system,上调、下调表达基因共计15、19个)，聚糖的生物合成与代谢(Glycanbiosynthesis and metabolism,上调、下调表达基因共计12、20个)，寄生性传染病(Infectious disease:parasitic,上调、下调表达基因共计5、25个)等通路相关的基因(图5)。

进一步，从上述差异基因中筛选出90个与代谢相关的差异表达基因，其中上调表达60个，下调表达30个(表1和2)。对这些差异基因进一步分析发现，与对照组相比，rGST-PvHMCs27注射联合氨氮胁迫组中Cu-Zn SOD(superoxide dismutase[Cu-Zn]-like)、CAT(catalase-like)、GPX(glutathione peroxidase-like)、Cyt C(cytochrome c)、IDH(isocitrate dehydrogenase)、trypsin和chymotrypsin等与抗氧化酶、代谢、水解相关酶(trypsin和chymotrypsin参与组织修复)的基因表达水平显著上调(表1)，GST(glutathione S-transferase)和ALT(alanine aminotransferase)等肝组织损伤指标相关基因表达水平显著下调(表2)。PvHMCs27可以通过增强抗氧化系统、代谢和组织修复(水解酶)相关基因的表达进而降低血氨毒性，提高对虾在氨氮胁迫下的适应能力。

表1降低血氨毒性及浓度的降解片段PvHMCs27注射对虾并联合氨氮胁迫下，对虾肝胰腺转录组中显著上调差异表达基因一览表

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表2降低血氨毒性及浓度的降解片段PvHMCs27注射对虾并联合氨氮胁迫下，对虾肝胰腺转录组中显著下调的差异表达基因一览表。

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实施例6：rGST-PvHMCs27注射联合氨氮胁迫对肝胰腺转录组学中变化显著基因的验证

(1)采用与实施例4相同的处理条件养殖凡纳对虾。

(2)于24h随机挑选5只健康凡纳对虾，取肝胰腺组织，采用RNAfast200试剂盒(上海飞捷)提取肝胰腺总RNA，按照反转录试剂盒

结果如图6所示，SOD、CAT、GPX、IDH、Cyt C、trypsin和chymotrypsin转录水平显著上调，GST转录水平显著下调，与测序结果相一致。

实施例7：rGST-PvHMCs27对对虾血氨含量和毒性的影响分析

(1)采用与实施例4相同的处理条件养殖凡纳对虾。

(2)于24h随机挑选5只凡纳对虾，取肝胰腺组织、血浆等。

(3)血氨含量检测(货号：A086-1-1，南京建成)、CAT检测(货号：A007-1-1，南京建成)、总抗氧化能力检测(货号：A015-3-1，南京建成)、总超氧化物气化酶检测(货号：A001-1-1，南京建成)、ALT检测试剂盒(货号：C009-2-1，南京建成)、GST检测试剂盒(货号：A004-1-1，南京建成)等，按照其说明书步骤进行操作，组织蛋白含量测定按照BCA方法执行，血浆pH采用pH计(Mettler Toledo，型号：FE20K)测定。

结果如图7～9所示，与对照组相比，rGST-HMCs27注射联合氨氮胁迫组中SOD、CAT的酶活和肝胰腺总抗氧化能力(各种抗氧化物质和抗氧化酶，T-AOC)等均显著上调(图7)，而血氨含量、血浆pH、血浆GST和ALT含量显著下调(图8～9)(P<0.05)。由此推测，PvHMCs27一方面可通过提高对虾抗氧化系统，降低氨氮对肝胰腺的氧化损伤程度，另一方面可通过诱导表达IDH促进TCA循环，产生较多的二氧化碳，降低体内pH值，中和体内较多的NH

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

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