同时检测4种CTV基因型的多重RT-PCR引物组、试剂盒与应用

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，尤其涉及一种同时检测4种CTV基因型的多重RT-PCR引物组、试剂盒与应用。

背景技术

柑橘衰退病是由柑橘衰退病毒(citrus tristezavirus，CTV)引起的对柑橘具有极大危害的一种经济性病害，其在世界各地广泛发生。CTV属于长线形病毒属(Closterovirus)，病毒粒子呈11×2000nm的长线形，基因组由约19300个核苷酸组成的正义单链RNA(+ssRNA)，是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒。柑橘衰退病根据指示植物表现的表型可分为3种症状类型：茎陷点型、速衰型和苗黄型。CTV存在复杂的株系分化现象，目前已检测11种CTV基因型：VT、T30、T36、T3、A18、T68(B165)、RB、HA16-5、S1、L1、M1；另外，在野生柑橘种检测到一种新的CTV基因型：JY。并且，同一柑橘植株常常混合侵染多种CTV基因型，使得明确基因型与表型的关系变得困难。

目前，最常用的CTV基因型检测体系主要有三种。第一种是利用限制性内切酶HinfⅠ对CTV的外壳蛋白基因扩增产物在37℃下进行消化，根据消化后不同片段长度的图谱分为7个组群，结合CTV在指示植物上表现的不同生物学症状，将7个组群划分为潜在的弱毒株系和强毒株系；但该方法无法将7个RFLP组群与CTV基因型对应，且逐渐发现越来越多无法归类的组群出现，导致该方法的应用越来越少。第二种是通过比较CTV 5′端基因组5′URT、K17及POL区域的序列差异，设计了10对引物用于检测VT、T30、T3和T36基因型；该方法较为繁琐，且同样存在无法归类的CTV分离物。第三种Roy等设计的检测B165、VT、T30、T3和T36基因型的特异性检测引物，是目前较为常用的CTV基因型检测体系。另外，RB、HA16-5、S1、L1、M1基因型的发现者均设计了检测各自新基因型的特异性引物。由于CTV基因型众多、检测引物繁多、基因型检测体系多样，导致CTV基因型检测程序复杂、耗时，而且常常不同体系间的检测结果不一致，给CTV基因型检测和CTV致病机理研究带来困扰。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测4种CTV基因型的多重RT-PCR引物组、试剂盒与应用，本发明的引物组和试剂盒能够快速同时检测T30、T68、JY、HA4种柑橘衰退病毒基因型，不但能快速、准确的确定待测样品是否侵染柑橘衰退病毒，还能确定侵染柑橘衰退病毒基因型是T30、T68、JY、HA中的一种还是多种，对完善CTV基因型的检测和防控有积极作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种同时检测4种柑橘衰退病毒基因型的多重RT-PCR引物组，所述4种柑橘衰退病毒基因型为T30、T68、JY、HA；所述多重RT-PCR引物组是由用于检测T30的引物、用于检测T68的引物、用于检测JY的引物和用于检测HA的引物组成；

T30上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，T30下游引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示；

T68上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，T68下游引物的核苷酸序列如SEQID No.4所示；

JY上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，JY下游引物的核苷酸序列如SEQID No.6所示；

HA上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，HA下游引物的核苷酸序列如SEQID No.8所示。

本发明还提供了上述的多重RT-PCR引物组在制备同时检测T30、T68、JY、HA柑橘衰退病毒基因型的试剂中的应用。

本发明还提供了同时检测T30、T68、JY、HA柑橘衰退病毒基因型的试剂盒，包括上述的多重RT-PCR引物组。

优选的，所述试剂盒包括PCR反应体系、RT反应体系、阳性质控品和阴性质控品。

优选的，所述RT反应体系包括解链液5μL、5×RT-buffer 4μL、30U/L的RNA酶抑制剂RNasin 0.5μL、100U/μL的反转录酶RTase 1μL、无RNase超纯水4.5μL，10μmol/L反转录引物1μL。

优选的，所述解链液由10μmol/L随机引物1.0μL、2.5mM/L dNTPs 1.0μL、RNA模板3.0μL组成。

优选的，所述PCR反应体系包括无RNase超纯水13.1μL、10×PCR-buffer4.5μL、2.5mM/L的dNTPs 2μL，10μmol/L上述的多重RT-PCR引物组的上下游引物0.5μL、r-Taq酶0.4μL、反转录产物cDNA模板1μL。

本发明还提供了一种利用上述试剂盒同时检测4种柑橘衰退病毒基因型的方法，包括以下步骤：利用所述多重RT-PCR引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，将PCR扩增产物进行片段分析，得到待测样品是否受T30、T68、JY、HA中的一种或多种CTV基因型侵染。

优选的，所述PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸50秒，35个循环。

优选的，所述片段分析是对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定待测样品中是否受T30、T68、JY和HA中的一种或多种CTV基因型侵染。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种同时检测4种CTV基因型的多重RT-PCR引物组、试剂盒与应用，本发明针对目前常见的CTV基因型全基因序列的差异设计了多对特异性引物，本发明的多重RT-PCR引物组或试剂盒具有特异性强、灵敏度高的特点，当T30、T68、JY和HA CTV基因型同时存在时，该多重RT-PCR引物组能够特异性检测T30、T68、JY和HA这4种CTV基因型，且DNA扩增片段大小适宜，多重PCR结果容易辨认。在cDNA模板稀释到10

附图说明

图1为CTV基因型多重RT-PCR引物组的特异性检测结果，其中，+：对应基因型的阳性样品；-：健康植株作为阴性对照；1：T30和T68混合侵染；2：T30和JY混合侵染；3：T30和HA混合侵染；4：T68和JY混合侵染；5：T68和HA混合侵染；6：JY和HA混合侵染；7：T30、T68和JY混合侵染；8：T30、T68和HA混合侵染；9：T68、JY和HA混合侵染；10：T30、JY和HA混合侵染；11：T30、T68、JY和HA混合侵染；

图2为CTV基因型多重RT-PCR引物组灵敏性检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种同时检测4种柑橘衰退病毒基因型的多重RT-PCR引物组，所述4种柑橘衰退病毒基因型为T30、T68、JY、HA；所述多重RT-PCR引物组是由用于检测T30的引物、用于检测T68的引物、用于检测JY的引物和用于检测HA的引物组成；

T30上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，T30下游引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示；

T68上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，T68下游引物的核苷酸序列如SEQID No.4所示；

JY上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，JY下游引物的核苷酸序列如SEQID No.6所示；

HA上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，HA下游引物的核苷酸序列如SEQID No.8所示。

本发明针对目前常见的CTV基因型全基因序列的差异设计了多对特异性引物，上述多重RT-PCR引物组可以快速、准确的同时区分T30、T68、JY、HA这4种CTV基因型，极大的提高CTV基因型检测的速率和效率。

本发明还提供了上述的多重RT-PCR引物组在制备同时检测T30、T68、JY、HA柑橘衰退病毒基因型的试剂中的应用。

本发明还提供了同时检测T30、T68、JY、HA柑橘衰退病毒基因型的试剂盒，包括上述的多重RT-PCR引物组。

在本发明中，所述试剂盒优选的包括PCR反应体系、RT反应体系、阳性质控品和阴性质控品。所述RT反应体系优选的包括5μL解链液、5×RT-buffer4μL、30U/L的RNA酶抑制剂RNasin 0.5μL、100U/μL的反转录酶RTase 1μL、无RNase超纯水4.5μL，10μmol/L反转录引物1μL。所述解链液优选的由10μmol/L随机引物(6N)1.0μL、2.5mM/L dNTPs 1.0μL、RNA模板3.0μL组成。所述PCR反应体系优选的包括无RNase超纯水13.1μL、10×PCR-buffer4.5μL、2.5mM/L的dNTPs 2μL，10μmol/L上述的多重RT-PCR引物组的上下游引物0.5μL、r-Taq酶0.4μL、反转录产物cDNA模板1μL。在本发明中，所述阳性质控品为含有T30基因型的柑橘衰退病毒样品、含有T68基因型的柑橘衰退病毒样品、含有JY基因型的柑橘衰退病毒样品和含有HA基因型的柑橘衰退病毒样品。所述阴性质控品为健康植株的样品。本发明对RT-buffer、RNA酶抑制剂RNasin、反转录酶RTase、无RNase超纯水、PCR-buffer、dNTPs、r-Taq酶的来源没有特殊限定，采用本领域公知的产品即可。

本发明还提供了一种利用上述试剂盒同时检测4种柑橘衰退病毒基因型的方法，包括以下步骤：利用所述多重RT-PCR引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，将PCR扩增产物进行片段分析，得到待测样品是否受T30、T68、JY和HA中的一种或多种CTV基因型侵染。

在本发明中，用上述试剂盒同时检测4种柑橘衰退病毒基因型的方法，优选的包括以下步骤：

1)提取待检测样品的RNA；

2)将步骤1)中RNA进行反转录，合成得到cDNA；

3)以步骤2)中所述cDNA为模板，利用上述多重RT-PCR引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

4)将步骤3)中所述PCR扩增产物进行片段分析，得到待测样品是否受T30、T68、JY和HA中的一种或多种CTV基因型侵染。

在本发明中，所述发转录的反应程序优选为：30℃反应10分钟，42℃反转录50分钟，70℃加热15分钟。所述PCR扩增程序优选为：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸50秒，35个循环。所述片段分析优选的是对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定待测样品中是否受T30、T68、JY和HA中的一种或多种CTV基因型侵染。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种同时检测4种柑橘衰退病毒基因型的多重RT-PCR引物组，所述4种柑橘衰退病毒基因型为T30、T68、JY、HA；所述多重RT-PCR引物组是由用于检测T30的引物、用于检测T68的引物、用于检测JY的引物和用于检测HA的引物组成，具体引物信息如表1所示。

表1 4种柑橘衰退病毒基因型的多重RT-PCR引物组

实施例2

一种基于RT-PCR技术同时检测上述4种柑橘衰退病毒基因型的方法，步骤如下：

(1)提取待检测样品的RNA：

S1、取0.1g柑橘叶片，液氮充分研磨后加入预先放置1mL Trizol溶液(Invitrogen，美国)的1.5mL的离心管中，剧烈振荡混匀后室温放置10分钟，将离心管在12900rpm，4℃下离心10分钟。

S2、取上清液1mL置于新的1.5mL的离心管中，加入200μL氯仿:异戊醇(24：1)，震荡混匀，4℃放置5分钟后12900rpm，4℃下离心5分钟。

S3、取步骤S2离心后的上清液(只取最上一层)置于新的1.5mL的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀后放置-20℃沉降2小时以上。

S4、将步骤S3中离心管在12000rpm，4℃离心10分钟，弃上清液后加入1mL 75％乙醇颠倒混匀，在8000rpm，4℃下离心3min，弃上清液；再离心15s用枪头吸弃上清液，重复2次。

S5、将步骤S4中含有RNA沉淀的离心管置于通风橱中室温干燥2～3min，加入30μLDEPC水溶解RNA。

(2)以步骤(1)所提取的RNA为模板，利用随机引物进行反转录反应，得到反转录产物cDNA。

反转录反应进行前需要解链反应：由3μLRNA反应模板、1μL浓度为2.5mM/L的dNTPs和1μL浓度为10μmol/L的随机引物(6N)组成5μL解链液，在65℃解链5分钟后加入反转录体系混合液进行反转录反应。反应体系为15μL，其中，解链液5μL、5×RT-buffer4μL、浓度为30U/L的RNA酶抑制剂RNasin 0.5μL、浓度为100U/μL的反转录酶RTase 1μL和4.5μL无RNase超纯水；反应程序为：30℃反应10分钟，42℃反转录50分钟，70℃加热15分钟。

(3)以步骤(2)得到的反转录产物cDNA为模板，用上述各基因型引物进行RT-PCR反应，反应体系为25μL，其中反应体系包括无RNase超纯水13.1μL、10×PCR-buffer4.5μL、浓度为2.5mM/L的dNTPs 2μL、反应体系中5对浓度为10μmol/L的实施例1所述各基因型上、下游引物各0.5μL、r-Taq酶0.4μL、反转录产物cDNA模板1μL；PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸50秒，35个循环。

实施例3

本实施例利用实施例1多重RT-PCR引物组中的一种或多种混合，按照实施例2的检测柑橘衰退病毒基因型的方法进行特异性评估，结果见图1。

结果如图1所示，当只含有T30、T68、JY、HA其中一种基因型时，多重RT-PCR引物组能够特异性扩增该基因型对应的片段；当2种基因型任意组合时，该多重RT-PCR引物组能够特异性扩增出这2种基因型对应的片段；当3种基因型任意组合时，该多重RT-PCR引物组能够特异性扩增出这3种基因型对应的片段；当4种基因型同时存在时，该多重RT-PCR引物组能够特异性扩增出这4种基因型对应的片段。因此上述多重RT-PCR引物组能够特异性检测T30、T68、JY、HA这4种CTV基因型。

实施例4

实施例1的多重RT-PCR引物组的灵敏性评估，按照如下步骤操作：

以实施例1得到的反转录cDNA模板，按10倍梯度稀释共6个梯度(10

由图2可知，在cDNA模板稀释到10

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。