一种多肽自组装GYK纳米粒子的制备方法及其检测谷胱甘肽和细胞内谷胱甘肽成像的用途

技术领域

本发明属于纳米材料领域，具体涉及一种多肽自组装GYK纳米粒子的制备方法及其检测谷胱甘肽和细胞内谷胱甘肽成像的用途。

背景技术

谷胱甘肽是一种天然存在于人体细胞内的活性三肽，发挥着多种重要功能，同时也是癌症的一种标志物。癌细胞为了阻止增值过程中产生的高水平活性氧对细胞组织造成的氧化损伤，往往会过量表达谷胱甘肽以维持氧化还原平衡，使得癌细胞内谷胱甘肽的浓度远高于正常细胞。因此谷胱甘肽作为细胞抗氧化系统中最重要的抗氧化剂之一，对其进行精确的检测具有非常重要的意义。

迄今为止，对谷胱甘肽的检测衍生出了许多方法，如荧光检测法，高效液相色谱法、电化学法、比色法等。而荧光检测法由于具有快速，操作简便的优点，且可应用于生物体内的实时成像，如今得到了研究与发展。荧光检测需要通过荧光探针来实现信号的转换，当前的荧光探针材料中，有机荧光基团，量子点、上转换材料具有水溶性差，生物毒性高的缺点，限制了它们在生物体内的应用，生物荧光蛋白尽管解决了生物相容性问题，但是存在易被光漂白、抗干扰性、热稳定性差的问题，且荧光强度难以达到其他材料的水平。

本发明利用具有自组装性能的多肽来产生荧光，代替传统荧光探针的发光结构，得到生物相容性高、检测快速、灵敏度高，并且适用于体内成像检测的新型多肽荧光探针。

发明内容

本发明的目的是提供一种低生物毒性的自组装结构多肽荧光检测谷胱甘肽的方法。为实现上述目的，所述多肽为甘氨酸-酪氨酸-赖氨酸(GYK)的氨基酸序列，所述多肽中酪氨酸上的苯酚基团，在氧化处理后能够交联产生疏水的联苯结构，促进多肽自组装成纳米粒子，所述纳米粒子能够作为荧光探针检测谷胱甘肽以及细胞内谷胱甘肽的成像。本发明所采用的技术方案是：

一种多肽自组装GYK纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：

(1)在甘氨酸-酪氨酸-赖氨酸形成的多肽溶液中，加入过氧化氢溶液，充分振荡均匀，得到混合溶液；

(2)向步骤(1)所得混合溶液中快速加入用水分散的二氧化锰粉末，充分震荡均匀，得反应体系；

(3)将步骤(2)所得反应体系置于37℃恒温摇床，充分进行自组装反应至少5h；反应结束后，离心去除二氧化锰，得到多肽自组装GYK纳米粒子，简称GYK NPs。

步骤(1)中，多肽的结构式为

步骤(2)中，二氧化锰粉末加水分散至50mg/mL；在反应体系中二氧化锰的浓度为10mg/mL。

进一步地，将本发明所述的多肽自组装GYK纳米粒子用于检测谷胱甘肽的用途，具体步骤为：

步骤A1：配置浓度为1mM的GYK NPs溶液150μL，接着每隔3-5min加入浓度为5mM的GSH溶液0.5μL，测试其荧光强度变化，直到不再变化，绘制线性图；

步骤A2：配置浓度为1mM的GYK NPs溶液150μL，然后加入0.5μL待测物，荧光光谱仪检测其荧光发射光谱，带入线性图，得到待测物的浓度。

其中，步骤A1和A2中，检测时的激发波长为360nm，发射波长范围为400-600nm，最大发射波长在505nm处。

进一步地，将本发明所述的多肽自组装GYK纳米粒子用于细胞内谷胱甘肽成像的用途，具体步骤为：

步骤B1：将L929细胞接种于激光共聚焦皿中，置于细胞培养箱中孵育；

步骤B2：将100μM GYK NPs溶液加入激光共聚焦皿中进行孵育；

步骤B3：以步骤B2中GYK NPs的浓度孵育细胞作为实验组，再加入50μM GSH孵育；

步骤B4：为了考察GYK NPs对细胞的成像位置的准确性，在共聚焦皿加入商业化膜染色剂DIL，然后用PBS洗涤；

步骤B5：在激光共聚焦扫描显微镜下记录荧光成像图。

本发明的有益效果为：

(1)本发明所制的多肽自组装GYK纳米粒子和谷胱甘肽结合，荧光猝灭，将其用于谷胱甘肽的检测和细胞内谷胱甘肽成像，检测灵敏；(2)本发明检测方法采用生物毒性较低的荧光多肽纳米材料，相对于传统的小分子荧光染料，不仅制备方法上比较简单，在体外能对谷胱甘肽进行快速灵敏的检测且，具有更好的生物相容性，能够更好的应用于细胞内成像的检测。

附图说明

图1为本发明检测方法中制备GYK NPs的流程图。

图2为本发明检测方法中制备的GYK NPs的荧光激发、发射光谱图。

图3为本发明检测方法中制备的GYK NPs的形貌图。

图4为本发明检测方法中制备的GYK NPs响应GSH的荧光发射光谱图。

图5为本发明检测方法中制备的GYK NPs响应GSH浓度检测曲线。

图6为本发明检测方法中制备的GYK NPs进行细胞成像检测的共聚焦图。

具体实施方式

本发明公开了一种利用自组装结构多肽荧光检测谷胱甘肽的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

一种利用自组装多肽荧光检测谷胱甘肽的方法，其步骤如下：

(1)在GYK多肽溶液中加入过氧化氢溶液，充分振荡均匀；

(2)向混合溶液中快速加入用水分散的二氧化锰粉末，充分震荡均匀；

(3)将反应体系置于37℃恒温摇床，充分反应至少5h；离心去除二氧化锰，得到GYK纳米粒子。

而且，步骤(1)所述的GYK多肽溶液终浓度为2.7mg/mL，过氧化氢溶液终浓度为0.6mM。

而且，步骤(2)所述的二氧化锰粉末，加水分散至50mg/mL，保持均匀的情况下，在反应体系中的浓度为10mg/mL。

本发明还提供了上述多肽自组装荧光检测谷胱甘肽的配置方法，步骤为：

步骤A1：配置浓度为1mM的GYK NPs溶液150μL，接着每隔3-5min加入浓度为5mM的GSH溶液0.5μL，测试其荧光强度变化，直到不再变化，绘制线性图；

步骤A2：配置浓度为1mM的GYK NPs溶液150μL，然后加入0.5μL待测物，荧光光谱仪检测其荧光发射光谱，带入线性图，得到待测物的浓度。

用荧光光谱仪检测上述溶液加入待测物后的荧光发射光谱，检测时的激发波长为360nm，发射波长范围为400–600nm，最大发射波长在505nm处。

基于本发明所述的自组装结构多肽(GYK NPs)，提供了一种细胞成像方法：

(1)将L929细胞接种于激光共聚焦皿中，置于细胞培养箱中孵育；

(2)将GYK NPs溶液加入激光共聚焦皿中进行孵育；

(3)以步骤(2)中GYK NPs的浓度孵育细胞作为实验组，再加入GSH孵育；

(4)为了考察GYK NPs对细胞的成像位置的准确性，在共聚焦皿加入商业化膜染色剂DIL，然后用PBS洗涤；

(5)在激光共聚焦扫描显微镜下记录荧光成像图。

具体地，相关制备及检测如下：

实施例1：GYK NPs的制备

(1)取浓度为1mg/mL(2.7mM)的GYK溶液100μL，加入60μL的2mM过氧化氢，搅拌至混合均匀；

(2)将二氧化锰以50mg/mL的比例在水中分散，在步骤1的混合溶液中快速加入40μL，快速搅拌均匀后，在37℃恒温条件下保持震荡至少5h直至反应充分；

(3)将反应体系在10000rpm下进行离心去除多余的二氧化锰粉末，分离得到GYKNPs的溶液，待后续检测中稀释后进行使用。

所述制备流程如图1所示，GYK多肽在经过氧化处理后交联形成二聚体的形式，在亲疏水作用下自组装成GYK纳米粒子(GYK NPs)。

所述的GYK NPs，其激发与发射光谱如图2所示，最大激发波长到最大发射波长有着170nm左右的斯托克斯位移。荧光检测GSH过程使用的激发波长为360nm，取最大发射波长处的荧光强度作为检测信号。

形貌表征结果如图3所示，GYK NPs为纳米颗粒，粒径均匀分布在100-200nm之间。

实施例2：多肽自组装荧光检测谷胱甘肽

将GYK NPs溶液用水稀释至1mM，得到检测溶液；

配置GYK荧光探针浓度为1mM的溶液150μL，接着每隔3-5min加入0.5μL浓度为5mM的GSH溶液，测试其在360nm激发光下的荧光发射光谱，结果图片见附图4；

以荧光光谱在最大发射波长处的荧光强度相对于反应前的变化值为纵坐标，加入GSH的量为横坐标，绘制标准曲线。如图5所示，GYK NPs的荧光强度随着谷胱甘肽浓度的增加而逐渐减弱；且在0-300μM范围内呈线性相关性，线性回归方程为：Y＝0.00202X–0.0134，线性相关系数R

实施例3：自组装结构多肽荧光在细胞成像中的应用

在本实例中使用10％胎牛血清的1640培养基培养小鼠成纤维细胞(L929)。

(1)将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5％的CO

(2)将GYK NPs稀释加入共聚焦皿中，使终浓度为100μM，在37℃、5％的CO

(3)为了考察GYK NPs对细胞的成像位置的准确性，在共聚焦皿加入商业化膜染色剂DIL，终浓度为5μM，孵育15min后，移去上述混合液，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3遍，加入新鲜的磷酸盐缓冲液；

(4)用激光共聚焦扫描显微镜进行拍摄城像。用360nm的激光器照射，收取490–550nm范围内的荧光图像，对应为GYK NPs的染色区域；用波长为549nm的激光器照射，收取560–580nm范围内的荧光图像，对应为DIL染色区域。

结果图片见附图6，本申请的GYK NPs与膜染色剂DIL共染，GYK NPs对细胞的成像区域在DIL所指示的细胞膜内，证明了GYK NPs能够实现针对细胞质的染色。通过对比a组与b组，发现加入GSH的共聚焦皿中的细胞荧光强度明显区别于不加GSH的细胞。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。