一种经血保存液及经血干细胞的冻存方法

技术领域

本发明属于细胞治疗领域，具体地，本发明提供了一种经血保存液及经血干细胞的冻存方法。

背景技术

间充质干细胞(MSC,mesenchymal stem cells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多功能干细胞。间充质干细胞是一种成体干细胞，最早从骨髓中发现的，1976年，Freidenstein首次在骨髓中发现了骨髓间充质干细胞，随后在脐带血、胎盘等多种组织中都发现了间充质干细胞，研究发现间充质干细胞具有多向分化潜能，在体内或体外特定的诱导条件下，可以分化为脂肪、骨、肌肉、神经、肝、心肌等多种组织细胞，目前，根据初步的临床报告，间充质干细胞在脊髓损伤、脑瘫、系统性红斑狼疮、糖尿病、肝硬化等疾病治疗中，都取得了明显的疗效。

从脊髓组织中获取间充质干细胞是一个有创过程，对捐献者会造成一定的痛苦，而且获得的干细胞数量有限，倍增时间长。胎盘组织或者脐带血干细胞只能在出生时收集，来源溃乏，这些限制因素严重影响了间充质干细胞的临床应用。相比较而言，宫血干细胞具有很多优势，它的取材很方便，不需要专业人士的帮助，使用卫生棉和月事杯就可以无创采集；可以周期性的获得，每月一次，按时报道；增殖能力很强，24小时就可以扩增一倍。这些优点，使宫血干细胞被认为是最具优势与潜力进行大规模临床应用的成体干细胞。

目前，有多项研究表明，宫血干细胞在体外可以分化为心肌细胞、肺上皮细胞、神经元细胞、肌细胞、内皮细胞、胰岛细胞、干细胞等组织细胞。将宫血干细胞移植到中风小鼠模型后，发现宫血干细胞能够明显减少脑细胞死亡。除此之外，宫血干细胞在心肌梗死、糖尿病、肝硬化等疾病中都显示出了治疗潜力。

但是宫血干细胞的冻存也存在很多问题，例如：注射了含有DMSO的造血干细胞后引起了腹部疼痛性痉挛，其次常见的冻存液中含有动物血清，而动物血清中可能携带朊病毒等，会造成传播病毒的风险。因此，本发明开发了一种替代DMSO、动物血清的冻存液。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种经血保存液及经血干细胞的冻存方法，采集女性的经血时对女性外阴清洁消毒，使用高压灭菌的月事杯采集经血，保存于保存液中，从采集源头减少污染几率，保持经血中细胞活性；采集到的经血经分离得到的间充质干细胞种子细胞冻存复苏后细胞活性好，经原代培养细胞增殖活性高，传代培养的细胞活率高，污染率低。

为了克服现有技术中的不足，本发明提供了一种经血保存液及经血干细胞冻存方法的解决方案，具体如下：

一方面，本发明提供了一种经血保存液，其成分包括0.9％的生理盐水、55.5mmol/L-110mmol/L葡萄糖、10-12mmol/L枸橼酸钠、100U/mL青霉素、30μmol/L-50μmol/L木犀草素。

另一方面，一种干细胞冻存液，其组成成分为：海藻糖和反式-4-羟基-L-脯氨酸、丙三醇、四氢甲基嘧啶羧酸、DMEM/F12。

其中所述的海藻糖在所述细胞冻存液中的含量为2％-9％的所述DMEM/F12的体积；所述丙三醇在所述细胞冻存液中的含量为5-30％的所述DMEM/F12的体积；所述反式-4-羟基-L-脯氨酸在所述细胞冻存液中的含量为1-5％的所述DMEM/F12的体积；所述四氢甲基嘧啶羧酸在所述细胞冻存液中的含量为10-15％的所述DMEM/F12的体积。

再一方面一种经血来源间充质干细胞冻存方法，包括如下步骤：S1，经血保存液的配制；S2，经血的采集；S3经血来源间充质干细胞的提取；S4，间充质干细胞的冷冻。

其中所述的步骤S1为：保存液的基础液为0.9％的生理盐水，之后向其中加入葡萄糖、枸橼酸钠、青霉素、木犀草素，最终葡萄糖浓度为55.5mmol/L-110mmol/L、枸橼酸钠浓度为10-12mmol/L、青霉素浓度为100U/mL、木犀草素浓度为30μmol/L-50μmol/L。

其中所述的步骤S2为：使用月事杯采集女性经期中第二天到第三天的经血；将采集到的经血倒入装有保存液的无菌容器中，将经血和保存液充分混匀。

所述的步骤S3为：将步骤S2中的到的经血在操作台中转移至离心管中，经离心除去上清液后，将剩余液体加入等体积0.9％的生理盐水稀释，稀释后加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，离心，最终得到红细胞层；取红细胞层加入离心管中，接入生理盐水稀释，离心，弃去上清液，最终获得经血间充质细胞。

所述的步骤S4为：将步骤S3中得到细胞放入冻存液中，放入冻存盒，将冻存盒在-80℃冰箱中预冻12-36h，再放入液氮中保存。

本发明与现有技术相比，有以下优点及益处：

(1)常见的含DMSO、动物血清的冻存液会存在以下不足：注射了含DMSO的造血干细胞可能会造成腹部疼痛性痉挛等不良反应；动物血清中含有病毒(朊病毒等)，会造成传播病毒的风险；血清的组分、批次等都会对细胞产生不同的影响。因此，本发明摒弃了DMSO和动物血清，采用海藻糖和反式-4-羟基-L-脯氨酸、丙三醇、四氢甲基嘧啶羧酸、DMEM/F12来作为冻存剂。

(2)在冻存液中加入海藻糖可以稳定细胞膜，丙三醇能够通过渗透保护细胞内外不受冰晶形成的破坏，四氢甲基嘧啶羧酸可作为渗透剂保护细胞免受高盐损伤。

(3)本发明从采取经血到经血来源间充质细胞的冻存都是采用深度灭菌的设备或者设施中进行，因此，种子细胞冻存复苏后细胞活性好，且经过传代培养后，细胞的存活率高，污染性小。

(4)本发明经过大量实验研究证明，海藻糖和反式-4-羟基-L-脯氨酸、四氢甲基嘧啶羧酸存在一定的协调作用，能够抑制促凋亡蛋白的表达，能够增加细胞活力。

附图说明

图1为实施例1中样品1冻存复苏后的细胞样貌。

图2为实施例3中各个样品中促凋亡蛋白Bax的表达水平。

图3为实施例3中各个样品中p53的表达水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1冷冻样品的制备

S1经血保存液的配制

保存液的基础液为0.9％的生理盐水，之后向其中加入葡萄糖、枸橼酸钠、青霉素、木犀草素，最终葡萄糖浓度为55.5mmol/L、枸橼酸钠浓度为10mmol/L、青霉素浓度为100U/mL、木犀草素浓度为50μmol/L。

S2经血的采集

使用月事杯采集女性经期中第二天到第三天的经血；将采集到的经血倒入装有保存液的无菌容器中，将经血和保存液充分混匀。

S3经血来源间充质干细胞的提取

将步骤S2中的到的经血在操作台中转移至离心管中，以2000rpm/min离心且离心10min后，除去上清液，加入等体积的0.9％的生理盐水，再次以1500rpm/min离心15min。出去上清液，将剩余液体加入等体积0.9％的生理盐水稀释，稀释后加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，稀释后的液体与淋巴细胞分离液的体积比例为1：1，2100rpm/min离心20min，离心完成后，得到红细胞层；取红细胞层加入离心管中，接入等体积的0.9％的生理盐水稀释，以2000rpm/min离心15min，弃去上清液，取样计数，最终获得经血间充质细胞。

S4间充质干细胞的冷冻

将步骤S3中每1×10

由上述方法制备样品，以下样品属于同一经血来源，其余步骤都相同，所不同的是样品冻存液的配制。

样品1：样品1所采用的冻存液组成成分为：DMEM/F12是DMEM培养液和F12培养液以体积比3:1的比例混合的。海藻糖在细胞冻存液中的含量为5％的DMEM/F12的体积，丙三醇在细胞冻存液中的含量为10％的DMEM/F12的体积；反式-4-羟基-L-脯氨酸在细胞冻存液中的含量为1％的DMEM/F12的体积；四氢甲基嘧啶羧酸在细胞冻存液中的含量为10％的DMEM/F12的体积。

样品2：样品2所采用的冻存液组成成分为：DMEM/F12是DMEM培养液和F12培养液以体积比3:1的比例混合的。海藻糖在细胞冻存液中的含量为5％的DMEM/F12的体积，丙三醇在细胞冻存液中的含量为12％的DMEM/F12的体积；反式-4-羟基-L-脯氨酸在细胞冻存液中的含量为3％的DMEM/F12的体积；四氢甲基嘧啶羧酸在细胞冻存液中的含量为12％的DMEM/F12的体积。

样品3：样品3所采用的冻存液组成成分为：DMEM/F12是DMEM培养液和F12培养液以体积比3:1的比例混合的。海藻糖在细胞冻存液中的含量为7％的DMEM/F12的体积丙三醇在细胞冻存液中的含量为25％的DMEM/F12的体积；所述反式-4-羟基-L-脯氨酸在细胞冻存液中的含量为3％的DMEM/F12的体积；四氢甲基嘧啶羧酸在细胞冻存液中的含量为15％的DMEM/F12的体积。

样品4：样品4所采用的冻存液组成成分为：DMEM/F12是DMEM培养液和F12培养液以体积比3:1的比例混合的。海藻糖在细胞冻存液中的含量为5％的DMEM/F12的体积，丙三醇在细胞冻存液中的含量为10％的DMEM/F12的体积，四氢甲基嘧啶羧酸在细胞冻存液中的含量为10％的所述DMEM/F12的体积。

样品5：样品5所采用的冻存液组成成分为：DMEM/F12是DMEM培养液和F12培养液以体积比3:1的比例混合的。丙三醇在细胞冻存液中的含量为10％的DMEM/F12的体积，反式-4-羟基-L-脯氨酸在细胞冻存液中的含量为1％的DMEM/F12的体积，四氢甲基嘧啶羧酸在细胞冻存液中的含量为10％的DMEM/F12的体积。

样品6:样品6所采用的冻存液组成成分为：DMEM/F12是DMEM培养液和F12培养液以体积比3:1的比例混合的。海藻糖在细胞冻存液中的含量为5％的所述DMEM/F12的体积，反式-4-羟基-L-脯氨酸在所述细胞冻存液中的含量为1％的DMEM/F12的体积，四氢甲基嘧啶羧酸在细胞冻存液中的含量为10％的DMEM/F12的体积。

样品7：样品7所采用的冻存液组成成分为：DMEM/F12是DMEM培养液和F12培养液以体积比3:1的比例混合的。海藻糖在细胞冻存液中的含量为5％的DMEM/F12的体积，丙三醇在细胞冻存液中的含量为10％的DMEM/F12的体积；反式-4-羟基-L-脯氨酸在细胞冻存液中的含量为1％DMEM/F12的体。

样品8：样品8所采用的冻存液组成成分为：10％DMSO、20％人血白蛋白、70％间充质干细胞无血清培养基。

样品9：样品9所采用的冻存液组成成分为：DMSO体积百分浓度为15％，羟乙基淀粉质量体积浓度为40％，其余为生理盐水。

图1为样品1解冻复苏后的细胞样貌图。从图1中可以看出干细胞的大小均一，形状多呈纺锤状。

实施例2细胞存活率检测

将实施例1制备的样品分别冻存4周后复苏培养，即在37℃水浴中解冻细胞，将细胞转入装有0.9％生理盐水的离心管，1500rpm离心且离心5min，弃上清液，再加入0.9％生理盐水离心洗涤两次后，用培养基重悬，取样计数，测定存活率。结果如表1所示。

表1细胞存活率结果

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由表1的结果可以看出，样品1、样品2、样品3解冻复苏后的细胞存活率高于95％，而现有的技术的冻存液制备的样品8和样品9的细胞存活率在90％作用。这说明本发明制备的冻存液具有很高的细胞存活率。本发明制备的冻存剂细胞存活率高的原因可能是海藻糖和反式-4-羟基-L-脯氨酸能够改变细胞膜上脂质的构成，达到稳定细胞膜的功能，从而保证细胞的存活率。

实施例3凋亡基因蛋白表达检测

将实施例1中制备的样品解冻复苏后，使用RNA分离试剂盒(Roche，USA)从样品中分离总RNA，利用国家引物BLAST在线软件设计Bax和p53引物。采用PCR方法测定基因水平。所有的PCR实验均使用iCycler RT-PCR检测系统进行检测。

最终得到各样品Bax和p53表达水平如图2、图3所示。

Bax蛋白多以非活性单体形式分布于细胞质中，接收到凋亡信号后被激活，发生分子构象改变，移位并插入线粒体外膜后形成Bax大孔道，破坏线粒体的完整性从而使细胞凋亡。而p53蛋白能够促进促凋亡蛋白基因的表达。从图3可以看出，样品1中细胞的促凋亡蛋白Bax的表达水平要远远低于其它组样品，促进促凋亡蛋白p53的表达水平液远远低于其它组。这说明样品1中的物质能够抑制促凋亡蛋白Bax和促进促凋亡蛋白p53的表达。从而增加细胞的活力，这与实施例2中样品1的细胞存活率高于其它组，结果一致。

实施例4细胞流式鉴定

取样品解冻复苏后的原代经血源间充质干细胞，PBS清洗2遍，0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×10

表2流式检测结果

干细胞公认的表面标记物为CD73、CD90等，其表达率CD73、CD90高于95％，证明分离出来的干细胞的质量达标。通过对干细胞进行以上标记物的流式检测，样品1中的CD73、CD90的表达率显著高于样品8和样品9中标记物的表达率，这说明样品1中分离的细胞纯度更高，含有的干细胞更多。