深海管状蠕虫Ridgeia piscesae超氧化物歧化酶RPSOD及制备方法

技术领域

本发明涉及管状蠕虫，尤其是涉及一种来自深海热液区的管状蠕虫Ridgeiapiscesae的新型超氧化物歧化酶基因的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列和其制备方法。

背景技术

深海热液区极端的环境极易引起机体发生氧化应激(1、Mittler R.Oxidativestress,antioxidants and stress tolerance[J].Trends in Plant Science,2002,7(9):405-410.)，管状蠕虫作为深海热液区的优势物种，体内必然有着高效的抗氧化机制。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)作为抗氧化应激的第一道防线，其清除生物体内超氧阴离子自由基的功能在抗衰老、消炎和抑制肿瘤等方面都有着广泛地应用(2、林庆斌，廖升荣，熊亚红，等.超氧化物歧化酶(SOD)的研究和应用进展[J].化学世界，2006:378-381.)。目前市场上绝大部分SOD是从动物血液中提取，不仅有交叉感染和排他性等风险，还不方便保存(3、辛波，陈卫军，夏秋瑜，等.金属离子对椰花汁清除超氧阴离子能力的影响[J].热带作物学报，2009，30:1069-1074.)。此外，还有部分SOD从植物中提取的，工艺繁杂，成本较高(4、董亮，何永志，王远亮，等.超氧化物歧化酶(SOD)的应用研究进展[J].中国农业科技导报，2013，15:53-58.)。因此对于新型SOD的研究与开发现已成为全球热点。

随着研究的深入，基因工程技术被广泛运用于SOD的生产。如今，SOD已在医疗、食品、农业和日化品等众多领域大放异彩(4、董亮，何永志，王远亮，等.超氧化物歧化酶(SOD)的应用研究进展[J].中国农业科技导报，2013，15:53-58.)。在医疗方面，人体治疗性临床试验已表明，SOD的补充可预防或逆转由于氧化应激产生的各种疾病，包括癌症、哮喘、糖尿病、关节炎、动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤、衰老、不孕、神经功能障碍、移植排斥、自身免疫性疾病、类风湿关节炎等(5、Mccord JM.Human disease,free radicals,and theoxidant/antioxidant balance[J].Clinical Biochemistry,1993,26(5):351.)。在食品生产中，SOD水果、SOD蔬菜、SOD活性茶等SOD食品一经问世就反响强烈(6、Aoyagi H,IshiiH,Ugwu CU,et al.Effect of heat-generated product from uronic acids on thephysiological activities of microbial cells and its application[J].Bioresource Technology,2008,99(10):4534-4538.)。在保湿霜、防晒霜、美白霜、眼霜、指甲油和防脱发喷雾等日化品中，SOD的适量添加则可以有效消除自由基损伤，起到抗衰老、抗炎、抗病毒、抗辐射等作用(7、Bafana A,Dutt S,Kumar S,et al.Superoxidedismutase:an industrial perspective[J].Critical Reviews in Biotechnology,2011,31(1):65-76.)。种植过程中，SOD水平的增加可激活植物在胁迫下的代谢保护机制，提高生物量，利用这一特性，目前研究者们尝试采用转基因技术获得抗逆性的植株(8、R A,Kim Y-H,Kim M-D,et al.Simultaneous expression of choline oxidase,superoxidedismutase and ascorbate peroxidase in potato plant chloroplasts providessynergistically enhanced protection against various abiotic stresses[J].Physiologia Plantarum,2010,138(4):520-533.)。

发明内容

本发明的第一个目的是提供管状蠕虫R.piscesae超氧化物歧化酶rpsod的基因序列；

本发明的第二个目的是提供管状蠕虫R.piscesae超氧化物歧化酶RPSOD的蛋白序列；

本发明的第三个目的是提供管状蠕虫R.piscesae超氧化物歧化酶RPSOD的制备方法；

本发明的第四个目的是提供管状蠕虫R.piscesae超氧化物歧化酶RPSOD的生物学活性；

本发明所述管状蠕虫R.piscesae超氧化物歧化酶基因，其编码的核苷酸序列，记作rpsod。

所述管状蠕虫R.piscesae超氧化物歧化酶基因rpsod的分子类型为DNA，序列特征：长度为675bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，所述R.piscesae超氧化物歧化酶基因rpsod的序列如下所示，记为SEQ ID No.1：

本发明所述管状蠕虫Ridgeia piscesae超氧化物歧化酶RPSOD的获取与制备包括以下步骤：

提取管状蠕虫R.piscesae的总RNA，反转成cDNA，以合成序列SEQ ID No.3，SEQ IDNo.4作为引物，在退火温度为52℃，延伸时间为42s的条件下进行PCR扩增获得rpsod基因核苷酸序列SEQ ID No.1。通过相关软件推导SEQ ID No.1编码的多肽SEQ ID No.2氨基酸序列。进一步，利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主成功实现了RPSOD的异源重组表达，通过镍柱纯化后经生物学方法证明rpsod基因所编码的多肽SEQ ID No.2具有超氧化物歧化酶活性。

本发明所述超氧化物歧化酶RPSOD具有消除超氧根阴离子的活性，且耐碱、耐高温，并对10mmol/L的尿素、EDTA、PMSF、H

所述合成序列SEQ ID No.3：CGC

所述合成序列SEQ ID No.4：CCG

所述管状蠕虫R.piscesae超氧化物歧化酶RPSOD的分子类型为蛋白质，序列特征：长度为224aa，类型为氨基酸，超氧化物歧化酶RPSOD所述的序列如下所示，记为SEQ IDNo.2：

所述管状蠕虫R.piscesae超氧化物歧化酶RPSOD，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽；或将SEQ ID No.2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相似功能的多肽。

本发明所述管状蠕虫Ridgeia piscesae超氧化物歧化酶RPSOD的制备方法，包括以下步骤：

1)深海管状蠕虫R.piscesae总RNA提取与反转录合成cDNA的步骤；

2)深海管状蠕虫R.piscesae超氧化物歧化酶rpsod的PCR扩增和序列分析的步骤；

3)深海管状蠕虫R.Piscesae超氧化物歧化酶RPSOD重组表达及纯化的步骤；

4)深海管状蠕虫R.Piscesae超氧化物歧化酶RPSOD的活性检测和功能探究的步骤。

本发明通过分析深海管状蠕虫R.piscesae超氧化物歧化酶rpsod基因，利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主成功实现RPSOD的异源重组表达。纯化后，对RPSOD酶学性质分析，结果显示RPSOD活性的最适温度为50℃，其在10℃-70℃时，稳定性极佳，甚至在80℃高温下温育10h仍然有41％的剩余酶活。其活性的最适pH为9，其在酸性环境中活性近乎丧失，在中性和碱性条件下稳定性较强，在pH为12的缓冲液处理1h后仍有40％以上的剩余酶活。此外，RPSOD对各种常见的变性剂(尿素、EDTA、PMSF、H

附图说明

图1为RPSOD表达后的纯化与透析的SDS-PAGE电泳图谱。M：蛋白Marker；1：纯化后RPSOD；2：透析后的RPSOD。

图2为温度对重组超氧化物歧化酶RPSOD活性的影响。横坐标表示不同温度；纵坐标表示RPSOD的相对活性。

图3为温度对重组超氧化物歧化酶RPSOD稳定性的影响。横坐标表示不同温度；纵坐标表示RPSOD的相对活性。

图4为pH对重组超氧化物歧化酶RPSOD活性的影响。横坐标表示不同pH；纵坐标表示RPSOD的相对活性。

图5为pH对重组超氧化物歧化酶RPSOD稳定性的影响。横坐标表示不同pH；纵坐标表示RPSOD的相对活性。

图6为变性剂对重组超氧化物歧化酶RPSOD的影响。横坐标表示不同变性剂；纵坐标表示RPSOD的相对活性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验室手册(9、萨姆布鲁克，拉塞尔(著)，黄培堂(译)，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年，第三版)中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条件。

为实现上述目的，本发明采用以下技术措施，其具体步骤是：

1.深海管状蠕虫R.piscesae总RNA提取与反转录合成cDNA

深海管状蠕虫R.piscesae样品采集自胡安·德富卡洋脊(47°56'N，129°05'W，2181m)，采样后马上置于液氮保存；根据TRIzol Reagent试剂盒说明书提取管状蠕虫总RNA。在EP管中加入1μL oligo(dT)

2.深海管状蠕虫R.piscesae超氧化物歧化酶rpsod的PCR扩增和序列分析

利用Primier 5.0软件设计rpsod引物，正向引物(划线部分为BamHI酶切位点)：5′-CGC

3.深海管状蠕虫R.piscesae超氧化物歧化酶RPSOD重组表达及纯化

PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察后切下目的条带。使用胶回收试剂盒从凝胶中回收DNA。将胶回收产物与pET-His载体质粒分别同时用BamHI和EcoRI双酶切。双酶切产物分别切胶回收后，将所回收的酶切后pET-His载体与目的片段于16℃连接8h，构建重组质粒pET-His-RPSOD。将重组质粒转化到E.coli Top10感受态细胞中，在含有氨苄青霉素钠(100mg/mL)的LB固体培养基(1％NaCl，1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物)均匀涂开，37℃培养12h。挑取单菌落进行菌落PCR，筛选出阳性克隆子并用质粒提取试剂盒小量提取重组质粒，随后将重组质粒进行双酶切验证，送予湖北擎科生物科技有限公司测序后分析。

将构建成功的重组质粒pET-His-RPSOD转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并通过菌落PCR筛选出阳性克隆子。将单菌落接种至含有氨苄青霉素钠(100mg/mL)的5mLLB液体培养基中，在37℃恒温摇床中以220r/min培养9h制备种子液。将种子液以1︰100接种至含有氨苄青霉素钠(100mg/mL)的250mL LB液体培养基中，在37℃摇床中以220r/min培养至OD

将所收集的上清溶液与His标签蛋白纯化介质在4℃结合3h，用20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L的咪唑溶液(0.5mol/L NaCl，20mmol/LNa

1.深海管状蠕虫R.piscesae超氧化物歧化酶RPSOD的活性检测

4.1WST-1法测RPSOD活性

将南京建成公司的总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(WST-1法)中底物贮备液和缓冲液按体积比1︰200配制成底物应用液(现配现用)，酶贮备液和酶稀释液按体积比1︰10配制成酶工作液(现配现用)。在酶标条中按表1加入各试剂：

表1 WST法检测体系配置表

混匀后，37℃孵育20min，450nm酶标仪读数后按以下公式计算SOD活力(其中SOD抑制率达50％时所对应的酶量为一个酶活性单位(U))：

4.2NBT法检测RPSOD活性

取三个透明玻璃试管，分别标记为RPSOD实验组、RPSOD缓冲液对照组、RPSOD缓冲液避光组。各组分别配制2.7mL混合液，其中加入终浓度为13mmol/L的L-蛋氨酸、10μmol/L的EDTA、75μmol/L的NBT、2μmol/L的核黄素，其余体系用相应缓冲液补齐。将RPSOD实验组、RPSOD缓冲液对照组、RPSOD避光组各300μL加入配制好的混合液中，将RPSOD实验组、RPSOD对照组以4000lx的强光照射30min，RPSOD缓冲液避光组严格避光。吸取反应后溶液各200μL于96孔板中，用酶标仪在吸收峰560nm处检测，根据公式计算SOD活力(其中以抑制NBT光还原50％为一个酶活性单位(U))：

4.3温度对RPSOD活性影响

将整个反应体系置于10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃温度下同时处理1h，采用WST-1法检测不同温度处理下RPSOD的活力，并计算相对酶活绘制折线图。该实验重复三次。结果显示50℃为RPSOD发生反应的最适温度(图2)。

4.4RPSOD热稳定性分析

将RPSOD蛋白分别于10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下同时处理一定时间。采用WST-1法检测不同温度处理后RPSOD的活力，并计算相对酶活绘制折线图。该实验重复三次。结果显示RPSOD在10℃-70℃时，无论是经过3h温育处理，还是6h温育处理，其相对酶活都在95％以上，稳定性极佳。在80℃温育处理3h后RPSOD相对酶活仍在90％以上，而处理6h后其剩余酶活下降至60％左右(图3)。说明RPSOD在高温条件下具有很好的稳定性。

4.5pH对RPSOD活性影响

将RPSOD蛋白分别加入含有pH为2-8(柠檬酸-Na

4.6RPSOD的pH稳定性分析

分别用pH为2-8(柠檬酸-Na

4.7变性剂对RPSOD活性影响

将RPSOD蛋白分别用10mmol/L的尿素、EDTA、SDS、PMSF、H