一种类风湿关节炎的分子标记及应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种类风湿关节炎的分子标记及应用。

背景技术

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节发炎和骨损伤为主的慢性自身免疫性疾病，发病机制复杂，涉及到遗传、环境等多种影响因素，临床表现、治疗反应等也不尽相同。目前仍不能阐明RA的发病机制及对疾病进行预测，临床诊断尚缺乏理想的生物标志物。类风湿因子等是临床诊断标准中的血清学指标，但敏感性和特异性均不高，因此找出疾病早期诊断和监测病程的生物标志物是RA诊疗的重点研究方向。

外泌体是由细胞膜内陷，形成内体，再形成多泡体，最后分泌到胞外的一类细胞外囊泡，直径为30-150nm。外泌体含有丰富的跨膜蛋白，细胞黏附分子，支架蛋白，RNA结合蛋白，RNA，DNA，复杂聚糖等物质，但不同的外泌体中富集的物质不同。几乎所有类型的细胞都可以分泌外泌体，且外泌体也广泛存在于体液中，包括血液、尿液、唾液、脑脊液等。由于外泌体双膜结构的保护作用，其内部的物质可稳定存在。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种来自血清外泌体的类风湿关节炎的分子标记及应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种类风湿关节炎的分子标记，所述分子标记为LncRNATCONS_I2_00013502和/或LncRNA ENST00000363624。

本发明通过对血清中外泌体进行转录组测序，筛选了类风湿性关节炎的分子标记，所述分子标记的表达水平在类风湿性关节炎患者外周血的外泌体中显著变化(高表达LncRNA TCONS_I2_00013502、低表达LncRNA ENST00000363624)，可用于类风湿性关节炎的诊断，特异性强、敏感度高，为临床类风湿性关节炎的诊断提供新策略。

作为本发明所述的分子标记的优选实施方式，所述LncRNA TCONS_I2_00013502的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述LncRNA ENST00000363624的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

作为本发明所述的分子标记的优选实施方式，所述分子标记存在于血清外泌体中。

第二方面，本发明将所述的分子标记在制备检测或诊断类风湿关节炎的制剂中应用。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述制剂包括基于基因芯片检测或实时荧光定量PCR检测所述标志物表达水平的试剂。

进一步的，所述LncRNA TCONS_I2_00013502的表达水平上调；所述LncRNAENST00000363624的表达水平下调。

第三方面，本发明提供一种类风湿关节炎的检测试剂盒，包含检测所述的分子标记表达水平的制剂。

作为本发明所述的检测试剂盒的优选实施方式，所述检测的样本为血清外泌体。

作为本发明所述的检测试剂盒的优选实施方式，所述血清外泌体的制备方法包括以下任一种步骤：

(a)取外周血差速离心，即得；或

(b)取外周血用密度梯度离心，尺寸排阻，基于聚合物的沉淀技术，免疫分离技术制备，即得。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明通过对血清中外泌体进行转录组测序，分析RA患者外周血清外泌体中LncRNAs的表达谱，评估差异表达的LncRNA在RA诊断和监测中的临床价值，筛选了一种类风湿性关节炎的分子标记，所述分子标记为血清外泌体LncRNA TCONS_I2_00013502和/或LncRNAENST00000363624，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。本发明首次提出了血清外泌体LncRNA TCONS_I2_00013502和LncRNAENST00000363624的表达水平在类风湿性关节炎患者外周血的外泌体中显著变化(高表达LncRNA TCONS_I2_00013502、低表达LncRNA ENST00000363624)，该分子标记可用于类风湿性关节炎的诊断，特异性强、敏感度高，为临床上类风湿性关节炎的诊断提供新策略。

附图说明

图1为类风湿关节炎(RA)组与正常人对照组(Normal)组差异表达lncRNA(P<0.05)；

图2为TCONS_I2_00013502、ENST00000363624在不同分组类风湿关节炎(RA)病人中的表达；

图中，正常人对照组(Normal)与类风湿关节炎(RA)高度活动组(RA-H)、低度活动组(RA-L)各分组之间存在显著差异(P＜0.05)，高度活动组(RA-H)、低度活动组(RA-L)间无显著差异(P＞0.05)

图3为以预测概率与真实值构建ROC曲线；

图中，TCONS_I2_00013502下方面积为0.870，ENST00000363624下方面积为0.864，其联合指标下方面积为0.934；TCONS_I2_00013502的尤登指数(敏感度+特异度-1)最高为0.625(敏感度93.8％，特异度68.7％)。ENST00000363624的尤登指数(敏感度+特异度-1)最高为0.594(敏感度81.30％，特异度78.10％)；TCONS_I2_00013502和ENST00000363624组合的尤登指数(敏感度+特异度-1)最高为0.75(敏感度93.8％，特异度81.2％)。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：血清外泌体的制备和外泌体RNA提取鉴定

1、标本采集

收集广东医科大学附属医院收治的类风湿关节炎患者13例，所有入组病例经临床及相关类风湿检验确诊为RA，年龄为(32～70)岁，同时招募健康志愿者5例作为Normal组，年龄为(40～50)岁。所有病例组患者诊断均符合美国风湿病学会1987年RA分类诊断标准，对照组为同期健康体检者，研究对象均为无血缘关系汉族人，各组年龄及性别差异无统计学意义(P>0.05)。排除标准为合并肿瘤、过敏、感染以及合并其它自身免疫性疾病的患者。入选的13例RA患者及5例正常人对照组的基本资料及临床资料汇总如下表1。经统计发现，RA患者未用药高度活动组(RA-HW)、RA患者未用药低度活动组(RA-L)RA用药后低度活动组(RA-L)与正常人对照组(Normal)组相比，DAS28评分、ESR显著地升高，有差异，具有统计学意义(P<0.0001)；年龄差异无显著性(P＝0.99)。

表1患者与对照组的一般情况

注：F为女性M为男性；DAS28：28个关节的疼痛和肿胀的关节数。RA患者未用药高度活动组(RA-HW)、RA患者未用药低度活动组(RA-L)RA用药后低度活动组(RA-L)与正常人对照组(Normal)。

2、外泌体RNA提取鉴定

(1)试剂盒法-exoRNeasy Maxi Kit抽提血清外泌体的RNA

分别取各组血清样本2mL，常温，10000g离心1h，取上清；各组分别加入2mL XBP缓冲液，混匀；将样品和XBP混合物添加到exoEasy旋转柱上，以500g的速度旋转设备1min。丢弃流液；加入10mL Buffer XWP，在2800g下旋转5min，洗涤柱并去除残留Buffer。丢弃液体和收集管。离心后，小心取出外易自旋柱从收集管，使柱不进入与洗脱液接触；轻柔的将旋转柱转移到一个无菌EP管中；在膜中加入700μL QIAzol，5000g，5min，收集溶解产物，并完全转移到2mL收集管中；在室温下短暂的涡漩(涡震荡)包含溶解产物的管和孵化5min。这一步促进核蛋白复合物的解离；向装有裂解液的试管中加入90μL氯仿，大力摇15s；在室温放置2min晾干沉淀物，每个样品中加入0.5μL外参(线虫mir-cel-39)；4℃，12000g离心15min，向装有裂解液的试管中加入90μL氯仿，并安全地盖上盖子。大力摇15s；将上部水相转移到新的EP管中(取上清,避免取到有机)。加入800μL的100％乙醇，彻底混合；将高达700μL的样品，包括可能形成的沉淀物，移入2mL收集管中的RNeasy MinElute旋转柱中，轻轻盖上盖子，在室温下以≥8000g离心15s。废弃流液；在旋转柱中加入700μL缓冲液RWT。轻轻盖上盖子，以≥8000g离心15s。废弃流液；用吸管将500μL缓冲液RPE吸到旋转柱上。轻轻盖上盖子，以≥8000g离心15s，废弃流液，再重复1次；将旋转柱放入新的2mL收集管中，打开旋转柱盖，全速离心5min，使膜干燥；将旋转柱放入新的1.5mL收集管中。直接向旋转柱膜中心加入14μL无酶水。轻轻关上盖子，全速离心1min提取RNA。

(2)总RNA质控

每个样品均使用NanoDrop ND-1000检测RNA浓度，以OD260/OD280的值作为RNA纯度指标。若OD260/OD280值的范围在1.8～2.1，则表示RNA纯度合格，而OD260/OD280＜1.8表示蛋白质污染，OD260/OD280＞2.1表示为DNA污染。

检测结果发现，18个标本用高通量测序提取的总RNA进行纯度检测。结果显示：所有样本总RNA的OD260/OD280介于1.80～2.0之间，符合RNA质量标准。

实施例2:血清外泌体LncRNA的建库、质控与测序

1、RNA建库、质控与测序

长链非编码RNA(LncRNA)文库准备：根据供应商说明，使用Ribo-Zero rRNARemoval Kits(Illumina，美国)移除实施例1中富集血清外泌体总RNA中的rRNAs。使用TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit(Illumina，美国)预处理RNA，构建测序文库。使用BioAnalyzer 2100仪器(Agilent Technologies，美国)进行文库质控和定量。根据Illumina测序说明，将10pM文库变性为单链DNA分子，在Illumina flowcell上捕获，原位扩增为簇(cluster)。经过Illumina HiSeq 4000测序仪进行150cycle测序，收获双端reads。使用cutadapt(v1.9.3)软件去接头，去低质量reads，获得高质量reads。

2、数据分析

LncRNA和mRNA：经过图像识别和碱基识别后，从Illumina HiSeq测序仪上收获原始reads。使用cutadapt软件去接头，去低质量reads，获得高质量clean reads。使用hisat2软件将clean reads比对到人类参考基因组(UCSC HG19)上。使用hisat2软件(v2.0.4)，将高质量reads比对到人类参考基因组(UCSC HG19)上。然后，在gtf基因注释文件指导下，使用cuffdiff软件(cufflinks软件套件的一部分)获得转录本水平lncRNA和基因水平mRNA的FPKM(Fragments per kilobase of exon per million fragments mapped)值，作为LncRNA和mRNA的表达谱，并计算两个组样品间的倍数变化和P值以筛选差异表达LncRNA和mRNA。并进行差异lncRNAs来源基因的GO和Pathway分析。

实施例3：实时荧光定量PCR检测对差异表达的lncRNA进行验证

1、候选RNA的选择

较正常人对照组，RA患者组，以FC差异倍数及P值进行候选lncRNA筛选，筛选出上调lncRNA TCONS_00026389、TCONS_00028428、TCONS_l2_00013502、uc010wia.1、TCONS_l2_00003048、TCONS_00028193、TCONS_00028189、NR_033191、TCONS_00028422、TCONS_00028426及下调lncRNA ENST00000363624、ENST00000365328、ENST00000363444、ENST00000363618、ENST00000458748、ENST00000365312、ENST00000391267、ENST00000437681进行后续qPCR验证。

具体如表2所示：

表2外泌体差异表达lncRNAs

2、引物设计与合成

引物序列如下表3所示：

表3外泌体差异表达lncRNAs引物序列

3、外泌体总RNAs逆转录反应

依据PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRA)说明书。主要包括，反应条件：第一阶段，逆转录反应，37℃，15min。第二阶段，逆转录酶的失活反应，85℃，15min。第三阶段，保温，4℃。

4、荧光定量PCR检测差异lncRNAs含量

依据SYBR Premix Ex Taq II Kit(TaKaRA)试剂盒说明书，每个基因设置三个复孔。主要包括，反应条件：第一阶段，预变性(1cycle)，94℃，30s。第二阶段，qPCR反应(40cycles)，95℃，5s变性；60℃，20s退火、延伸。

5、数据处理

LightCycler 480II PCR仪可自动分析并计算出每个样本每个基因的Ct值，本实验采用2-ΔΔct值进行相对定量，分析实验组与正常对照组目的基因表达的相对倍数变化，计算步骤如下：

ΔCt实验组＝Ct(实验组目的基因)-Ct(实验组外参基因)；ΔCt对照组＝Ct(对照组目的基因)-Ct(对照组外参基因)；ΔΔCt＝ΔCt实验组-ΔCt对照组；F＝2

6、生物大样本验证结果

根据以上测序数据结果，使用exoRNeasy Maxi Kits试剂从RA患者(按互动度分组，高度活动组RA-H、低度活动组RA-L，n＝32例)血清样本和正常人对照组(年龄性别与RA组匹配，n＝32例)对照血清样本中提取总RNA，并使用NanoDrop分光光度计ND进行浓度、纯度和完整性控制。然后用QuantiNova Reverse Transcription Kit合成来自每个样品的cDNA。随后使用SYBR Green试剂盒对cDNA产物进行qPCR。

PCR扩增如下进行：95℃5min，然后95℃10s，60℃60s，40个循环。然后，使用2

qRT-PCR结果显示，lncRNA中TCONS_I2_00013502(其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)、ENST00000363624(其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)的表达具有显著差异性(P＜0.05)(见图1)。其中，与Normal组相比，RA患者血清外泌体中TCONS_I2_00013502的表达显著增高(P＜0.05)，ENST00000363624在RA患者血清外泌体中显著降低(P＜0.05)。

对TCONS_I2_00013502、ENST00000363624在不同分组RA病人中的表达进行分析，可以看出TCONS_I2_00013502、ENST00000363624与疾病活动度没有显著差异(P＞0.05)(见图2)。

核苷酸序列SEQ ID No.1如下：

ATTTCCATTTCAGTATGTGCATCCAGGAGATTAGTCATTATATCCTTTCTTTCAGTCATGTATCCGTTCATTACACAGTTGAAATATTGATTCATTCTCTTGTATGCTAAGCAATGAGCTATACATGAGGAATCCGAGAACAACACAGTTTGTCCTCAAGAGTACAGGTTTAATAAAAGGCAATTAGAATAGAAAAAAGTGCTTTAACAAAAATATAATCCATGATACTATGAGATCTGAAAGATGGGCATTCAAGTCTAACAGAGCTTAAAGGAAAAAGTAAAATTTAAGGAAAAAAAAAAAAAGCAAAAGTACGAAAGATGGGCATCAATCCTTCCAAGTCTTCAAATCAATGCCACCAAAGGAAGTGTGCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTGGGAAGGTGCAGGGTCTCACTATATTGCCCAGCTGGTCTCAAACTCCTGGCCTCAAGTATCTGCCAGCCTTGACCTCCTAAAGTGCTGCAATTACAGATGGAAGTGATATTTCAGCTGATAAGGGTTAAAAAAAAGGTAACCAATGGGGAGGTGAGAGTGATAGGACATTTCAGTTACAGAAACCGGCATGTTCAAATGCCAAGAAGTGCTGGAGAACATGATGAACCTGATAATCACAAGTAATGTGGTTCTGCTGAGAGGAAGTATGTCAAGTCTCCTGCAGTCATGGAAAGAGACTCTCTTAGAATGACAATTCCTTTAGAACAAGAAGGTGTTATGCATATTTTTATGTGTCTGGCATTCAATAAATGTTTGTTAGGTAAACAAAATTCCATTCATTTCTAATTTTCTCATGGTTTCTAGTAAAAGACAAACACTCATCTTCAAAATGTTATGAGAGTTGGGAGATGAGTGGTACAAAAAATTGACTGAAATAATAAATTTCACGGTTTCTCTATCATCCATCTTGAAATAATCTCTCTGTCATGGTGTGCTCAAGATGCTTTGCTTTTCAACACCTCAAAAAATCTTTGGTTGGCTGGGCATAGTGGCGCATACTTTTAATTCCAGCACTTCGGGAGGCTGAGGCAGGTGGATTGTTTGAGCTCAGGGGTTTGCGACAAGCCTCGGCAACATGGTGAAACCCCATCTCTACCAAAAATACAAAAATTAGCCAGTCTTATAACCTGGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACAAACCAAAAAACAAAGATAAAAACTTTTTTAAATCATTGGTTCTGATTCTGGTAAATAAACTGTGCATTCAACTTTCAAATCATGTCCATCAACCAAGTTACCAAGCACACATGCTCTCAGCAAGAAATATGCCTTTTGTAGGGAAGATGTATCCCAGTCCAAATTACTAAATATTTAAAATTATGAGTCTAACCTAATATAGGTTAATTCTAATTCAGAAAAACAAAAATTCCTTGAGGACAAGGGTCATATAATTTATCTTTATATTCTCCAAACCTGGCATATTATGTATCACATATTAGTTGAACTCAAAGGAAATTTATAATGTTTAAAGAAAATTTTTGTCTAAATTACTTGTTGCCAACATTTGCAACCTACTTTGTTGAAATCACCAACATTTTCCAGACTTCCTAACCTTTTAGATTTTAGCTTTTTGGCAATTATTTTATTTTAACAATGAAATTAAACATTATATAGAAGCATTAAATCTTCTAATATATTTTAATGATTTAGAGAATAAGAAAATATCTCATGATTAACACTGGAAAAATAATGATAACTGGCTAATTATCATCCAAAAATTTGTTTTCATTATTACTTTGGTTATTCTGCAGAGCTTAAGCAAACTGTATTAACTTAAAAAAAAAAAAAGAAAATATTTGTAAAATATATGATCTAGCTGTACGCCTCTCAGATTTTACTAACTGGAAACATTTTAAAATATAATCAGTAAAATGATATGCTAACTACTTTAATACAACTATGGGCCGAACAAGGTGGCTCACGCCTGAGGCAGGAGGATCACTTGAGGGCAGAAGTTCCGAGACCAGCCTGGGTAACATAGTGAGACCCCCATCTCTAAAAGAAAGTTTTAAAAATTAGCCAGACACGGCCAGGCATGGTGGCTCATGCCCTAATCCCAGCACTCTGGGTGGCTGAGGCAGGCAGATCACCTGAGGTAAGATTTCGAGACCAGCCTGGCTAACATGGCGAAACTCCATCTTTACGAAAAATATGAAAATTAGCAGGCTGTGGTAGCGAGCACCTATTATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACCTGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCAAGACTGGGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCCACAGAGCGAGACTCTGTCTCAGGGGAAAAAAAAAAAATTAGCCAGATGTGATGGTGTGAGCCTGTAGTCCTAGCTACTCAGGAAGAGGAGGCAGAAGGATCTTTTTAGCCCAAAAGCTTGAGACTGCAGCGAGCTAAGATCATGCCACTGCACACCAGCCTAGGCAACAGAGCAACACCCTCTTAAAAAGGAAAAAAAAAAAGCATTTAACTATGATCTTTAATTTGCCAACACTGTCACTCCTGCATGTTATACTCCTTATACACCAGTTAATTTTCCCTTAACAGTTTCTTAGACCTAAGTCTCTCCCCACTACTTATGAAGTTGAAATCAAAACATTTAAAGATCTGCTCCCTTTCTGGGAGCTCTATCTTACCAAGACAGTCTACTTCCTTCCTGGGTGTGGCAAATATCTAATAAAGCTAGGCTGAGCTGCAATTAGATAAATCAGTCACGATCACCTAGTACAATTTAAGACTAAAAATTTCTATGGTTAAATTAATCTATCCCCCATTTTAAATGAAAATACAGAATTTTATTATTTTTAAACTTTTATTCTAGATTGGGGGGGTACATGTGCAGGTTTGTTATATAGGTAAATTCATGTCACAGGGGTTTGGTGTACAGATTATTTCATTACTCAGGTACTAAAAAAAGTACCTGATGGGTATTTTTTCTGATCCTCTCCCTCCTCCCACCCTCTACCCTCAAGGAGGCCCCTATGTCTGTTGTTCCCCTCTTTGTGTCCCTGTGTTCTCGTCATAAGTGAGAACATTCAGTATTTGGTTTTCTGTTCCTGTGTTCGCTAAAGGTAATGGTCTCCAGCCCCATCCATGTTGCTGCAAAGGACATTATCTCAATCTTTTTTTCATGGCTGCATAGTGTTCCATGGTGCATATGTACCACATTTTCTTTATCC。

核苷酸序列SEQ ID No.2如下：

GCTGGAGTGCAATGGCATGATCTCGGCTCACTGCAACCTCTGCTTCCCAGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCAAAGTAGCTGGGATTACAGGCGTC。

7、受试者工作特征曲线(ROC)分析

利用GraphPad Prism 9进行ROC曲线分析：结果显示TCONS_I2_00013502(AUC＝0.870)、ENST00000363624(AUC＝0.864)显示出较高的RA的诊断价值。如图3所示，TCONS_I2_00013502下方面积为0.870，ENST00000363624下方面积为0.864，其联合指标下方面积为0.934，说明TCONS_I2_00013502和ENST00000363624对于RA具有很好的预测效果。根据TCONS_I2_00013502敏感度和特异性计算得到的尤登指数(敏感度+特异度-1)最高为0.625(敏感度93.8％，特异度68.7％)。根据ENST00000363624敏感度和特异性计算得到的尤登指数(敏感度+特异度-1)最高为0.594(敏感度81.30％，特异度78.10％)；根据TCONS_I2_00013502和ENST00000363624组合敏感度和特异性计算得到的尤登指数(敏感度+特异度-1)最高为0.75(敏感度93.8％，特异度81.2％)。

本发明首次提出了血清外泌体LncRNA TCONS_I2_00013502和LncRNAENST00000363624组合的表达水平在类风湿性关节炎患者外周血的外泌体中显著变化(高表达LncRNA TCONS_I2_00013502、低表达LncRNAENST00000363624)，该分子标记组合可用于类风湿性关节炎的诊断。本发明可为临床类风湿性关节炎的诊断提供新策略。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。