神经递质化合物在制备治疗结直肠癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物及其制备技术领域，具体涉及一种神经递质化合物在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，以及治疗结直肠癌的药物。

背景技术

结直肠癌是目前世界上癌症引发死亡的主要因素之一。据已有的报道发现，结直肠癌是全球第三大常见肿瘤，在我国，结直肠癌的发病情况也呈现出逐年上升的趋势。

传统的治疗方法，包括手术和放化疗等，对早中期结直肠癌的治疗举足轻重。但是，晚期结直肠癌病人的治疗手段(包括各种靶向治疗的药物)则非常有限，这也导致结直肠癌病人整体的5年生存率仍不理想。因此，寻找更多的靶点和更有效的药物对于提高结直肠癌的整体疗效至关重要。

目前，有研究提出脑-肠轴的概念，并指出脑-肠轴是一种连接大脑、中枢神经系统、肠神经系统以及自主神经系统的神经双向通路。外界和机体的相关传入信息经大脑整合后，可以直接作用于胃肠道部位的平滑肌细胞，或者沿自主神经和神经内分泌系统传递调控信息至胃肠道神经丛，从而实现脑-肠轴的运转。神经递质作为神经调节过程中的小分子化学物质发挥着至关重要的作用。例如，由B细胞合成和分泌的GABA小分子，能够促进单核细胞分泌IL-10从而抑制CD8

鉴于以上研究，有必要开发一种或几种在结直肠癌的发生发展过程中产生影响的神经递质化合物，也将有利于阐明神经系统对肠道肿瘤的作用途径。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种神经递质化合物在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。

同时，本发明还提供一种治疗结直肠癌的药物。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

一种神经递质化合物在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。

作为本发明一种优选的实施方案，所述神经递质化合物包括IPAG。IPAG是非阿片Sigma-1受体的拮抗剂。Sigma-1受体是具有伴侣蛋白活性的一类受体蛋白，主要存在于内质网膜和核包膜上，与其他哺乳动物蛋白无同源性，能够与多种精神药物相互作用，如可卡因和安非他明等。SIGMAR1基因调节各种信号通路，包括离子通道、G蛋白偶联受体、脂筏结构形成、内质网应激以及染色质重塑等。已有研究表明SIGMAR1基因通过影响内质网的相关降解调节线粒体动力学。

作为本发明一种优选的实施方案，所述应用为：神经递质化合物在制备抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和/或侵袭的药物中的应用。

作为本发明一种优选的实施方案，所述应用为：神经递质化合物在制备促进结直肠癌细胞凋亡的药物中的应用。

作为本发明一种优选的实施方案，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、口服液或针剂。

作为本发明一种优选的实施方案，所述药物还包含药学上可接受的辅料。所述辅料包括但不限于包衣材料、溶剂、增溶剂、粘合剂、稳定剂、抗氧化剂、pH值调节剂、矫味剂等。辅料成分可以根据药剂学常识选用。

一种治疗结直肠癌的药物，所述药物包含治疗有效量的神经递质化合物。

作为本发明一种优选的实施方案，所述神经递质化合物包括IPAG。

作为本发明一种优选的实施方案，所述药物还包含药学上可接受的辅料。所述辅料包括但不限于包衣材料、溶剂、增溶剂、粘合剂、稳定剂、抗氧化剂、pH值调节剂、矫味剂等。

作为本发明一种优选的实施方案，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、口服液或针剂。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种神经递质化合物在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。本发明借助克隆形成实验、EDU增殖染色实验、Western Blot实验发现，神经递质化合物IPAG能够有效的抑制多种结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并且促进癌细胞凋亡。同时，经过数据库数据分析发现，IPAG的受体基因SIGMAR1在肿瘤样本中高表达，符合其拮抗剂的作用效果。因此，神经递质化合物IPAG可用于制备治疗结直肠癌的药物，并能为神经系统在结直肠癌发生发展过程中可能存在的调控作用提供借鉴。

附图说明

图1为本发明实验例中神经递质化合物在MC38细胞系上的筛选结果；

图1中红色箭头所指为IPAG，1-24代表的神经递质化合物如下表1所示。

图2为本发明实验例中IPAG对多种结直肠癌细胞系的影响。

图3为本发明实验例中IPAG对鼠源肠道类器官的影响；

图3中A为对照组，B为IPAG组，比例尺＝500μm。

图4为本发明实验例中SIGMAR1基因在多种结直肠癌细胞系中的表达情况。

图5为本发明实验例中SIGMAR1基因在肿瘤和正常样本中的表达情况。

图6为本发明实验例中IPAG在不同时间段对LOVO细胞系的影响。

图7为本发明实验例中IPAG在96h对LOVO细胞系的IC50。

图8为本发明实验例中IPAG对肿瘤细胞系增殖的影响。

图9为本发明实验例中IPAG影响的结直肠癌细胞系的死亡方式。

图10为本发明实验例中Western blot检测Caspase3的切割情况。

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，以上对实验例中得到的附图进行简单地介绍。应当理解，上述附图仅示出了本发明的某些实验例，不应看作是对权利要求保护范围的任何限制。对于本领域的普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图得到其他相关的附图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例和实验例对本发明的技术方案进行清楚完整的描述。但本领域技术人员应当理解，实施例仅用于说明本发明的技术方案，而不应视为限制本发明的保护范围。基于下述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施方案，例如修改、变形或简单替换后得到的实施方案，均应属于本发明的保护范围。

下述实施例及实验例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的原料、试剂、仪器等如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1

本实施例提供了一种神经递质化合物在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，所述神经递质化合物为IPAG，非阿片Sigma-1受体的拮抗剂。

实施例2

本实施例提供了一种神经递质化合物IPAG在制备抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和/或侵袭的药物中的应用。

实施例3

本实施例提供了一种神经递质化合物IPAG在制备促进结直肠癌细胞凋亡的药物中的应用。

实施例4

本实施例提供了一种治疗结直肠癌的药物，包含治疗有效量的神经递质化合物IPAG和药学上可接受的辅料；所述药物为片剂剂型，所述药学上可接受的辅料包含包衣材料、粘合剂等。

实验例

一、神经递质化合物的筛选及结直肠癌细胞系的验证

1、鼠源MC38细胞系以2000个细胞每孔铺到96孔板中，每孔中药物(共665种神经递质化合物)稀释到浓度为10μM，药物与细胞共孵育48h；

2、用PBS洗涤细胞2-3次，进行hochest33342活细胞核染料染色30min；

3、选择波长450nm，进行高内涵拍照分析，记录每孔中活细胞的个数，用加药组的细胞个数/空白组细胞数×100％，计算细胞存活率。实验结果如图1所示，图1中1-25代表的药物如下表1所示。

表1实验例中使用的部分神经递质化合物

从图1可以看出，在鼠源MC38结直肠癌系上进行665种神经递质化合物的筛选，最终筛选出能显著抑制MC38结直肠癌细胞生长的药物IPAG(非阿片类Sigma-1受体拮抗剂)。

在其他细胞系(包括人源结直肠癌细胞系LOVO、HCT116、SW620、SW480以及RKO)上的验证方法和上述方法一致。实验结果如图2所示。

从图2可以看出，IPAG对人源结直肠癌细胞系LOVO、HCT116、SW620、SW480以及RKO同样具有显著的抑制效果。

二、IPAG对鼠源肠道类器官的影响

1、取新鲜的C57BL/6小鼠回肠组织，剪碎、清洗后分别进行低浓度和高浓度的0.5MEDTA消化，得到干净的隐窝；

2、以5～10个/μL隐窝的量接种到96孔板中，每孔30个隐窝，加入含10mM IPAG的培养基，培养7天，每天进行拍照记录类器官的形态。实验结果如图3所示。

从图3可以看出，以鼠源肠道类器官为研究对象，模拟正常肠上皮细胞，以同样的阴窝浓度处理，发现IPAG对类器官的作用不明显。

三、SIGMAR1基因在肠癌细胞系及肿瘤和正常样本中的表达情况

1、登录单基因在肿瘤细胞系中表达情况的Depmap数据库网站，输入SIGMAR1基因进行检索，检索完成后点击肿瘤类型选项，选择结直肠癌腺瘤，在所出现的页面选择DATAplot下载数据后，选择相应的细胞系进行分析，结果如图4所示。

从图4可以看出，Sigma-1受体基因SIGMAR1在各种结直肠癌细胞系中均为高表达，并且可以得到qPCR的印证。

2、登录UALCAN数据库，点击癌症基因数据库TCGA数据库，输入SIGMAR1基因，选择结直肠癌癌症类型，分析得到SIGMAR1基因在正常和癌症样本中的占比，结果如图5所示。

从图5可以看出，相较正常样本，SIGMAR1基因在肿瘤样本中高表达，符合筛选到的药物是Sigma-1受体的拮抗剂的情况。

四、IPAG对肿瘤细胞系生长的影响及其IC50

1、首先设置不同的药物浓度，分别为0、10nm、100nm、1μM、2μM、4μM、6μM、8μM及10μM这9个浓度梯度，每个浓度梯度设置6个平行；

2、按照1500个/孔铺细胞到96孔板中，空白组不加细胞只加含血清的DMEM培养基；实验设置6h、48h、72h及96h这四个时间点测定吸光度值；

3、在测定吸光度之前，每孔加入10μL的CCK8溶液在培养箱中孵育20min；

4、调节酶标仪的波长为490nm，测定记录数据，其中，肿瘤细胞系的存活存活率％＝(加药组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100％，IC50值在作图软件GraphPad Prime8中输入log(浓度)和对应的存活率，进行分析计算。实验结果如图6、图7所示。

从图6、图7可以看出，以LOVO细胞系为研究对象进行CCK8实验，计算IPAG在96h的IC50值为2μM。

五、IPAG对肿瘤细胞系增殖的影响

1、按照2000个/孔铺细胞到96孔板中，实验组每孔的药物浓度稀释至2μM；

2、细胞与IPAG共孵育48h；

3、加入预热的EDU试剂，室温孵育2h；

4、孵育完成，去除原有的培养基，加入4％多聚甲醛室温固定10min，用PBS洗涤3次，每次5min；

5、再加入Triton-100室温透化10min，透化完成后洗涤2-3次；

6、按照96孔板的大小加入50μL的Click反应液，室温孵育30min；

7、去除Click反应液，用PBS洗涤2次，每次5min；

8、再加入含1/20的DAPI核染料，孵育20min；高内涵选择488nm荧光波长及450nm进行拍照，并分析DAPI蓝光(细胞核的数量)和FITC绿光(增殖细胞数量)所代表的细胞个数，增殖的细胞比例％＝绿色荧光细胞数量/蓝色荧光细胞数量×100％。实验结果如图8所示。

从图8可以看出，克隆形成以及EDU增殖实验表明药物IPAG能够显著抑制LOVO细胞系的增殖。

六、IPAG影响的结直肠癌细胞系死亡方式

1、细胞凋亡流式检测

(1)以20万个/孔的细胞数铺到6孔板中，将加药组(IPAG)浓度稀释为2μM，药物与细胞共孵育48h；

(2)收集细胞用PBS洗涤1次，加入100μL 1×Binding Buffer重悬；

(3)加入5μL Annexin V-Alexa Fluor 647和10μL PI，轻轻混匀；室温避光反应15min；加入400μL 1×Binding Buffer，混匀后放置于冰上；

(4)设置Alexa Fluor647最大激发波长为651nm，最大发射波长为667nm；PI-DNA复合物的最大激发波长为535nm，最大发射波长为615nm，调节流式细胞仪的波长后，收集10000个细胞并分析细胞凋亡情况，结果如图9所示。

2、细胞凋亡Western Blot检测

(1)按照流式检测细胞凋亡同样的步骤，将药物IPAG与细胞共孵育48h；

(2)收集实验组和对照组细胞进行1×loading Buffer蛋白电泳上样缓冲液裂解，沸水浴15min；

(3)按照对照组：实验组为5μL：25μL的上样量进行SDS-PAGE，电泳条件为：浓缩胶80V，30min，分离胶120V，1h；

(4)半干转膜仪中进行18V、1h转膜；

(5)Caspase3蛋白及其切割条带的位置分别是35kDa、19kDa及17kDa，内参β-actin对应45kDa，5％的脱脂牛奶封闭1h；

(6)洗涤3次，每次5min；

(7)加一抗孵育2h；

(8)洗涤3次，每次5min；

(9)加二抗孵育1h；

(10)洗涤3次，每次5min；

(11)在膜上滴加适量的发光液进行显影。实验结果如图10所示。

从图9、图10可以看出，通过流式细胞凋亡PI-FITC及Western blot检测Caspase3凋亡蛋白表达情况，发现细胞的死亡为程序性细胞死亡(即凋亡)。

本发明借助于克隆形成实验、EDU增殖染色实验、Western Blot实验发现神经递质化合物IPAG能够有效的抑制多种结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并且促进癌细胞凋亡。同时，经过数据库数据分析发现药物IPAG的受体基因SIGMAR1在肿瘤样本中高表达，符合其拮抗剂的作用效果。因此，神经递质化合物IPAG可用于制备治疗结直肠癌的药物，并能为神经系统在结直肠癌发生发展过程中可能存在的调控作用提供借鉴。

虽然上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实验例对本发明的技术方案做了详尽的描述，但需要说明的是，实施例和实验例仅用于说明本发明的技术方案和技术效果，而不应视为对本发明保护范围的任何限制。基于本发明技术构思所做的简单变形、修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。