EGFR蛋白磷酸化的抑制试剂及抑制方法和用途

技术领域

本发明涉及生物分析及医学领域，具体涉及一种针对EGFR蛋白磷酸化的特异性抑制试剂及抑制方法和用途。

背景技术

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是一类具有酪氨酸激酶活性的细胞膜表面受体，EGFR是肿瘤细胞促有丝分裂和转化的一个重要靶点，在许多肿瘤细胞中过度表达，其介导的信号转导与肿瘤细胞的生长、增殖、转移等过程密切相关。

EGFR在细胞增殖、存活、迁移、粘附和分化方面发挥着重要作用，具有酪氨酸激酶活性。EGFR自磷酸化后可与生长因子受体结合蛋白的复合物结合，从而激活Ras蛋白。活化的Ras激活下游丝/苏氨酸蛋白激酶Raf，从而使Erk(细胞外调节蛋白激酶)磷酸化，将信号传至细胞核内，导致核内转录因子的磷酸化，从而启动靶基因的转录，最终导致细胞增殖、扩散等生物学效应。

通过抑制EGFR可有效抑制肿瘤的生长，因此有一些研究针对EGFR为靶点开发药物，靶向抑制EGFR酪氨酸激酶。可见，寻找EGFR抑制剂，阻断EGFR的信号转导，对于肿瘤的治疗至关重要。

发明内容

本发明首次发现，当细胞的碘钠转运体(NIS)表达高时，碘化钠可以显著抑制EGFR蛋白磷酸化；当细胞的NIS表达低时，可通过辅助剂KT5823提高细胞NIS摄碘功能，从而碘化钠可以正常进入细胞并显著抑制EGFR蛋白磷酸化。基于此，碘化钠处理可作为EGFR蛋白磷酸化抑制剂，为EGFR的磷酸化抑制和疾病的治疗提供新的手段。

具体地，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种EGFR蛋白磷酸化的抑制试剂，其包含碘化钠。

进一步地，所述EGFR蛋白磷酸化的抑制试剂还包含辅助剂KT5823。

第二方面，本发明提供一种EGFR蛋白磷酸化的抑制试剂的制备方法，其步骤包括：

将碘化钠溶解于超纯水，制得碘化钠母液，作为EGFR蛋白磷酸化的抑制试剂；

将KT5823溶解于DMSO，制得KT5823母液，作为EGFR蛋白磷酸化的抑制试剂的辅助剂。

进一步地，准确称取纯度大于99.9％的碘化钠，将其溶解于超纯水，制得浓度为200mM的碘化钠母液，作为EGFR蛋白磷酸化的抑制试剂；准确称取纯度大于98％的KT5823，将其溶解于DMSO，制得浓度为2mM的KT5823母液，作为EGFR蛋白磷酸化的抑制试剂的辅助剂。

第三方面，本发明提供一种EGFR蛋白磷酸化的抑制方法，包括以下步骤：

将碘化钠溶解于超纯水，制得碘化钠母液；

将碘化钠母液加入细胞培养基中，配制成EGFR磷酸化抑制培养基；

对于NIS高表达细胞，直接利用含有碘化钠的EGFR磷酸化抑制培养基抑制EGFR蛋白的磷酸化；

对于NIS低表达细胞，将EGFR蛋白的磷酸化抑制试剂辅助剂加入含有碘化钠的EGFR磷酸化抑制培养基，再用其抑制EGFR蛋白的磷酸化。

其中，NIS表达的“高”与“低”，可以通过现有技术或本领域公知常识来确定，例如甲状腺细胞中NIS表达量高，其他类型细胞中NIS的表达量低；可以设定一个阈值，大于等于该阈值的认为是NIS高活性细胞，小于该阈值的认为是NIS低活性细胞。

进一步地，NIS高表达细胞的EGFR蛋白的磷酸化抑制方法的具体步骤为：

1)以B-CPAP、Hth-7、SW579和Nthy-Ori-3-1的NIS高表达细胞为例，首先对以上细胞进行传代培养，将培养好的细胞种板至96孔板，每孔2×10

2)配制EGFR磷酸化抑制培养基：向各细胞培养基中加入适量200mM的碘化钠母液，配制成EGFR磷酸化抑制培养基；

3)细胞种板过夜培养后，小心将细胞培养基吸出，并加入EGFR磷酸化抑制培养基，置于37℃、5％二氧化碳细胞培养箱继续培养24小时。

更为优选地，所述EGFR磷酸化抑制培养基是碘化钠浓度为100μM的细胞培养基。

进一步地，上述NIS高表达细胞的EGFR蛋白的磷酸化抑制方法还包括对EGFR蛋白的磷酸化程度进行检测的步骤。在对EGFR蛋白的磷酸化程度进行检测前还包括：

将EGFR磷酸化抑制培养基培养好的细胞用磷酸缓冲液PBS进行清洗2-3次；加入适量固定-破膜液，常温避光固定30分钟或37℃避光固定10分钟；

再将固定后的细胞加入1×破膜液进行清洗2-3次；向清洗后的细胞中加入适量EGFR一抗溶液，室温避光孵育30分钟；

一抗孵育后，加入1×破膜液进行清洗3次；向清洗后的细胞中加入适量的荧光二抗溶液，室温避光孵育60分钟；

荧光二抗孵育后，加入1×破膜液进行清洗3次；加入200μL的加有细胞核染色液Horchest的Flurbrite DMEM，避光，立即进行高内涵细胞成像分析系统检测。

优选地，所述固定-破膜液采用新鲜配置的eBioscience

优选地，所述1×破膜液采用新鲜配置的eBioscience

优选地，所述EGFR一抗溶液采用Cell Signaling Technology公司Phospho-EGFReceptor(Tyr1068)(D7A5)

优选地，所述荧光二抗溶液采用Cell Signaling Technology公司Anti-rabbitIgG(H+L)(#4412)二抗，并用1×破膜液进行1:1000稀释。

进一步地，NIS低表达细胞的EGFR蛋白的磷酸化抑制方法的具体步骤为：

1)以BeWo、TE-1和MKN-45低NIS表达细胞为例，首先对以上细胞进行传代培养，将培养好的细胞种板至96孔板，每孔2×10

2)配制含有辅助剂KT5823的EGFR磷酸化抑制培养基：向各细胞培养基中加入适量2mM的KT5823和200mM的碘化钠母液，配制成含有辅助剂KT5823的EGFR磷酸化抑制培养基；

3)细胞种板过夜培养后，小心将细胞培养基吸出，加入含有辅助剂KT5823的EGFR磷酸化抑制培养基，置于37℃、5％二氧化碳细胞培养箱继续培养24小时。

更为优选地，所述含有辅助剂KT5823的EGFR磷酸化抑制培养基是KT5823浓度为2μM，碘化钠浓度为10μM的细胞培养基。

进一步地，上述NIS低表达细胞的EGFR蛋白的磷酸化抑制方法还包括对EGFR蛋白的磷酸化程度进行检测的步骤。在对EGFR蛋白的磷酸化程度进行检测前还包括：

将含有辅助剂KT5823的EGFR磷酸化抑制培养基培养好的细胞用磷酸缓冲液PBS进行清洗2-3次；加入适量固定-破膜液，常温避光固定30分钟或37℃避光固定10分钟；

再将固定后的细胞加入1×破膜液进行清洗2-3次；向清洗后的细胞中加入适量EGFR一抗溶液，室温避光孵育30分钟；

一抗孵育后，加入1×破膜液进行清洗3次；向清洗后的细胞中加入适量的荧光二抗溶液，室温避光孵育60分钟；

荧光二抗孵育后，加入1×破膜液进行清洗3次；加入200μL的加有细胞核染色液Horchest的Flurbrite DMEM，避光，立即进行高内涵细胞成像分析系统检测。

优选地，所述固定-破膜液采用新鲜配置的eBioscience

优选地，所述1×破膜液采用新鲜配置的eBioscience

优选地，所述EGFR一抗溶液采用Cell Signaling Technology公司Phospho-EGFReceptor(Tyr1068)(D7A5)

优选地，所述荧光二抗溶液采用Cell Signaling Technology公司Anti-rabbitIgG(H+L)F(ab')2Fragment(Alexa

进一步地，对EGFR蛋白的磷酸化程度进行检测的具体方法包括：

高内涵细胞成像分析系统选择DAPI和FITC两个通道进行检测，其中DAPI通道的曝光时间为5ms，FITC通道的曝光时间为100ms。采用20x的镜头，每孔9个视野进行采集。并通过系统自带的分析软件对EGFR表达水平进行分析。

第四方面，本发明提供上述EGFR蛋白的磷酸化抑制试剂即碘化钠在抗肿瘤药物中的用途。

本发明的有益效果如下：

本发明首次发现，碘化钠可以显著抑制EGFR蛋白的磷酸化，其磷酸化位点845和1068均可显著地被碘化钠抑制，因此碘化钠可作为EGFR的抑制剂。即加入碘化钠能够对酪氨酸进行碘化修饰，形成空间位阻，从而抑制酪氨酸的磷酸化。

本发明中的EGFR磷酸化抑制方法，可潜在地应用于抗肿瘤药物的研发。EGFR是肿瘤细胞促有丝分裂和转化的一个重要靶点，在许多肿瘤细胞中过度表达，与肿瘤的发生发展及转移密切相关。抑制EGFR磷酸化激活可抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和血管再生，诱导肿瘤细胞凋亡。

附图说明

图1为B-CPAP细胞磷酸化抑制剂100μM处理后磷酸化位点845和1068磷酸化结果图；

图2为Hth-7细胞磷酸化抑制剂100μM处理后磷酸化位点845和1068磷酸化结果图；

图3为SW579细胞磷酸化抑制剂100μM处理后磷酸化位点845和1068磷酸化结果图；

图4为Nthy-Ori-3-1细胞磷酸化100μM抑制剂处理后磷酸化位点845和1068磷酸化结果图。

图5为BEWO细胞2μM KT5823和磷酸化抑制剂10μM处理后磷酸化位点845和1068磷酸化结果图；

图6为TE-1细胞2μM KT5823和磷酸化抑制剂100μM处理后磷酸化位点845和1068磷酸化结果图；

图7为MKN-45细胞2μM KT5823和磷酸化抑制剂10μM处理后磷酸化位点845和1068磷酸化结果图；

图1～图7中，横坐标处的Con表示经碘化钠处理前各细胞的EGFR磷酸化845和1068位点，NaI表示经碘化钠处理后各细胞的EGFR磷酸化845和1068位点，纵坐标处的Positive表示细胞中EGFR蛋白磷酸化的阳性率。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1：甲状腺癌细胞B-CPAP的磷酸化抑制效果测定

1、仪器与试剂：

高内涵细胞成像分析系统(Molecular Devices公司)；碘化钠；超纯水；eBioscience

2、B-CPAP细胞的培养和磷酸化抑制处理

(1)B-CPAP细胞复苏-传代：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL的培养基(RPMI-1640+10％FBS+1％Penicillin-Streptomycin Solution)混合均匀。在500RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6cm皿中)，培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

细胞密度达80％-90％，即可进行传代培养。将0.25％胰酶-0.53mM EDTA消化液置于37°预热，倒掉培养瓶中的培养基，往培养瓶中加入3-5ml PBS，轻晃洗涤后弃去。往瓶中加1-2ml预热好的胰酶，置于37°孵育消化，消化好后加入3ml完全培养基终止消化。用移液枪轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之完全脱落，然后收集细胞悬液，1200rpm离心3min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞，进行传代。

(2)待细胞长至足够量，收集细胞，并测定细胞密度，细胞种板至96孔板，每孔2×10

(3)磷酸化抑制剂处理：配制EGFR磷酸化抑制培养基，向各细胞培养基中加入适量200mM的碘化钠母液，配制成碘化钠浓度为100μM的细胞培养基。细胞种板过夜培养后，小心将细胞培养基吸出，并加入EGFR磷酸化抑制培养基，置于37℃、5％二氧化碳细胞培养箱继续培养24小时。

(4)细胞固定：将EGFR磷酸化抑制培养基培养好的细胞用磷酸缓冲液PBS进行清洗2-3次；加适量入固定-破膜液，常温避光固定30分钟或37℃避光固定10分钟。

(5)细胞染色：固定后的细胞加入1×破膜液进行清洗2-3次；向清洗后的细胞中加入50μL的1：500稀释的EGFR一抗溶液(抗体Phospho-EGF Receptor(Tyr1068)(D7A5)

(6)荧光二抗孵育：一抗孵育后，加入1×破膜液进行清洗3次；向清洗后的细胞中加入适量的荧光二抗1:1000稀释的Anti-rabbit IgG(H+L)(#4412)溶液，室温避光孵育60分钟；

(7)高内涵检测：荧光二抗孵育后，加入1×破膜液进行清洗3次；加入200μL的加有细胞核染色液Horchest的Flurbrite DMEM，避光，立即进行高内涵细胞成像分析系统检测。高内涵细胞成像分析系统选择DAPI和FITC两个通道进行检测，其中DAPI通道的曝光时间为5ms，FITC通道的曝光时间为100ms。采用20x的镜头，每孔9个视野进行采集。并通过系统自带的分析软件对EGFR表达水平进行分析。

实施例2：甲状腺癌细胞Hth-7的磷酸化抑制效果测定

1、仪器与试剂：

同实施例1。

2、Hth-7细胞的培养和磷酸化抑制处理

(1)Hth-7细胞复苏-传代：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL的培养基(DMEM+10％FBS+1％Penicillin-Streptomycin Solution)混合均匀。在500RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6cm皿中)，培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

其他步骤同实施例1。

实施例3：甲状腺癌细胞SW579的磷酸化抑制效果测定

1、仪器与试剂：

同实施例1。

2、SW579细胞的培养和磷酸化抑制处理

(1)SW579细胞复苏-传代：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL的培养基(DMEM+10％FBS+1％Penicillin-Streptomycin Solution)混合均匀。在500RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6cm皿中)，培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

其他步骤同实施例1。

实施例4：永生化甲状腺细胞Nthy-Ori-3-1的磷酸化抑制效果测定

1、仪器与试剂：

同实施例1。

2、Nthy-Ori-3-1细胞的培养和磷酸化抑制处理

同实施例1。

实施例5：人胎盘绒毛癌细胞BeWo的磷酸化抑制效果测定

1、仪器与试剂：

高内涵细胞成像分析系统(Molecular Devices公司)；碘化钠；超纯水；KT5823；DMSO；eBioscience

2、BeWo细胞的培养和磷酸化抑制处理

(1)BeWo细胞复苏-传代：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL的培养基(DMEM+10％FBS+1％Penicillin-Streptomycin Solution)混合均匀。在500RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6cm皿中)，培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

(2)待细胞长至足够量，收集细胞，并测定细胞密度，细胞种板至96孔板，每孔2×10

(3)磷酸化抑制剂处理：配制含有辅助剂KT5823的EGFR磷酸化抑制培养基，向各细胞培养基中加入适量200mM的碘化钠母液和适量2mM的KT5823母液，配制成KT5823浓度为2μM碘化钠浓度为100μM的细胞培养基。细胞种板过夜培养后，小心将细胞培养基吸出，并加入含有辅助剂KT5823的EGFR磷酸化抑制培养基，置于37℃、5％二氧化碳细胞培养箱继续培养24小时。

其他步骤同实施例1。

实施例6：人食管癌细胞TE-1的磷酸化抑制效果测定

1、仪器与试剂：

同实施例5。

2、TE-1细胞的培养和磷酸化抑制处理

(1)TE-1细胞复苏-传代：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL的培养基(RPMI-1640+10％FBS+1％Penicillin-Streptomycin Solution)混合均匀。在500RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6cm皿中)，培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

其他步骤同实施例5。

实施例7：人胃癌细胞MKN-45的磷酸化抑制效果测定

1、仪器与试剂：

同实施例6。

2、MKN-45细胞的培养和磷酸化抑制处理

同实施例6。

综合实施例1和实施例7中的检测结果即图1～图7，可以看出，经碘化钠处理后B-CPAP、Hth-7、SW579、Nthy-Ori-3-1、BeWo、TE-1和MKN-45细胞的EGFR磷酸化845和1068位点均显著受到抑制。因此，本发明中的EGFR蛋白磷酸化抑制方法可为癌症药物的研发提供依据。

以上公开的本发明的具体实施例，其目的在于帮助理解本发明的内容并据以实施，本领域的普通技术人员可以理解，在不脱离本发明的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的。本发明不应局限于本说明书的实施例所公开的内容，本发明的保护范围以权利要求书界定的范围为准。