一种男性精子染色质浓缩异常的生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种男性精子染色质浓缩异常的生物标志物及其应用。

背景技术

通常来说，一对有正常夫妻生活的夫妻，一年还未怀孕，可被认定为不孕，需男女双方进行规范的诊疗。男性近些年，由于生活方式的改变，如抽烟、饮酒、熬夜、肥胖、久坐不运动等，男性精子质量呈断崖式下跌。对于精子质量低的患者，可通过治疗、用药或进行体外受精-胚胎移植等形式可以孕育下一代。但是目前临床上常见男性畸形精子症的病因因素复杂且多样性，例如病因包括生殖道感染、精索静脉曲张、射精管不全梗阻、免疫因素、遗传因素等、环境因素、生活习惯、全身性疾病等等，目前仍有30％～40％的病例无法明确其病因和发病机制。临床上检查的手段也很有限，快速找到发病机制，对症诊疗非常需要。

精子变形是精子发生的最后一个阶段，圆形精子细胞经过一系列剧烈的形态变化和染色质的极度凝集，形成具有特异形状的精子，最后在附睾中形成成熟精子。在精子变形过程中，染色质重塑是一个独特的过程，它使核小体从基于组蛋白的结构转变为主要基于鱼精蛋白的结构。经过这种大量的组蛋白-鱼精蛋白重构后，染色质凝集程度是体细胞的6倍或更加紧凑，这是正常精子发育所不可或缺的，意在保护单倍体基因组的进化保守性被正确携带到卵母细胞。精子染色质的任何恶化或改变都可能会对受精或后期胚胎发育产生严重影响。临床研究报道，许多男性的低生育力和不育与染色质重塑异常有关，并且染色体重塑异常的程度与弱-畸形精子的严重程度成正相关。

Fam170a(Family with sequences similarity 170member A)是睾丸特异性表达的基因，在小鼠、大鼠、人类和牛等动物体中具有高度保守性(详见NCBI-HomoloGene)。有研究通过不完全敲除Fam170a基因发现该敲除小鼠的生育力极度低下近乎为零，同时附睾尾精子畸形和精子活力下降，但Fam170a在精子变形过程中的具体功能机制仍然未知。因此，研究Fam170a的功能机制对临床男性畸形精子病因的诊断具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种男性精子染色质浓缩异常的生物标志物及其应用，以Fam170a mRNA转录水平作为精子染色质浓缩异常的标志物，为临床男性畸形精子症患者的诊断和治疗提供重要的应用价值。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种男性精子染色质浓缩异常的生物标志物，所述生物标志物为睾丸特异性表达的基因Fam170a。

检测上述的生物标志物的产品在制备用于诊断男性精子染色质浓缩异常的试剂盒中的应用。

优选地，所述男性精子染色质浓缩异常的临床表现为畸形精子症。

优选地，所述试剂盒通过检测受试者精子样本中Fam170a transcript variant1mRNA中的346-494bp基因片段转录水平进行诊断。

优选地，精子染色质浓缩异常的患者的精子样本中Fam170a mRNA的转录水平显著下调。

一种用于诊断男性精子染色质浓缩异常的试剂盒，包括检测Fam170a基因的转录水平的产品。

优选地，所述产品为引物探针，所述引物探针包括带有荧光基团的上、下游引物，所述上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

优选地，所述上游引物的3’端带有生物素，所述下游引物的5’端带有荧光基团FITC。

本发明的有益效果如下：

本发明通过研究发现Fam170a基因主要通过影响组蛋白与鱼精蛋白的替换，导致了精子染色质浓缩异常，可以作为男性精子染色质浓缩异常的生物标志物。并且通过设计的引物探针试剂盒检测患者精子样本中的Fam170a mRNA的转录水平，可以有效的判断患者是否患有染色质浓缩异常所引起的畸形精子症。本发明为临床男性畸形精子症患者的诊断和治疗提供重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中Fam170a对雄性小鼠生殖能力和精子形态的影响：A为各组成年雄鼠的平均窝产仔率的统计；B为各组中有活力的精子占总个精子数的百分比；C为各组中不同运动状态的精子占有活力精子数的百分比；D为各组中前进型精子占总个精子数的百分比；E为各组中头部出现异常形态占总个精子数的百分比；F为各组中不同畸形类型精子占总个精子数的百分比；G为WT组中正常精子和KO组中不同畸形类型精子的代表图；其中，

图2为实施例2中Fam170a在精子变形过程中的作用：A为各组成年雄鼠精子变形过程中不同时期精子细胞核在电镜下的形态代表图，以及各组小鼠附睾尾部精子细胞核在电镜下的形态代表图，标尺均为1μm；B为各组小鼠附睾尾部精子蛋白的表达水平；C为各组小鼠附睾尾部精子中鱼精蛋白Prm1和Prm2的表达水平代表图；D为各组小鼠附睾尾部精子鱼精蛋白Prm1的相对表达水平；E为各组小鼠附睾尾部精子鱼精蛋白Prm2的相对表达水平；其中，

图3为实施例3中成年男性射出精子样本中Fam170a mRNA转录水平：A、B、C分别为GEO DataSets：GSE6969中运用三种不同的基因芯片探针检测正常和严重性或持续性畸形精子症男性精液中Fam170a的相对转录水平；D为临床上收集到的正常(Control)和三例畸形精子症患者(Sample 1、2、3)中精子的Fam170a transcript variant 1mRNA346-494bp基因片段的相对转录水平。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步详细说明。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中使用的动物为C57BL/6小鼠，购自赛业生物科技公司和维通利华实验动物技术公司。

实施例1Fam170a全敲雄性小鼠的生殖能力和精子状态研究

由于Fam170a基因在哺乳动物中高度保守性和特异在睾丸组织中表达。因此本实施例利用Fam170a敲除小鼠模型，统计每窝产仔率，同时结合苏木素染色和CASA仪器检测小鼠精子的形态和活力，具体如下：

1、窝产仔率统计

将12周正常(WT组)和Fam170a全敲(KO组)雄性小鼠分别与10周正常的雌性小鼠合笼交配6个月，统计此交配期间窝产仔数。

实验结果如图1中A所示，Fam170a全敲雄性小鼠(KO组)完全不育。

2、精子活力检测

取成年正常(WT组)和Fam170a全敲(KO组)雄性小鼠的附睾尾部，并将其放入37℃预热好的1mL台式液中释放附睾尾部精子。约30min后取1μL台式液放入CASA仪中，测量精子活力、精子各种运动速度的分布和前进行性精子数量。

实验结果显示，KO组小鼠的精子活力与WT组相比显著性下降(图1中B，

3、精子形态分布

取成年正常(WT组)和Fam170a全敲(KO组)雄性小鼠的附睾尾部精子，涂片到载玻片后。10min渗透后对其进行5min的苏木素染色，水洗，封片，正置显微镜下镜检。

实验结果显示，在KO组中精子头部畸形率达到80％，极显著的高于WT组(图1中E，

以上实验结果说明，Fam170a蛋白对雄性精子活力和生育力的维持起着关键性的作用。

实施例2Fam170a全敲雄性小鼠附睾尾部精子畸形的机制探究

本实施例利用透射电镜和蛋白免印迹方法探究Fam170a全敲雄性小鼠尾部精子畸形的机制，具体如下：

1、透射电镜观察精子变形过程中不同时期精子核形态

取成年正常(WT组)和Fam170a全敲(KO组)雄性小鼠的曲精细管，剪碎放入2.5％戊二醛中固定，梯度丙酮脱水，环氧树脂浸透和包埋，超薄片切片，放置铜网和染色，上机拍照等。

实验结果如图2中A所示，KO组第7期(stage 7)精子的核形态与WT组无明显差异，但是出现核膜破裂；KO组从第8期(stage 8)到第15期(stage 15)精子的细胞核形态均出现异常，并且在第15期可以明显看见精子细胞核内出现空洞。同时，附睾尾部精子(Caudasperm)的细胞核形态也异常，这与实施例1中的实验结果保持一致。

2、蛋白免疫印迹

(1)为了探究Fam170a全敲雄性小鼠在精子变形过程中细胞核形态出现异常的原因。首先，提取WT组和KO组附睾尾部精子中鱼精蛋白，根据相关文献(Soler-Ventura etal.,Protein&Peptide Letters,2018)中发表的精子鱼精蛋白提取方法，提取鱼精蛋白Prm1和Prm2。然后通过酸脲聚丙烯酰胺凝胶跑相应蛋白，用考马斯亮蓝染30min，醋酸溶液洗涤几次。

实验结果如图2中B所示，鱼精蛋白Prm1和Prm2在KO组中均下降。

(2)为了进一步验证鱼精蛋白的含量，收集成年正常(WT组)、杂合(DNA双链中的一条链上的Fam170a被敲除，HET组)和Fam170a全敲(KO组)雄性小鼠附睾尾部精子，加RIPA裂解液，提取总蛋白，BCA法测定浓度。加SDS loading buffer，95℃加热5min，取20μg总蛋白进行15％ SDS-PAGE胶电泳，转膜至PVDF膜，5％脱脂奶粉室温封闭1h，加一抗4℃孵育过夜，TBST洗3×5min，二抗室温孵育1h，洗膜后采用荧光显色法显影，通过Tubulin内参蛋白和各组灰度比值表示鱼精蛋白的相对表达水平，如图2中C所示。

实验结果显示，KO组附睾尾部精子中鱼精蛋白Prm1和Prm2极显著性的低于WT组(图2中D、E，

以上实验结果说明，Fam170a在精子核变形过程中发挥着重要的作用，具体是在染色质浓缩过程中组蛋白和鱼精蛋白替换过程中发挥着重要的作用。

实施例3Fam170a在畸形精子中的转录水平和试剂盒在人畸形精子症中的应用

1、Fam170a在畸形精子中的转录水平

通过检索GEO数据库，在GEO DataSets：GSE6969中发现了运用三种不同的基因芯片探针检测正常(Normal组)和严重性或持续性畸形精子症(Teratozoospermia组)男性精液中Fam170a的转录水平，具体如下：

(1)数据分析发现Illumina Sentrix Expression(HumanRef-8)微珠芯片检测10个人类男性精子样本(4个正常男性和6个畸形精子症样本)表明，相比Normal组，Fam170a转录水平在Teratozoospermia组中显著性下降(图3中A，P＜0.01)。

(2)通过分析Illumina Sentrix Expression(Human-6)微珠芯片检测13个人类男性精子样本(5个正常男性和8个畸形精子症样本)的数据表明，与Normal组相比，Fam170a转录水平在Teratozoospermia组中极显著性下降(图3中B，P＜0.005)。

(3)通过Affymetrix U133plus2基因芯片检测21个人类男性精子样本(13个正常男性和8个畸形精子样本)的数据表明，相比Normal组，Fam170a转录水平在Teratozoospermia组中极显著性下降(如图3C，P＜0.001)。

2、Fam170a在试剂盒中的应用

利用Fam170a transcript variant 1mRNA的346-494bp基因片段设计上、下游引物，且上游引物的3’端带有生物素，下游引物的5’端带有荧光基团FITC，修饰引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体如下：

上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，具体为5’-CCAAG GGGTG GGAGA AGTTAC-生物素-3’；

下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，具体为5’-FITC-TCTCT CCTCG TTCCT GAACCTG-3’。

通过收集畸形精子症男性患者射出精子样本，采用Trizol法提取总RNA，然后通过逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。通过上述设计的引物探针试剂盒进行检测人Fam170atranscript variant 1mRNA中的346-494bp片段，其中利用荧光定量PCR仪器进行PCR反应：94℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。程序完成以后利用荧光定量PCR仪器显示的荧光值来判断各组荧光强度。

实验结果如图3中D所示，与正常组(Control)相比，三例畸形精子症患者(Sample1、2、3)的Fam170a transcript variant 1mRNA中的346-494bp基因片段极显著性的减少，近乎没有。

以上实验结果说明，畸形精子症患者中，有一大部分患者出现Fam170a mRNA显著性下降，几乎为零。结合实施例1-2中Fam170a敲除小鼠模型的实验结果，可以推测这些患者的精子在变形过程中染色质的浓缩出现异常。

需要理解的是，以上实施例给出的方案仅是为了起到说明的目的，而不是用于限制本发明。本领域技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对以上实施例进行各种修改和替换，均应属于本发明的保护范围。