一种电化学传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于电化学检测技术领域，具体涉及一种电化学传感器及其制备方法和应用。

背景技术

对乙酰氨基酚(ACOP)长期以来一直被用作解热镇痛药，常用于治疗发烧，缓解头痛、关节痛、神经痛和肌痛引起的轻度至中度疼痛。ACOP的合成中有两种主要杂质，分别为对硝基苯酚(PNP)和对氨基苯酚(PAP)。其合成原料PNP是一种高度危险的酚类物质，容易导致癌症和突变。即使在非常低的浓度下，它对人体和环境也具有很高的毒性，并且可以在环境中长时间保存而不发生降解。PAP是ACOP的合成中间体或水解代谢产物，具有显著的肾毒性和致畸性。国际食品和药物管理局规定，ACOP中PAP的允许上限为50ppm。近几十年来，已经开发了多种ACOP检测方法，包括分光光度法、色谱法、化学发光法等方法。但大多数技术耗时较久，需要非常复杂的预处理过程。然而，电化学分析方法具有制备简单、操作方便、响应快和灵敏度显著的优点。但到目前为止，很少有人致力于同时伏安法测定药物制剂或生物样品中的ACOP及其合成杂质PAP和PNP。因此，建立一种用于同时检测多种组分的低成本、高效益的电化学测量仍然是一个巨大的挑战。

碳纤维微电极(CFME)具有比表面积大、生物相容性好、电子传递性能好和尺寸极小的优点。它广泛用于检测神经递质、金属离子和体内神经化学物质监测。然而，CFME的电化学性能极其依赖于适当的传感表面修饰。纳米金由于其制备简单、电催化活性优异、比表面积大和生物相容性优异等优点，在新型电化学检测器的构建中备受关注。纳米钌具有良好的导电性，可作为电极表面快速电子转移的媒介，从而使传感器具备优异的检测灵敏度。研究表明，双金属纳米颗粒一些可能的协同效应为提高电催化性能提供了新的视角。例如，Au-Cu双金属纳米颗粒在砷(III)检测中显示出优异的抗干扰性能。

为此，如图1所示，本发明通过合成纳米钌颗粒(RuNPs)和纳米金颗粒(AuNPs)，并在CFME表面进行修饰，以开发一种有潜力的电化学传感器。得益于RuNPs和AuNPs之间的协同效应，该传感器对于同时检测ACOP、PAP和PNP具有高选择性和灵敏度。

发明内容

本发明的目的提供一种可同时或单独检测ACOP、PAP和PNP的电化学传感器。

为此，本发明提供了一种电化学传感器，包括工作电极，所述工作电极包括碳纤维微电极和沉积在所述碳纤维微电极表面的纳米颗粒；所述纳米颗粒包括纳米钌颗粒和纳米金颗粒。

本发明还提供了上述电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备纳米钌颗粒胶体和纳米金颗粒胶体备用；

(2)碳纤维微电极洗涤后，在纳米钌颗粒胶体中电泳沉积，使电极表面沉积纳米钌颗粒；

(3)彻底冲洗制备好的纳米钌颗粒/碳纤维微电极，继续在纳米金颗粒胶体中进行电泳沉积，得到纳米金颗粒/纳米钌颗粒/碳纤维微电极(AuNPs/RuNPs/CFME)电化学传感器。

具体的，上述步骤(2)中在+1.4～1.8V的纳米钌颗粒胶体中电泳沉积10～20分钟。

具体的，上述步骤(3)中在+1.4～1.8V的纳米金颗粒胶体中电泳沉积10～25分钟。

本发明还提供了利用上述电化学传感器同时或单独检测对乙酰氨基酚、对氨基苯酚和对硝基酚的方法，包括以下步骤：

(1)用缓冲液配制不同浓度的对乙酰氨基酚、对氨基苯酚和对硝基酚标准溶液；

(2)将电化学传感器的工作电极与参比电极构成双电极体系，利用电化学测量方法，将工作电极浸入各标准溶液中孵育，记录相应电流值，以标准溶液浓度和电流值分别绘制对乙酰氨基酚、对氨基苯酚和对硝基酚的浓度-电流值标准曲线；

(3)向经前处理的待测样品中加入缓冲液进行稀释，利用步骤(2)中电化学测量方法检测待测样品的电流值，根据浓度-电流值标准曲线计算得到待测样品中对乙酰氨基酚、对氨基苯酚和对硝基酚的含量。

具体的，上述缓冲液为0.05～0.2mol/LPBS缓冲液，pH为4.0～7.0。

具体的，上述参比电极为Ag/AgCl电极。

具体的，上述电化学测量方法包括循环伏安法、电化学阻抗谱法、差分脉冲伏安法。

所述循环伏安法以0.1V/s的扫描速率在0-1.0V记录CV信号；所述差分脉冲伏安法在0.1V脉冲幅度和0.005V电位阶跃下进行实验，采用的电位范围为-0.2-1.2V；所述电化学阻抗谱法在标准铁氰化钾溶液中收集EIS测量值，频率设定为0.1-100kH

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明提供的这种电化学传感器利用双金属纳米颗粒的协同电催化作用，对于检测ACOP、PAP和PNP表现出优异的灵敏度、稳定性和抗干扰性能。该电化学传感器可成功应用于人血清样品ACOP的电化学检测，回收率达95.9-100.5％，有望为ACOP的定量分析提供解决方案，在药物动力学和药理学研究中具有巨大的应用潜力。本发明提供的方法对ACOP、PAP和PNP表现出灵敏的伏安响应，线性范围宽，检测限分别为6.192nmol/L、0.13μmol/L和0.05μmol/L(S/N＝3)，具有高灵敏度、高选择性和可靠性。

以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1是CFME(A)、AuNPs和RuNPs(B)的制备以及电化学应用的代表性方案(C)示意图。

图2是不同放大倍数下RuNPs(A，B)和AuNPs(C，D)的HRTEM显微图片；RuNPs(E)和AuNPs(F)的粒径分布；RuNPs(G)和AuNPs(H)的EDS光谱(插图为各种元素的质量和原子％分布)；RuNPs(I)和AuNPs(J)的元素映射图；CFME(K)和AuNPs/RuNPs/CFME(L)的SEM显微图。

图3是采用CFME和AuNPs/RuNPs/CFME电极分别对含有0.1mol/LPBS、Tris-HCl和B-R缓冲液的10μmol/LACOP溶液进行DPV测量结果图。

图4中(A)四种不同电极在含有0.1mol/LKCl的10mmol/L[Fe(CN)

图5中(A)CFME、RuNPs/CFME、AuNPs/CFME和AuNPs/RuNPs/CFME在10μmol/LACOP中的CV曲线；(B)四种不同电极在10μmol/LPAP、ACOP和PNP中的DPV曲线；(C)RuNPs和AuNPs沉积时间对10μmol/LACOP氧化峰电流的影响；(D)10μmol/LACOP在AuNPs/RuNPs/CFME上的CV图；(E)10μmol/LACOP电流和扫描速率平方根的关系曲线；(F)10μmol/LACOP电流对数和扫描速率对数之间的校准曲线；(G)10μmol/LACOP电位与扫描速率对数之间的线性关系；(H)10μmol/LACOP在不同pH的PBS溶液中的CV曲线；(I)10μmol/LACOP峰电位和峰电流与PBS溶液pH的关系图。

图6是ACOP的氧化机理示意图。

图7中(A)AuNPs/RuNPs/CFME在10μmol/LACOP中的15次连续DPV扫描图(插图为DPV曲线的局部放大图)；(B)AuNPs/RuNPs/CFME在10μmol/LACOP中的15次连续DPV扫描峰电流；(C)AuNPs/RuNPs/CFME在10μmol/LACOP中连续10天扫描的DPV响应。

图8中(A-C)为不同浓度ACOP在AuNPs/RuNPs/CFME上的DPV曲线；(D)峰电流与ACOP浓度之间的线性关系。

图9中(A-B)不同浓度ACOP的DPV曲线(PAP和PNP浓度固定为10μmol/L)；(C)ACOP峰电流与浓度的关系；(D)不同浓度PAP的DPV曲线(含有100μmol/LACOP和10μmol/LPNP)；(E)不同浓度PNP的DPV曲线(含有100μmol/LACOP和10μmol/LPAP)；(F)不同浓度的ACOP、PAP和PNP的DPV曲线；峰电流与PAP(G)和PNP(H)浓度之间的关系；(I)峰电流与ACOP、PAP和PNP浓度之间的关系。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。

下面通过具体实施例对本发明的电化学传感器及其应用的效果进行研究。

实施例1：

本实施例提供了一种电化学传感器，通过以下方法制备。

本发明实施例中使用的对乙酰氨基酚、对氨基苯酚、对硝基苯酚和尿酸(UA)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(中国上海)；三氯化钌(RuCl

1、三磷酸钠还原RuCl

在剧烈搅拌下，将1％(w/v)RuCl

2、三磷酸钠还原HAuCl

将25.4mmol/LHAuCl

3、AuNPs/RuNPs/CFME的制备

采用现有技术制备CFME，然后，依次用乙醇和双蒸馏水洗涤CFME后，在+1.5V的RuNPs胶体中电泳沉积(EPD)15分钟，成功在电极表面沉积RuNPs颗粒。并用双蒸馏水彻底冲洗制备好的RuNPs/CFME。将其取出后，继续在+1.5V的AuNPs胶体中进行电泳沉积10分钟，得到AuNPs/RuNPs/CFME电化学传感器。

4、修饰电极的特性

采用扫描电子显微镜(SEM)(SU8010，日立，日本)和高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)(赛默飞世尔科技公司，捷克)研究了修饰材料和电极的形貌特征，结果如图2所示。TEM样品是通过将RuNPs或AuNPs胶体滴在覆盖有碳的铜显微镜网格上进行制备。

制备的RuNPs(图2A，B)和AuNPs(图2C，D)的形态在不同放大倍数下通过HRTEM进行表征。如图所示，RuNPs和AuNPs颗粒均匀分布，呈均匀球体。从HRTEM获得的粒径分布直方图(图2E，F)观察到RuNPs和AuNPs的颗粒尺寸分别为2.05±0.3nm和11.5±0.7nm。此外，通过EDS对制备的纳米颗粒(图2G-J)进行了元素分析，结果表明成功合成了RuNPs和AuNPs。

通过SEM分别对CFME和AuNPs/RuNPs/CFME电极表面进行了形态学分析。如图2K所示，CFME的表面光滑平坦，碳纤维直径仅约为7μm。而AuNPs/RuNPs/CFME的表面则明显不同。如图2L所示，许多Ru和Au纳米颗粒结合在CFME的表面上，具有轻微的积聚，表明Ru和Au纳米颗粒显著增加了传感器的比表面积。

实施例2：

在电化学分析中，支撑电解质影响电极表面反应的热力学、动力学和电荷转移速率。本实施例利用实施例1提供的电化学传感器进行实验，研究了不同的缓冲体系，以确定最佳的缓冲液支持电解质。

电化学测量在CHI660D电化学工作站(中国辰华)上进行，双电极系统包括作为工作电极(WE)的AuNPs/RuNPs/CFME和作为参比电极(RE)的Ag/AgCl电极两个部分。电化学测量方法主要包括循环伏安法(CV)、电化学阻抗谱法(EIS)和差分脉冲伏安法(DPV)等方法。其中，循环伏安法以0.1V/s的扫描速率在0-1.0V记录CV信号。DPV在0.1V脉冲幅度和0.005V电位阶跃下进行实验，采用的电位范围为-0.2-1.2V。在标准铁氰化钾溶液中收集EIS测量值，频率设定为0.1-100kH

使用0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS)、Tris盐酸盐(Tris-HCl)和Britton-Robinson(B-R)作为支持电解质，每个电化学实验重复三次。

通过CFME及AuNPs/RuNPs/CFME采用DPV分析了几种浓度均为10μmol/L的ACOP溶液，溶液分别采用0.1mol/LPBS、Tris-HCl和B-R缓冲液支持电解质配置，结果如图3所示。

从图3中观察到，在PBS缓冲体系中，CFME和AuNPs/RuNPs/CFME在ACOP溶液中具有明显的DPV响应，且AuNPs/RNPs/CFME的峰电流是裸CFME的3.027倍。因此，优选PBS缓冲溶液(0.1mol/L)作为电化学测量的最佳电解质。

实施例3：

本实施例在实施例2的基础上进一步研究了修饰材料的电化学性质、修饰电极的电化学性能及条件优化、修饰电极的稳定性和抗干扰性。

1、修饰材料的电化学性质研究

在浓度为10mmol/L[Fe(CN)

I

其中I

EIS是一种测量合成材料电解质界面电化学表面性质的方法。图4C显示了在含有0.1mol/L氯化钾的10mmol/L铁氰化钾/亚铁氰化钾中CFME、RuNPs/CFME、AuNPs/CFME和AuNPs/RuNPs/CFME的Nyquist图。实验中的频率为0.1-100kH

I

K

其中，I

2、修饰电极的电化学性能及条件优化

在pH＝4.0的PBS缓冲溶液中，四种不同电极在10μmol/LACOP中的CV曲线如图5A所示，CFME电极上获得了0.4V左右的峰电流，这归因于ACOP的氧化(5A-b)。RuNPs/CFME(5A-c)和AuNPs/CFME(5A-d)上的氧化峰电流响应比CFME的氧化峰电流响应增加。复合修饰电极AuNPs/RuNPs/CFME对ACOP表现出最佳的电流响应(5A-e)，而对支持电解质没有明显的响应(5A-a)。图5B为在相同浓度PAP和PNP的存在下，10μmol/LACOP在不同电极上的DPV曲线。ACOP、PAP和PNP在CFME上的峰电流分别约为1.036nA、1.857nA和1.370nA(5B-b)。较CFME相比，RuNPs/CFME上的峰电流分别增加为3.877nA、6.176nA和4.623nA(5B-c)。在RuNPs/CFME的基础上(5B-d)，AuNPs/RuNPs/CFME进一步改善了三种分析物的电化学响应，峰电流显著增加，增幅分别为67.1％、456.8％和111.7％(5B-e)。实验结果表明，AuNPs/RuNPs复合纳米材料具有较大的比表面体积和优异的导电性，显著增加了ACOP的富集效应和电子转移速率。

在0.1mol/LPBS(pH4.0)中，采用DPV法考查了电极电沉积时间对10μmol/LACOP氧化峰电流的影响(n＝3)。实验结果如图5C所示，随着电极在RuNPs胶体中电沉积时间的增加，DPV响应开始呈现出上升趋势，直至电流达到峰值，然后电流呈下降趋势。当电沉积时间为15分钟时，RuNPs修饰的CFME氧化峰电流达到峰值。此外，当AuNPs在RuNPs/CFME上的沉积时间达到10分钟时，可以获得最大氧化峰电流。因此，RuNPs的最佳沉积时间为15分钟，AuNPs为10分钟。

在最佳沉积时间下，在0.1mol/LPBS(pH4.0)中，采用CV法对AuNPs/RuNPs/CFME在10μmol/LACOP中的峰电流与扫描速率进行了探究，结果如图5D所示。随着扫描速率增加，氧化峰电流也相应增强，峰电位向正电势方向移动。在0.05-0.6Vs

此外，扫描速率对数与峰电位显示出良好的线性关系(图5G)，得出线性方程E

E

Slope＝2.303RT/αnF(3.5)

其中E

Γ

其中Q为电化学反应转移电荷，其他符号为常规含义。计算得不同电极的Γ

为了研究背景电解质(0.1mol/LPBS)的pH值对10μmol/LACOP氧化峰电流的影响，采用不同pH值的PBS配制10μmol/LACOP溶液，缓冲溶液的pH值为4.0至7.0。ACOP的氧化峰电位E

3、修饰电极的稳定性和抗干扰性

在支持电解质(0.1mol/LpH4.0的PBS)中，采用AuNPs/RuNPs/CFME于10μmol/LACOP进行连续15次差分脉冲扫描，结果如图7A所示。对ACOP氧化峰电流15次平行测定的相对标准偏差(RSD)0.20％(图7B)，表明制备的修饰电极稳定性良好。图7C为AuNPs/RuNPs/CFME在10μmol/LACOP溶液中连续10次连续差分脉冲伏安曲线叠加图。在第一次测定后，将电极从溶液中取出，用超纯冲洗，暴露于空气中放置1天，并再次进行相同的实验，持续10天。实验结果表明ACOP峰电流降低<5％，表明修饰电极非常稳定，重现性良好。

在优化条件下，采用DPV法考查了一些常见干扰组分对AuNPs/RuNPs/CFME测定ACOP的影响。如表1所示，添加了1mmol/L无机离子(如Na

表1干扰组分对10μmol/LACOP检测的影响(n＝3)

实施例4：

本实施例在上述实施例的基础上，研究了电化学传感器对ACOP、PAP和PNP的检测效果。

1、AuNPs/RuNPs/CFME检测ACOP

图8显示了在上述实施例得出的最佳实验条件下，不同浓度的ACOP在AuNPs/RuNPs/CFME上的DPV曲线(图8A-8C)。在0.1mol/LPBS(pH4.0)缓冲溶液中，随着ACOP溶液浓度在不断增加，峰电流值逐渐增大，且在0.04-100μmol/L浓度范围内，ACOP的氧化峰电流与其浓度呈现良好的线性关系(图8D)，线性方程如下：I

经计算，LOD和LOQ分别为6.192nmol/L和20.6nmol/L。此外，与现有技术的结果相比(表2)，该修饰电极测定ACOP具有线性范围宽、灵敏度低等特点。

表2AuNPs/RuNPs/CFME与现有ACOP检测器之间的分析性能比较

2、稳健性分析

通过改变实验参数，对分析结果的稳健性进行了验证。在10μmol/LACOP中，测量了一些最关键的程序变量，如富集电位、脉冲周期和pH值，观察其对回收率和标准偏差的影响。从表3中可以看出，这些程序变量的回收率在97.30％-104.29％之间，标准偏差小于5％，表明采用AuNPs/RuNPs/CFME测定ACOP的拟议分析方法是可靠和稳健的。

表3稳健性结果(n＝3)

3、采用AuNPs/RuNPs/CFME对ACOP、PAP和PNP进行同时/单独测定

将ACOP、PAP和PNP母液用0.1mol/LPBS(pH＝4.0)缓冲溶液分别配制成一系列梯度浓度溶液，再采用AuNPs/RuNPs/CFME进行DPV测定。在图9A-B中，将另外两种成分浓度固定，对ACOP、PAP和PNP分别进行单独检测。当PAP和PNP的浓度稳定为10μmol/L，在0.5-10μmol/L范围内，ACOP的峰电流与其浓度呈良好的线性关系，线性方程为：I

图9F为AuNPs/RuNPs/CFME在不同浓度ACOP、PAP和PNP混合物中的DPV曲线。ACOP、PAP和PNP显示出的三个分离良好的氧化峰，且峰电流随着分析物浓度的增加呈线性增加。如图9I所示，线性方程分别为：I

4、实际样品分析

将人血清样品储存在冰箱(4℃)中。先用1.5mL甲醇作为沉淀蛋白剂处理人血清样品。然后再将10mL人血清样品以3000rpm离心10分钟以消除残留的血清蛋白。过滤取上清液，用0.1mol/LPBS(pH4.0)缓冲溶液稀释。然后，将人血清样品加入适量的标准ACOP、PAP和PNP溶液，即可采用DPV法进行分析。

采用AuNPs/RuNPs/CFME对人血清样品中ACOP进行加标回收检测，实验结果如表4所示，3次平行测定的DPV峰电流相对标准偏差均小于2.39％，加标回收率在95.9％-101.9％之间，表明本发明提供的电化学传感器在临床样品中的ACOP测定中显示出潜在的应用前景。

表4采用AuNPs/RuNPs/CFME对人血清中ACOP进行DPV分析(n＝3)

以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。