一种创制四倍体鱼类育种材料的静水压方法及应用

技术领域

本发明涉及水产动物遗传育种技术领域，更具体涉及一种创制四倍体鱼类育种材料的静水压方法及应用，采用该方法可以创制出四倍体的黄鳝，为培育出具有优良性状的黄鳝养殖品种提供了重要的技术手段。

背景技术

黄鳝(Monopterusalbus)肉味鲜美，含有丰富的多不饱和脂肪酸和卵磷脂，营养价值高。但是，由于黄鳝具有雌雄同体、先雌后雄的天然性逆转特性，导致黄鳝的雌性亲本与雄性亲本发育不同步，而且雌性亲本怀卵量少，性成熟的雄性亲本奇缺，使得黄鳝种质创制新技术的研发和新品种培育极为困难。黄鳝迄今没有人工选育的优良品种，养殖所需要的苗种主要依赖于捕捞野生鳝苗，苗种来源不稳定，存活率低，种质资源也受到严重破坏，黄鳝养殖业的可持续发展迫切需要建立种质创制新技术，培育出具有优良性状的养殖品种和品系。

染色体倍性操作是进行鱼类遗传育种的重要技术。奇数的染色体组可能导致减数分裂紊乱，使性腺发育受阻，三倍体鱼通常因其性腺败育而将性腺发育所需的繁殖能量用于生长，因此三倍体鱼具有快速生长的特性，培育三倍体鱼是进行鱼类优良品种培育的重要方式。目前通常采用温度休克处理或者秋水仙素处理诱导获得三倍体鱼，但是，上述方法均无法获得100％的三倍体鱼，而且，采用人工诱导方法制备三倍体难以满足水产养殖大规模生产的需求。制备出四倍体鱼后，再与二倍体鱼进行倍间杂交，则可以培育出100％的三倍体鱼。

采用远缘杂交技术，获得了鲫鲤、鲫鲂等异源四倍体鱼(徐康等，2014)，但种间杂交获得四倍体鱼的技术仅限于部分鲤科鱼的研究报道，温度处理或静水压处理是目前创制四倍体鱼最常用的技术。采用温度冷休克法或热休克法，已有成功研制大鳞泥鳅(Misgurnus mizolepis)(Nam et al.,2001)、泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)(Fujimoto et al.,2012)、印度囊鳃鲶(heteropneustes fossilis(Bloch))(Haniffa etal.,2004)、暗斑颌须鮈(Gnathopogoncaerulescens)(Kobayashi and Fujii,2019)、高身丽脂鲤(Astyanax altiparanae)(do Nascimento et al.,2020)、革胡子鲶(Clariasgariepinus)(Okomoda et al.,2021)等四倍体材料的报道。相较于热休克法诱导，静水压法有四倍化率高，畸形率低等优点，已在多种鱼的四倍体诱导探索中取得成功。如牙鲆(Paralichthys olivaceus)受精卵在17℃水温条件下发育60min，静水压力为650kg/cm

黄鳝属于合鳃目、合鳃科、黄鳝属，具有独特的雌雄同体，先雌后雄的性逆转特性。黄鳝的人工繁育难度大，胚胎发育时间长。由于难以获得高质量的受精卵，因此，黄鳝的受精卵卵裂进程本领域技术人员一直无法清晰获知。

虽然申请人曾采用热休克法抑制黄鳝胚胎第一次卵裂，建立了有丝分裂雌核发育技术，并建立了热休克诱导黄鳝四倍体的技术。但是，热休克诱导四倍体技术的难度大，诱导产生的四倍化效率低，胚胎畸形率高，存活率低。而且，热休克诱导四倍体和静水压诱导四倍体的原理不同。温度休克诱导四倍体，是通过温度的剧烈变化破坏细胞内的酶促反应，导致细胞分裂时纺锤丝工作所需的ATP供应受阻，干扰受精卵正常的分裂过程，从而形成多倍体。而静水压是通过高强度的水压使受精卵的纺锤丝受到破坏，阻止染色体移动，从而抑制第一次卵裂。目前未见任何静水压控制黄鳝受精卵第一次卵裂进而创制四倍体的报道。

申请人经长期研究，在获得高质量的受精卵的前提下，详细的探究了黄鳝的受精卵卵裂进程，对静水压处理黄鳝受精卵的起始时间点、处理压力大小以及处理持续时间等重要参数重新进行了探索，最终获得了静水压控制受精卵第一次卵裂创制四倍体黄鳝的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种创制四倍体鱼类育种材料的静水压方法，方法简单，效率高。

本发明的另一个目的在于提供了一种创制四倍体鱼类育种材料的静水压方法的应用，利用本发明的方法，可以创制出黄鳝四倍体，为进一步培育黄鳝三倍体奠定了基础。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种创制四倍体黄鳝的静水压方法，包括下述步骤：在26-28℃水温，将受精后80～95min的黄鳝受精卵置于700-750kg/cm

以上所述的方法中，优选的，是将受精后第85min的黄鳝受精卵置于700kg/cm

以上所述的方案中，优选的，静水压处理后的受精卵按照本领域的常规方式进行孵化，孵化出膜后利用流式细胞仪和血细胞涂片筛选目标黄鳝。

静水压控制受精卵第一次卵裂创制四倍体黄鳝的方法的应用，包括利用该方法制备四倍体的黄鳝；

以上所述的应用，优选的，是将黄鳝精子与卵子混合受精后，利用本发明提供的方法抑制受精卵的第一次卵裂，从而获得四倍体黄鳝。

本发明的保护范围还包括：静水压控制受精卵第一次卵裂创制四倍体黄鳝的方法在创制三倍体黄鳝中的应用，即运用本发明建立的方法先获得四倍体鱼，再使用获得四倍体鱼与普通二倍体鱼进行倍间杂交，从而大量生产三倍体鱼。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

申请人针对目前养殖黄鳝所需要的苗种完全依赖于野生资源，迫切需要建立种质创制技术的迫切需求，本发明提供了一种采用静水压控制黄鳝受精卵的第一次卵裂，进而诱导黄鳝四倍体的技术，利用该技术可以创制出四倍体的黄鳝，方法简单，诱导效率高，为培育黄鳝优良养殖品种提供了强有力的技术手段，利用本发明的方法创制四倍体黄鳝，为进一步培育出三倍体的黄鳝奠定了基础，为培育黄鳝新品系和新品种提供了新的技术手段。

附图说明

图1黄鳝受精卵第一次卵裂完成时间鉴定示意图；

其中：A为完成第一次卵裂的胚胎比例；B、C和D分别为受精后110、120和130min的胚胎形态；B、C和D标尺均为1mm。

图2为二倍体黄鳝流式细胞仪倍性检测结果示意图。

图3为四倍体黄鳝流式细胞仪倍性检测结果示意图。

图4二倍体黄鳝血细胞形态示意图；

标尺为50μm。

图5四倍体黄鳝血细胞形态示意图；

标尺为50μm。

具体实施方式

本发明实施例所述技术方法，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

黄鳝受精卵第一次卵裂间隔完成时间的鉴定：

抑制受精卵第一次卵裂时染色体的分离，是人工诱导鱼类四倍体的关键，第一次卵裂间隔期的起始诱导时间点是重要的参数。为确定黄鳝受精卵第一次卵裂间隔完成时间，在27℃发育条件下，申请人制备了高质量受精卵，并且随机挑选了高质量受精卵30枚。从受精后开始观察胚胎发育，直到受精后100min，才观察到个别胚胎出现第一次卵裂；随后，从受精110min后开始，每5min在显微镜(Olympus，SZ61，Japan)下观察统计完成第一次卵裂的胚胎数，直到受精后130min所有胚胎均完成第一次卵裂。黄鳝胚胎在受精后110、115、120、125、130min完成第一次卵裂的胚胎比例分别为43％、67％、87％、93％、100％。

最终确认，黄鳝胚胎受精后约100min，个别胚胎出现第一次卵裂，而受精后130min为100％的黄鳝胚胎第一次卵裂间隔完成的时间。

本发明为了探索黄鳝四倍化最佳起始诱导时间，我们从确定的黄鳝胚胎完成第一次卵裂的不同时间点出发，从胚胎受精后65-100min，每5min设置一个起始处理间隔，分析各处理组的四倍化率和胚胎孵化率，进而探索四倍化诱导的最佳起始诱导时间。

同过上述对卵裂时间的摸索，结合四倍化诱导的各起始诱导时间处理组的结果，确定黄鳝四倍化理论最佳起始诱导时间为受精后78-91min。

实施例2：

一种创制四倍体黄鳝育种材料的静水压方法，包括下述步骤：

1)静水压处理控制黄鳝受精卵第一次卵裂

将受精后第85min的黄鳝受精卵(胡炜等，，2019)置于压力为700或750kg/cm

3.四倍体黄鳝的筛选

出膜后的黄鳝幼苗转移到塑料盒中养殖，塑料盒规格为40cm×20cm×10cm，投喂水蚯蚓。当幼苗生长至1个月时，转移到室外网箱中进行养殖，网箱规格为1m×1m×1m，网目大小为100目，设置水葫芦作为黄鳝的栖息地，投喂水蚯蚓和商业化的黄鳝配合饲料养殖。待黄鳝养殖到20cm左右，抽取血液，采用流式细胞仪(BD FACSVerseTMFlow Cytometer，BDBiosciences，NJ，USA)检测血细胞中的DNA含量，就可以筛选出四倍体黄鳝。出膜后四倍体黄鳝与出膜黄鳝的比例是23.33％。具体检测方法如下：

流式细胞仪分析DNA含量具体检测方法如下：

(1)取正常繁殖的黄鳝及上述静水压处理得到的黄鳝，分别抽取静脉血2-5μL于装有1mL的1×PBS溶液的1.5mL EP管中，轻轻吹打混匀；

(2)1000rpm离心15min，弃上清，加入1mL-20℃预冷70％乙醇，轻轻吹打混匀后于-20℃固定过夜；

(3)第二天，1000rpm离心15min，去上清，加入500μL碘化丙啶染色液(0.04mg/ml，PropidiumIodide(PI)，sigma)，轻轻吹打混匀；

(4)静置1小时后，经200目网片过滤，利用流式细胞仪(BD FACSVerseTM FlowCytometer，BD Biosciences，NJ，USA)检测DNA相对含量。

结果如图2与图3所示，图2与图3分别为黄鳝二倍体对照与人工诱导四倍体的流式细胞图。结果表明，图3中细胞的DNA含量是图2中的2倍。表明诱导四倍体的DNA含量是二倍体对照的2倍。

血细胞涂片鉴定成鱼细胞倍性具体检测方法如下：

(1)将16月龄黄鳝经MS-222麻醉后，使用26G采血针(华鸿，天津，中国)在尾部静脉扎破血管采血。取全血3μL置于载玻片上保持水平，另取一张载玻片与水平载玻片呈30°与血液接触，稍往后移动，即可见血液沿下边缘散开，再匀速沿载玻片平面平稳向前滑动，至血液铺完血膜为止。

(2)使用快速瑞氏染色套装(南京建成，中国)进行染色。①平置于血涂片于染色架上，滴加R1试剂一(快速瑞氏染色套装)3～5滴，使其迅速盖满血膜，染色1min左右，以固定血片。②不倒掉试剂一，直接滴加R2试剂二(快速瑞氏染色套装)6～10滴，轻摇玻片使染液充分混匀，染色8min。③水洗30s，晾干。

(3)使用显微镜拍照(Leica，Germany)，结果如图4与图5所示。然后使用ImageJ软件进行统计分析。血细胞核的各项参数如表1所示。图4图5分别为黄鳝二倍体对照与人工诱导四倍体的血细胞涂片。图4与图5的标尺分别为50μm。

表1

结果表明：由图可知，四倍体(图5)的血细胞核面积明显大于二倍体(图4)。二倍体黄鳝的血细胞核面积、核周长、核长轴及核短轴分别为6.35±0.32μm

实施例3：

不同受精时间进行静水压处理后的四倍体诱导情况：

分别将受精后第80min，85min，90min和95min的黄鳝受精卵置于压力为700kg/cm

(1)待黄鳝受精卵在室温条件下孵化8天后(心脏搏动期)，分别随机挑选以上4组黄鳝胚胎若干，显微镜下剥离卵黄，分别放置在干净培养皿中用刀片切碎，转入装有500uL1×PBS溶液的1.5mL EP管中；

(2)加入10μL胶原酶(5mg/mL，Liberase TM Research Grade，Roche)，摇床(25℃，200rpm)消化处理2h至无明显组织块；

(3)1000rpm离心15min，弃上清，加入500μL-20℃预冷70％乙醇，轻轻吹打混匀后于-20℃固定过夜；

(4)第二天，1000rpm离心15min，去上清，加入500μL碘化丙啶染色液(0.04mg/mL，Propidium Iodide(PI)，Sigma)，轻轻吹打混匀；

(5)静置1小时后，经200目网片过滤，利用流式细胞仪(BD FACSVerseTM FlowCytometer，BD Biosciences，NJ，USA)检测DNA相对含量。