用于结直肠癌检测的标志组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种疾病检测的标志组合物，具体地，涉及一种新型的用于结直肠癌早期诊断的标志组合物及其应用。

背景技术

结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)已成为世界范围内日益严峻的挑战，2022年国家癌症中心发布了最新一期的全国癌症统计数据，CRC发病率居我国第二，死亡率居我国第四。目前认为CRC多由结直肠腺瘤(ColorectalAdenoma，CRA)癌变而来，其中以绒毛状腺瘤癌变率最高，并且腺瘤越大癌变率越高。由于后期放化疗治疗生存率低，因此CRA阶段以及CRC早期阶段诊断被认为是提高结直肠癌患者生存率的有效途径。

目前已有多种方法用于CRC的检测，如粪便潜血试验(FOBT)和癌胚抗原(CEA)试验等非侵入性方法，以及结肠镜检查等侵入性检查。但由于非侵入性检查的准确性低以及侵入性检查造成的损害，这些方法的大规模应用受到限制。因此，需要一种低创、准确的CRC检测方法。代谢分子标志物是指基于一组代谢物小分子的表达水平，通过机器学习建立数学模型，用于预测临床上的具体目标。近年来代谢物分子检测手段已经相当成熟，包括液相色谱质谱联用技术(LC-MS)，气相色谱质谱联用技术(GC-MS)，以及核磁共振技术(NMR)等。

高效液相色谱(HPLC)工作原理，溶剂瓶盛放溶剂称为流动相。高压泵用于生成和计量具有特定流速的流动相，通常为数毫升/分钟。进样器能够将样品引入连续流动的流动相液流中，该流动相液流将样品带入HPLC色谱柱中。色谱柱包含实现分离所需的色谱填料。该填料被称为固定相，因为它由色谱柱硬件固定在适当位置。需要检测器来查看从HPLC色谱柱中洗脱出来的分离化合物谱带。流动相离开检测器，可根据需要送至废液或收集起来。高压管路和接头用于互连泵、进样器、色谱柱和检测器组件，以形成用于流动相、样品与所分离的化合物谱带的管道。样品进入HPLC系统后，样品中各种不同成分和色谱柱的亲和(吸附)能力不同，通过改变流动相的比例，在不同时间洗脱不同成分，实现样品的分离。

检测器连接到计算机数据工作站。现已开发出几种不同类型的检测器以应对特性差异极大的不同样品化合物。例如，如果化合物可以吸收紫外线，则使用UV吸光度检测器。如果化合物发出荧光，则使用荧光检测器。如果化合物不具备这些特性中的任一者，则使用更通用的检测器类型，例如蒸发光散射检测器。一种十分有效的方法是串联使用多个检测器。例如，UV和/或ELSD检测器可与质谱仪(MS)结合使用，以分析色谱分离的结果。这样即可通过单次进样获得更全面的分析物信息。将质谱仪与HPLC系统联用的做法称为LC-MS，联用的目的是通过LC进行分离，使得进入质谱的物质为单一物质避免相互干扰，有利于后续的鉴定。

质谱(MS)工作原理，质谱是目前广泛使用的用于进行分子定性定量的仪器，使用质谱仪测定分子的质量时必须先将分子转化为气相离子。为此，质谱仪会向分子传递电荷，并将由此产生的带电离子流转换为成比例的电流，然后通过数据系统读取该电流。数据系统将电流转换为数字信息，以质谱图的形式呈现。可以通过多种适合目标分析物的方式生成离子：将溶于基质的化合物上样至平坦表面进行激光烧蚀，例如MALDI；让化合物与高能粒子或电子相互作用，例如电子轰击电离(EI)；将电离作为传输过程本身的一部分，例如我们已经了解的电喷雾电离(ESI)技术会对液相色谱仪的洗脱液施加高电压，从而在气溶胶中生成离子。质谱仪将根据离子的质荷比(m/z)对离子进行分离、检测和测定。绘制相对离子流(信号)与m/z的关系图，生成质谱图。小分子通常只带一个电荷：因此m/z是质量(m)除以1的值。(“1”代表电离过程中添加的质子表示为[M+H]

随着代谢物分子检测技术的发展，越来越多的代谢分子标志物被发现，以用于结直肠癌的早期诊断。研究表明应用不同代谢分子标志物能够对结直肠癌发生发展提供早期诊断方向，但是如何找到一组用于结直肠癌早期诊断的代谢分子标志物组合，以及优化的数学模型用于预测，并能达到良好效果，已知的研究较少。因此，选用合理的方式筛选出相关代谢分子标志物，明确结直肠癌的潜在分子机制，能够为早期和精确的预防、诊断和治疗结直肠癌提供方向，进一步提高结直肠癌患者的临床诊断效率和判断能力。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型的用于结直肠癌早期诊断的模型及其应用，以克服目前本领域存在的上述技术问题。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

本发明的第一方面提供了一种用于结直肠癌预后预测和诊断的相关标志物组合。

进一步，所述代谢标志物组合包括月桂酸(Dodecanoic acid)，硬酯酸(Stearicacid)，磷脂酰胆碱(16:0/9:0(CHO))(PC(16:0/9:0(CHO)))，硫酸脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone sulfate)，癸酸(Capric acid)，尿酸(Uric Acid)，酰基肉碱(9:1)(ACar(9:1))，丙酮酸(Pyruvic acid)，假尿嘧啶核苷(Pseudouridine)，L-乙酰基肉碱(L-Acetylcarnitine)，磷脂酰肌醇(18:0/22:6)(PI(18:0/22:6))，大蒜吡喃酮(Allixin)。

本发明公开了一种用于结直肠癌检测的标志组合物，所述标志组合物包括：Dodecanoic acid，Dehydroepiandrosterone sulfate，Capric acid，Uric Acid。

优选的，所述标志组合物进一步选自Stearic acid，Pyruvic acid，Pseudouridine，L-Acetylcarnitine中的一种或几种。

优选的，所述标志组合物包括：Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、L-Acetylcarnitine。

优选的，所述标志组合物包括：Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pseudouridine。

优选的，所述标志组合物包括Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pyruvic acid。

优选的，所述标志组合物包括：Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pseudouridine、L-Acetylcarnitine。

优选的，所述标志组合物包括：Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pyruvic acid、L-Acetylcarnitine。

优选的，所述标志组合物包括：Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pyruvic acid、Pseudouridine。

优选的，所述标志组合物包括：Dodecanoic acid，Dehydroepiandrosteronesulfate，Capric acid，Uric Acid，Stearic acid，Pyruvic acid，Pseudouridine，L-Acetylcarnitine。

优选的，所述标志组合物由Dodecanoic acid，Dehydroepiandrosteronesulfate，Capric acid，Uric Acid，Stearic acid，Pyruvic acid，Pseudouridine，L-Acetylcarnitine组成。

本发明公开了所述的标志组合物在制备用于检测结直肠癌的试剂中的用途。

本发明公开了所述的标志组合物在制备用于检测结直肠癌的试剂盒中的用途。

优选的，所述试剂盒的检测样本为血液。

本发明公开了一种检测结直肠癌的试剂盒，所述试剂盒包含所述的标志组合物。

优选的，所述试剂盒进一步包括标准品。

本发明另一个方面提供了一种结直肠癌预后预测的风险评估模型的构建方法，所述构建方法包括如下步骤

(1)候选代谢物分析：通过LC-MS检测得到样本所含总代谢物。再基于上述1026个代谢物通过P值筛选，以及与临床指标(年龄，性别，BMI指数等)进行关联分析后，筛选得到代谢物指标。

(2)建立模型：利用LASSO Cox分析步骤(1)获得的总代谢物，最终确定组成早期诊断代谢物所述模型。

本发明基于LC-MS的代谢组学检测分析，筛选获得与结直肠癌相关的代谢物。

本发明通过P值筛选，以及与年龄，性别，BMI指数等临床指标进行关联分析后，筛选得到118个候选代谢标志物，结合LASSO模型分析以及充分考虑原始质谱数据，标志物在样品中的响应信号情况，背景含量的高低，以及标准品的获得难易程度，筛选得到多种代谢物标志物的组合。

本发明提供了一种新型的用于结直肠癌早期诊断的模型，并且通过结直肠癌患者的多个测试数据集证实了该模型的稳定有效性，该模型为结直肠癌患者的评估提供了可靠的预后预测和诊断标志物，提高了对结直肠癌患者早期诊断的评估预测能力，对具有高风险结直肠癌患者能够有效的识别，并且在临床中能够早期监控和有效干预，以此来降低结直肠癌患者发生率及死亡率，该模型在临床上应用前景广阔。

附图说明

图1.血浆中与结直肠癌相关的代谢分子标志物的筛选流程示意图。

图2.实测代谢物母离子及子离子(上部分)与数据库中母离子及子离子(下部分)对比示意图。

图3.训练集通过LASSO模型筛选获得的12种代谢物的ROC曲线图，CRAVS NC组。

图4.训练集通过LASSO模型筛选获得的12种代谢物的ROC曲线图，CRC VS NC组。

图5.训练集通过LASSO模型筛选获得的12种代谢物的ROC曲线图，CRC VS CRA组。

图6.训练集8种代谢物组合的ROC曲线图(CRA组VS NC组)。

图7.训练集8种代谢物组合的ROC曲线图(CRC组VS NC组)。

图8.训练集8种代谢物组合的ROC曲线图(CRC组VS CRA组)。

图9.代谢物Acetylcarnitine标准品母离子及子离子(左侧)与实测数据母离子及子离子(右侧)对比图。

图10.代谢物Dodecanoic acid标准品母离子及子离子(左侧)与实测数据母离子及子离子(右侧)对比图。

图11.代谢物Dehydroepiandrosterone sulfate标准品母离子及子离子(左侧)与实测数据母离子及子离子(右侧)对比图。

图12.代谢物Capric acid标准品母离子及子离子(左侧)与实测数据母离子及子离子(右侧)对比图。

图13.代谢物Uric acid标准品母离子及子离子(左侧)与实测数据母离子及子离子(右侧)对比图。

图14.代谢物Pyruvic acid标准品母离子及子离子(左侧)与实测数据母离子及子离子(右侧)对比图。

图15.代谢物Pseudouridine标准品母离子及子离子(左侧)与实测数据母离子及子离子(右侧)对比图。

图16.代谢物Stearic acid标准品母离子及子离子(左侧)与实测数据母离子及子离子(右侧)对比图。

图17.训练集7种组合物(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pyruvic acid、L-Acetylcarnitine)对应的ROC曲线(CRA组VS NC组)。

图18.训练集7种组合物(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pseudouridine、L-Acetylcarnitine对应的ROC曲线(CRA组VS NC组)。

图19.训练集7种组合物(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pyruvic acid、Pseudouridine)对应的ROC曲线(CRA组VS NC组)。

图20.训练集6种组合物(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pseudouridine)对应的ROC曲线(CRA组VS NC组)。

图21.训练集6种组合物(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、L-Acetylcarnitine)对应的ROC曲线(CRA组VS NC组)。

图22.训练集6种组合物(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pyruvic acid)对应的ROC曲线(CRA组VS NC组)。

图23.训练集4种组合物(Dodecanoic acid，Dehydroepiandrosterone sulfate，Capric acid，Uric Acid)的ROC曲线图，CRA VS NC组。

图24.训练集4种组合物(Dodecanoic acid，Dehydroepiandrosterone sulfate，Capric acid，Uric Acid)的ROC曲线图，CRC VS NC组。

图25.训练集4种组合物(Dodecanoic acid，Dehydroepiandrosterone sulfate，Capric acid，Uric Acid)的ROC曲线图，CRC VS CRA组。

图26.验证集7种组合物(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pyruvic acid、L-Acetylcarnitine)对应的ROC曲线(CRA组VS NC组)。

图27.验证集7种组合物(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pseudouridine、L-Acetylcarnitine)对应的ROC曲线(CRA组VS NC组)。

图28.验证集7种组合物(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pyruvic acid、Pseudouridine)对应的ROC曲线(CRA组VS NC组)。

图29.验证集6种组合物(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pseudouridine)对应的ROC曲线(CRA组VS NC组)。

图30.验证集6种组合物(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、L-Acetylcarnitine)对应的ROC曲线(CRA组VS NC组)。

图31.验证集6种组合物(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pyruvic acid)的ROC曲线(CRA组VS NC组)。

图32.验证集4种组合物(Dodecanoic acid，Dehydroepiandrosterone sulfate，Capric acid，Uric Acid)的ROC曲线图，CRAVS NC组。

图33.验证集4种组合物(Dodecanoic acid，Dehydroepiandrosterone sulfate，Capric acid，Uric Acid)的ROC曲线图，CRC VS NC组。

图34.验证集4种组合物(Dodecanoic acid，Dehydroepiandrosterone sulfate，Capric acid，Uric Acid)的ROC曲线图，CRC VS CRA组。

图35.训练集中8种组合物(Dodecanoic acid，Stearic acid，Dehydroepiandrosterone sulfate，Capric acid，Uric Acid，Pyruvic acid，Pseudouridine，L-Acetylcarnitine)在验证集中对应的ROC曲线，CRAVS NC组。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例1与结直肠癌相关的代谢分子标志物的筛选以及结直肠癌早期预测和诊断的评估模型的建立

血浆是目前能便利获取且低创伤的检测材料。通过大规模人群队列的血浆代谢组学实验检测和数据分析，在结直肠癌和腺瘤患者中筛选并鉴定了一组血浆代谢物，作为CRC早期筛查的指标。结直肠癌和腺瘤患者中筛选并鉴定了一组血浆代谢物详细步骤。样本选择为人血浆样本，共三组，分别为正常组(NC组)，早期腺瘤组(CRA组)和结直肠癌组(CRC组)，各组对应的生物学重复分别为77例，81例和65例，进行基于LC-MS的代谢组学检测分析，共计223例样本。

筛选标志物的主要操作流程示意图参见附图1。试验流程如下：

A样本信息

人血浆样本，共三组，分别为正常组(NC组)，早期腺瘤组(CRA组)和结直肠癌组(CRC组)，各组对应的生物学重复分别为77例，81例和65例，进行基于LC-MS的代谢组学检测分析，共计223例样本。

B样本前处理步骤过程

(1)移取100μL样品至EP管中，加入300μL提取液(甲醇，含同位素标记内标混合物)，涡旋混匀30s；

(2)超声10min(冰水浴)；

(3)-40℃静置1h；

(4)将样品4℃，12000rpm(离心力13800(×g)，半径8.6cm)离心15min；

(5)取上清于进样瓶中上机检测，所有样品另取等量上清混合成QC样品上机检测。

C上机检测参数

色谱参数如下：

本项目使用Vanquish(Thermo Fisher Scientific)超高效液相色谱仪，通过Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为水相，含5mmol/L乙酸铵和5mmol/L乙酸，B相为乙腈。样品盘温度：4℃，进样体积：2μL。

质谱参数如下：

Orbitrap Exploris 120质谱仪能够在控制软件(Xcalibur，版本：4.4，Thermo)控制下进行一级、二级质谱数据采集。详细参数：Sheath gas flow rate:50Arb，Aux gasflow rate:15Arb，Capillary temperature:320℃，Full ms resolution:60000，MS/MSresolution:15000，Collision energy:10/30/60in NCE mode，Spray Voltage:3.8kV(positive)或-3.4kV(negative)。

D质谱下机数据处理分析过程

原始数据经ProteoWizard软件转成mzXML格式后，使用自主编写的R程序包(内核为XCMS)进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与BiotreeDB(V2.1)自建二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的Cutoff值设为0.3。通过此步骤在所有样本中鉴定出1026个代谢物。

检测数据和质谱数据库的比对，下图示2为某一物质匹配结果，其它1025个代谢物均通过相同方式进行鉴定。图中上半部分为实测的代谢物的母离子及子离子碎片，下半部分为公共数据库利用高纯度标准品在质谱上实测的母离子及子离子碎片。(参见附图2)母离子及子离子完全和数据库匹配即可鉴定为对应的代谢物。

E结直肠癌预后预测和诊断的评估模型的建立

基于上述1026个代谢物通过P值筛选，以及与临床指标(年龄，性别，BMI指数等)进行关联分析后，筛选得到118个代谢物指标。这118个代谢物的名称如下：

Dodecanoic acid，FA(16:0)，FA(16:1)，FA(16:4)，FA(17:2)，FA(17:3)，FA(18:1)，FA(18:2)，FA(18:4)，FA(19:2)，FA(20:3)，FA(20:4)，FA(20:5)，FA(21:4)，FA(21:5)，FA(22:2)，FA(22:4)，FA(22:5)，Glucosyl passiflorate，Quercetin3-(6-[4-glucosyl-p-coumaryl]glucosyl)(1->2)-rhamnoside，Oleic acid，Isopalmitic acid，Stearic acid，Myristic acid，Eicosadienoic acid，Palmitoleic acid，PI(20:4/20:4)，SHexCer(d28:1)，PC(16:0/9:0(CHO))，Undecanoic Acid，Pseudouridine，Palmitic acid，alpha-Linolenic acid，Dehydroepiandrosterone sulfate，Mizolastine，Adrenic acid，Capricacid，3b，6a-Dihydroxy-alpha-ionol 9-[apiosyl-(1->6)-glucoside]，9-OxoODE，Eicosapentaenoic acid，Methylmalonic acid，Linoleic acid，Uric Acid，ACar(9:1)，Ricinoleic acid，Myzodendrone，Prostaglandin B1，Ruscogenin，8，11，14-Eicosatrienoic acid，Pyruvic acid，Stearidonic acid，Lansiumamide C，Biliverdin，13-L-Hydroperoxylinoleic acid，Dioscorine，Sphinganine，Dibutyl phthalate，Isoscoparin 2”-(6-(E)-feruloylglucoside)4'-glucoside，FAHFA(22:5/22:3)，10E，12Z-Octadecadienoic acid，2，6-Di-tert-butyl-4-methylphenol，12-Oxo-2，3-dinor-10，15-phytodienoic acid，2-(5-Methyl-2-furanyl)-3-piperidinol，Hydroxypyruvicacid，FAHFA(16:1/22:3)，Nordihydrocapsaicin，Thromboxane B3，FAHFA(18:1/18:0)，5，7-Dihydro-2-methylthieno[3，4-d]pyrimidine，N-Acetyl-2，6-diethylaniline，PC(8:0/8:0)，Methyl(3x，10R)-dihydroxy-11-dodecene-6，8-diynoate 10-glucoside，FAHFA(16:1/18:3)，PC(16:2e/4:0)，12-Hydroxydodecanoic acid，5-Methoxytryptamine，SakacinP，Lauroyl diethanolamide，PI(18:1/18:1)，Sphingosine 1-phosphate，L-Acetylcarnitine，Dulxanthone E，Citric acid，Paradol，Ganoderiol B，MG(18:2(9Z，12Z)/0:0/0:0)，PA(8:0/8:0)，(2R，3R)-2，3-Butanediol，Heptanoic acid，PhenylpyruvicAcid，Hoduloside VI，1，2，3，4，Tetrahydro-1，5，7-trimethylnapthalene，L-AsparticAcid，SQDG(16:4/16:4)，AcylGlcADG(16:0/16:0/20:1)，PI(16:0/18:2)，PI(16:0/20:4)，Pelargonic acid，2-Hydroxybutyric acid，Succinic acid semialdehyde，Resveratrol，FAHFA(16:1/16:0)，TAG(12:2/16:5/16:5)，FAHFA(20:2/18:0)，4-(4-Methyl-3-pentenyl)-3-cyclohexene-1-carboxaldehyde，1-Hydroxy-3，6，7-trimethoxy-2-(3-methyl-2-butenyl)-8-(3-hydroxy-3-methyl-1E-butenyl)-xanthone，PI(18:0/22:6)，HBMP(16:1/16:1/20:0)，alpha-Peroxyachifolide，OxPI(16:0/18:1+3O)，(2'E，4'Z，7'Z，8E)-Colnelenic acid，PC(16:3/26:4)，Allixin，Ginsenoyne B，Alpha-dimorphecolicacid，4-Trimethylammoniobutanoic acid，BLV，(4-Hydroxybenzoyl)choline。

实施例2通过LASSO模型筛选得到由12个物质组成的早期诊断模型

最终通过LASSO模型，筛选得到12个代谢物。从候选代谢物(118个)中筛选出对早期诊断贡献最大的代谢物，组成最佳模型，最终在惩罚参数λ最小值0.01464075处得到一个由12个物质组成的早期诊断模型，这12种代谢物质为月桂酸(Dodecanoic acid)，硬酯酸(Stearic acid)，磷脂酰胆碱(16:0/9:0(CHO))(PC(16:0/9:0(CHO)))，硫酸脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone sulfate)，癸酸(Capric acid)，尿酸(Uric Acid)，酰基肉碱(9:1)(ACar(9:1))，丙酮酸(Pyruvic acid)，假尿嘧啶核苷(Pseudouridine)，L-乙酰基肉碱(L-Acetylcarnitine)，磷脂酰肌醇(18:0/22:6)(PI(18:0/22:6))，大蒜吡喃酮(Allixin)。

用这12个代谢物构建一个多因素Cox回归模型，得到每一个物质的回归系数，利用回归系数和代谢物的含量，计算得到每个病人的风险评分，具体公式为：

Y＝-0.052+0.15*ACar(9:1)-0.21*Stearic acid-0.049*Allixin-0.095*Capric

acid-0.10*Dehydroepiandrosterone sulfate-0.21*Dodecanoic acid+-0.19*Pyruvic

acid+0.64*Pseudouridine-0.21*L-Acetylcarnitine+0.29*PI(18:0/22:6)-0.50*PC(16:0/9:0(CHO))+0.14*Uric Acid。

基于实施例1中的223例样本，通过数据分析，比较CRC组，NC组和CRA组的代谢物差异，选择了12个代谢物作为预测指标。如下图所示，ROC曲线的AUC值均大于0.8，说明预测指标构建的模型具有较高的可信度。12个代谢物的ROC曲线图参见附图3-图5。

实施例3代谢物的标准品鉴定

在获得的12种代谢标志物的基础上，通过核实原始质谱数据，充分考虑它们在样品中的响应信号情况，背景含量的高低，以及标准品的获得难易程度。进一步选择其中的8种不同的代谢物组合。这8种代谢物质为月桂酸(Dodecanoic acid)，硬脂酸(Stearicacid)，硫酸脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone sulfate)，癸酸(Capric acid)，尿酸(Uric Acid)，丙酮酸(Pyruvic acid)，假尿嘧啶核苷(Pseudouridine)，L-乙酰基肉碱(L-Acetylcarnitine)。进一步采用这8个代谢物在检测样本中的数据通过加载R语言(V4.1.2)的PROC包，获得的ROC曲线图如图6-图8所示。

在匹配数据库的初步鉴定后，对于最终建立模型的代谢物进行了标准品鉴定。即购买高纯度化学品，采用与采集数据完全相同的方法和仪器进行检测，并比对人血液LC-MS数据(包含保留时间，母离子及子离子质荷比)实现准确鉴定。鉴定图谱如下(图9-图16),其中左侧为标准品谱图(左上为色谱峰，代表保留时间；左下为质谱峰，代表母离子和子离子碎片)，右侧为人血液谱图(右上为色谱峰，代表保留时间；右下为质谱峰，代表母离子和子离子碎片)。比对后确认8个代谢物完全匹配。

实施例4不同种代谢物组合作为患病风险预测指标的评估情况

在确定的8种代谢物标志物的基础上，从中选7个或者6个再次建模，其中大部分的组合的AUC值仍然能够达到0.8以上，表明这些组合仍然具有很高的对CRC的风险评估价值。

其中，7种代谢物组合建模的AUC测定值如下表1。

表1：训练集7种代谢物组合建模的AUC测定(CRAVSNC组)

表1中7种组合物对应的ROC曲线参见图17-图19。

另外，6种代谢物组合建模的AUC测定值如下表2。

表2：训练集6种代谢物组合建模的AUC测定(CRAVSNC组)

表2中6种组合物对应的ROC曲线参见图20-图22。

进一步选择上述7组以及6组中均包含的4种物质组合物(Dodecanoic acid，Dehydroepiandrosterone sulfate，Capric acid，Uric Acid)建模，进行ROC曲线分析，结果参见图23-图25。

实施例5训练集中获得的代谢物组合作为预测指标在验证集中的患病风险评估情况

为验证在训练集中获得的代谢物组合，重新采集人血液样本并进行分组，分别为正常组(NC组)，早期腺瘤组(CRA组)和结直肠癌组(CRC组)，各组对应的生物学重复分别为52例，54例和44例，共计150例样本。

按照实施例1的方法进行基于LC-MS的代谢组学检测分析。并用训练集中获得的代谢物组合进行ROC验证，得到结果与训练集中一致，具有较高的指示作用。其中，训练集7种组合物的三种组合(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pyruvic acid、L-Acetylcarnitine)、(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pseudouridine、L-Acetylcarnitine)、(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pyruvic acid、Pseudouridine)在验证集中对应的ROC曲线参见图26-图28；训练集6种组合物的三种组合(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、UricAcid、Pseudouridine)、(Dodecanoic acid、Stearic acid、Dehydroepiandrosteronesulfate、Capric acid、Uric Acid、L-Acetylcarnitine)、(Dodecanoic acid、Stearicacid、Dehydroepiandrosterone sulfate、Capric acid、Uric Acid、Pyruvic acid)在验证集中对应的ROC曲线参见图29-图31，训练集中4种组合物(Dodecanoic acid，Dehydroepiandrosterone sulfate，Capric acid，Uric Acid)在验证集中对应的ROC曲线参见图32-图34；训练集中8种组合物(Dodecanoic acid，Stearic acid，Dehydroepiandrosterone sulfate，Capric acid，Uric Acid，Pyruvic acid，Pseudouridine，L-Acetylcarnitine)在验证集中对应的ROC曲线CRA VS NC组参见图35；。

本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。