一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌及其应用。

背景技术

烟草花叶病毒，简称TMV，为RNA病毒，是烟草花叶病等的病原体，是烟草生产上分布最广、发生最为普遍的一类病害，对烟草的危害极大。烟草花叶病毒侵染烟草植株后，会破坏植株的组织结构，对嫩叶的破坏力度最大，使嫩叶出现明脉症状，即叶片侧脉及支脉组织出现半透明的现象，烟草花叶病毒在烟草细胞中大量繁殖，病毒RNA会严重影响烟草细胞的正常分裂，导致烟草叶肉细胞畸形裂变，部分烟草叶片大量繁殖或者受抑制，出现叶片厚度不均匀的症状，叶片出现斑点，呈现出黄绿相间的不同区域，随着花叶病毒的进一步侵染，逐步导致叶片组织坏死，烟草叶片出现大面积的褐色坏死斑，叶片形状扭曲、皱缩，这种现象在老叶片上尤为明显，重病的叶片凸起形成泡状，边缘向内弯曲。早期发病的烟草植株，严重矮化，烟草植株不能正常生长，在成熟期不能正常的开花结果，抵抗能力很差，容易受到外界的干扰，叶片和花果容易脱落，种子量少，一般不能正常发芽生长。

发明内容

本发明提供了一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，命名为KBD-5，该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26146，保藏日为2022年11月14日。

上述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5对烟草花叶病毒具有优异的抑制活性，因此，可将其应用于由烟草花叶病毒引起的植物性病害的预防和/或治疗，具体地，可将上述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5制备成微生物制剂，以预防和/或治疗由烟草花叶病毒引起的植物性病害，例如烟草花叶病。

本发明提供了一种微生物制剂，含有上述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5。

在对纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5的研究中，我们发现，KBD-5对硒元素具有较强的还原和转化能力，其可以将无机硒转化为硒单质。为此，本发明还提供了上述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5在无机硒还原或硒单质制备中的应用。

本发明提供了一种纳米硒活性菌液的制备方法，步骤如下：

将上述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5菌液接种于含无机硒的培养基中，在适宜的条件下培养，至菌液中富集有红色物质，无机硒被还原为红色单质纳米硒，稀释菌液，获得纳米硒活性菌液。

上述纳米硒活性菌液的制备方法中，纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5菌液的接种量为1％，其中，菌液中纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5的含量≥10

上述纳米硒活性菌液的制备方法中，培养基可选自液体培养基，例如LB液体培养基等。

在本发明中，适宜纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5生长和繁殖的温度条件为28～37℃，优选为30℃。在培养过程中，也可选择震荡培养，振荡速率应当适宜纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5，例如可以是150rpm。

具体地，所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5菌液可由如下方法制备而成：

将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5菌株接种到LB固体培养基上进行纯化，挑取生长良好的单一菌落接种于LB液体培养基中，在30℃、150rpm条件下振荡培养，得到纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5发酵菌液。

上述纳米硒活性菌液的制备方法中，菌液的稀释按需求进行稀释即可。

本发明提供了一种纳米硒的制备方法，步骤如下：

将上述纳米硒活性菌液离心，沉淀为菌体和纳米硒的混合物；向沉淀中加入溶菌酶，充分孵育；然后置于冰上超声；将超声后的溶液离心，弃去菌体沉淀，回收上清；将上清离心，弃上清，洗涤沉淀，获得纳米硒。

由上述方法制备的纳米硒或纳米硒活性菌液，可用于作物的富硒种植。

在本发明中，无机硒包括但不限于硒酸盐、亚硒酸盐、氧化硒中的一种或几种，其具体可以是硒酸钠、亚硒酸钠等。

在对纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5的研究中，我们还发现，KBD-5能够显著促进植物的生长和发育，为此，本发明还提供了上述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5在促进植物生长发育中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5，其对烟草花叶病毒具有优异的抑制活性，且具有较好的无机硒还原能力，同时还能够促进植物的生长发育，因此，可将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌KBD-5制备成菌剂或者纳米硒活性菌液，用于植物抗病性研究，具有显著的应用价值。

附图说明

图1为KBD-5发酵菌液对TMV的枯斑抑制效果图；其中，每片叶的左侧为KBD-5发酵菌液处理组，右侧为对照组；

图2为KBD-5发酵菌液对本氏烟的促生效果图；其中，长势较大的为KBD-5发酵菌液处理组，长势较小的为对照组；

图3为亚硒酸钠被还原为红色单质纳米硒。

具体实施方式

本发明所述的KBD-5菌株，是从保山腾冲温泉泥土样中分离得到的，经鉴定，为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26146，保藏日为2022年11月14日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株的培养条件为30℃，LB培养基，pH＝7.0。

本发明中所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

菌种的分离、纯化与鉴定：

从保山腾冲温泉泥土中采集土壤样品，称取2g采集的土样，加入20mL ddH

参照试剂盒说明书进行DNA提取、PCR扩增，由青岛派森诺基因生物技术有限公司进行16S rDNA测序。

测序结果为：

TCGTGCGCTCAATCGAACCAAGGAAGACCTTGCTCCTTTGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTACCTTATAGTTTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGAATAATCTGTTTCACCTCATGGTGAAATATTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCGCTATAGGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGATTTCGGTTCGTAAAACTCTGTTGTAAGGGAAGAACAAGTACAGTAGTAACTGGCTGTACCTTGACGGTACCTTATTAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGATAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTATCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGTTGACCACTGTAGAGATATGGTTTCCCCTTCGGGGGCAACGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGATACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGAGGGAGCTAATCCGATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCAGATTTCACGTGAGTCAGAGCTAGCAAGCTATCGAGAGAGAGCGATCATCAGTCA

通过NCBI网站上的BLAST程序，将测定的序列与GenBank中的序列比对，相似度是99.93％。最终鉴定为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)，命名为KBD-5。该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.26146，保藏日为2022年11月14日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2

烟草花叶病毒抑制试验：

采用半叶法进行试验。挑选生长良好的单一KBD-5菌落接种于LB液体培养基中，在30℃、150rpm条件下振荡培养20h，得到KBD-5发酵菌液。取10mL KBD-5发酵菌液(浓度为10

试验结果如表1和图1所示：

表1 KBD-5发酵菌液对TMV的钝化效果

由图1可知，KBD-5发酵菌液对TMV具有较好的钝化效果，结合表1中的数据可知，KBD-5发酵菌液对TMV的抑制率高达95.14％，效果非常显著。

实施例3

对剪叶机械的消毒作用：

取新鲜TMV病叶3～5片，用剪刀反复多次剪切病叶，然后将感染TMV的剪刀分别在稀释200倍、400倍、600倍的KBD-5发酵菌液(浓度为10

计算公式为：

发病率(％)＝100×发病株数/调查总株数；

病情指数＝100×(∑各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)；

控制效果(％)＝100×(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数。

试验结果如表2所示：

表2KBD-5发酵菌液对污染剪刀中TMV的钝化效果

由表2可知，剪刀经清水浸泡处理的对照组，其TMV发病率为45％左右，而剪刀经过不同稀释倍数的KBD-5发酵菌液处理后，在一定程度上抑制了烟草花叶病的发生，相对防效达58.08～100％。随着KBD-5发酵菌液处理浓度升高，或处理时间延长，TMV发病率显著下降，防治效果明显增加。剪刀经稀释200倍的KBD-5发酵菌液浸泡，当浸泡时间不少于1min时，其对TMV即可达到非常优异的钝化效果，防治效果高达100％。

实施例4

生长发育促进试验：

将2～3叶期本氏烟移栽至一次性水杯中，移栽前将烟苗根部浸泡在KBD-5菌液(浓度为1×10

试验结果如表3和图2所示：

表3 KBD-5发酵菌液灌根对本氏烟的促生作用

由图2可知，经KBD-5菌悬液灌根的本氏烟苗，其生长发育较对照组相比，具有明显改观。结合表3中的数据可知，与对照相比，本氏烟株高、最大叶长、最大叶宽的增长率分别为16.76％、44.66％、49.44％。上述结果表明，KBD-5发酵菌液可以有效促进植物株高的生长，增加叶片表面积。

实施例5

无机硒还原试验：

由于亚硒酸盐的还原伴随着红色单质硒的生成，因此，采用肉眼观察法对产硒菌株进行初步的定性判定。具体如下：

将KBD-5菌株接种到LB固体培养基上进行纯化，挑取生长良好的单一菌落接种至含1mM亚硒酸钠的LB固体培养基中，在30℃条件下倒置培养。

试验结果如图3所示：

在培养2～3d后，培养基中观察到红色菌落。这表明，KBD-5菌株将亚硒酸钠还原为红色单质纳米硒。

实施例6

纳米硒的制备：

按1％接种量将KBD-5菌液接种至含1mM亚硒酸钠的LB液体培养基中，在30℃、150rpm条件下振荡培养2～5d，获得纳米硒活性菌液。将纳米硒活性菌液在13000×g条件下离心10min，沉淀为菌体和纳米硒的混合物。向沉淀中加入溶菌酶，使其终浓度为20mg/mL，37℃孵育20min，孵育期间每隔5min取出上下颠倒几次，使溶液充分混匀。然后置于冰上超声30min(超声30s，停40s)。将超声后的溶液在6000×g条件下离心10min，弃去菌体沉淀，回收上清。将上清在13000×g条件下离心10min，弃上清，沉淀用超纯水溶解洗涤两次后获得纳米硒。

应用例1

按1％接种量将KBD-5菌液接种至含1mM亚硒酸钠的LB液体培养基中，在30℃、150rpm条件下振荡培养2～5d，获得红色纳米硒活性菌液，然后用水稀释，制成纳米硒活性菌液(硒含量60mg/L、菌浓度≥10

于2022年5月至2022年7月，在中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地大棚中进行小区试验，期间按照常规管理方法进行田间管理。设置2个小区，每个小区长5m，宽1.5m，2个小区间距为0.3m，每个小区四周用水泥砖隔开。按常规方式添加基肥，取生长一致健壮的番茄幼苗移栽至试验小区中，每个小区种植20株，分两列种植。其中一个小区于番茄的苗期和果实膨大两个时期(约为移栽10d和1个月后)喷施纳米硒活性菌液(稀释30倍)，另一小区喷施清水作为对照。每个处理作3次重复，随机区组分布。番茄成熟后，每个处理均整株采样，以便计算各处理组的总产量。每个处理从不同植株中随机选取10颗番茄果实，带回实验室后用蒸馏水冲洗3～4次，在常温下干燥除去表面水分，称量样品鲜重。依据GB5009.93-2010《食品安全国家标准食品中硒的测定》，采用氢化物-原子荧光光谱法(HG-AFS法)测定番茄中的硒含量。

试验结果如表4所示：

表4 KBD-5发酵菌液对番茄产量和硒含量的影响

由表4可知，与对照组相比，喷施纳米硒活性菌液后，番茄产量有所提升，且番茄中硒含量大幅提高，达到国家规定的富硒标准。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。