草豆蔻提取物的制备方法及其在抑制单增李斯特菌中的应用

技术领域

本发明涉及植物提取物领域，特别涉及草豆蔻提取物的制备方法及其在抑制单增李斯特菌中的应用。

背景技术

植物提取物作为一种天然、无危害的抑菌、抗氧化剂原材料，近年来受到广泛学者的关注。通过对植物提取物的抑菌活性研究，寻找具备良好抑菌活性的植物提取物，有利于在抑菌产品中的广泛应用。

草豆蔻始载于汉代《名医别录》，列为上品。别名漏蔻、草蔻、大草蔻、偶子、草飞雷子、弯子等。据《中华人民共和国药典》(2020版一部)记载，草豆蔻为姜科植物草豆蔻Alpinia katsumadai Hayata的干燥近成熟种子。性辛，温。归脾、胃经。具有燥湿行气，温中止呕的功效，用于治疗寒湿内阻，脘腹胀满冷痛，暧气呕逆，不思饮食。

现有研究表明，草豆蔻中含有的黄酮和双苯庚酮类化合物，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌、产气杆菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜麦芽假单胞菌、洋葱假单胞菌等革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有不同程度的抑制作用(黄文哲等)，其中，豆蔻明、乔松素、反,反-1,7-二苯基-4,6-庚二烯-3-酮和山姜素是草豆蔻的抑菌活性成分。同时，草豆蔻提取物具有抗弯曲杆菌活性，且具有抗修饰活性，表明至少有两个抑制系统与草豆蔻提取物抗菌活性有关(A.Klancnik等)，草豆蔻抗菌的活性物质还可用于奶牛乳腺炎等感染性疾病(彭芙等)。

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，简称单增李斯特菌，是一种人畜共患病的病原菌，其广泛存在于自然界中，并通过口腔或粪便的途径传播疾病。新生儿、孕妇及老人易受到单增李斯特菌的感染，孕妇受到感染后，可能会流产、早产或死胎，老人受到感染，可能会患上败血症、脑炎或脑膜炎。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提出草豆蔻提取物的制备方法及其在抑制单增李斯特菌中的应用，提供草豆蔻提取物的制备方法，以及其对单增李斯特菌抑菌活性的数据支持。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明的目的之一在于，提供一种草豆蔻提取物的制备方法，包括如下制备方法：取草豆蔻果壳或种子，打碎或阴干后打碎，按料液比1:(8-10)g/mL，加入水，加热后，加入咪唑类离子液体，进行超声提取或浸泡提取，水蒸气蒸馏，得草豆蔻提取物。

优选地，所述咪唑类离子液体为1-甲基咪唑氯盐，加入量为5-10wt％。

优选地，所述加热的温度为40-50℃，加热的时间为10-15min。

优选地，所述超声提取的功率为300-400W，超声提取的时间为25-35min，超声提取的温度为30-40℃。

进一步的，所述浸泡提取的时间为2-3h，浸泡提取的温度为30-40℃。

本发明的目的之二在于，提供一种草豆蔻提取物。

优选地，该草豆蔻提取物中包括桉叶油醇、α-水芹烯、石竹烯、α-松油醇、右旋萜二烯、2-茨酮、芳樟醇、莰烯和辛酸为主要的抑菌成分。

更优选地，该草豆蔻提取物中包括相对含量的桉叶油醇9.362％、α-水芹烯7.298％、石竹烯4.586％、α-松油醇4.267％、右旋萜二烯3.368％、2-茨酮2.947％、芳樟醇2.376％、莰烯2.135％和辛酸0.480％为主要的抑菌成分。

本发明的目的之三在于，提供一种草豆蔻提取物在抑制单增李斯特菌中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提取获得的草豆蔻提取物对单增李斯特菌具有良好的抑菌活性，其最低抑菌浓度(MIC)为0.078mg/mL，最低杀菌浓度(MBC)为0.3125mg/mL；本发明选用咪唑类离子液体，即1-甲基咪唑氯盐，用于辅助超声提取草豆蔻，有助于破除细胞壁，溶出草豆蔻有效成分，提高草豆蔻提取物的得率，本发明草豆蔻提取物的得率达到1.26％。

本发明提取获得的草豆蔻提取物，经成分分析，含有相对含量的桉叶油醇9.362％、α-水芹烯7.298％、石竹烯4.586％、α-松油醇4.267％、右旋萜二烯3.368％、2-茨酮2.947％、芳樟醇2.376％、莰烯2.135％和辛酸0.480％等主要的抑菌成分，化合物种类丰富，且具有独特的风味成分，杀菌效果良好、持久，可作为独特风味的外用天然抑菌产品以及配方制剂。

附图说明

图1为本发明实施例4的草豆蔻提取物成分GC-MS总离子流色谱图。

图2为本发明实施例4的草豆蔻提取物最小抑菌圈实验图。

图3为本发明实施例4的草豆蔻提取物的最小杀菌浓度实验图，其中，1-4依次对应草豆蔻的抑菌浓度为1.25，0.625，0.3125，0.15625mg/mL。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

试验1-草豆蔻提取物的提取

材料：草豆蔻鲜果、干果

鲜果预处理：鲜果放入冰箱4℃冷藏24h后取出，分离果壳和种子，分别打碎后，得鲜壳粉和鲜种子粉。

干果预处理：分离草豆蔻果壳和种子，分别阴干后打粉，得干壳粉和干种子粉。

对上述四种样品(鲜壳粉、鲜种子粉、干壳粉和干种子粉)选用料液比为1:8，1:10(g/mL)，加入蒸馏水，于40-50℃加热10min后，加入1-甲基咪唑氯盐5wt％，超声或浸泡提取后，将滤液进行水蒸气蒸馏，分别得相应的草豆蔻提取物；采用超声方法时，超声30min，功率360W，温度30-40℃。采用浸泡方法时，浸泡时间为2.5h，温度30-40℃，或对上述四种样品选用料液比为1:8，1:10，加入蒸馏水，直接进行超声或浸泡提取后，水蒸气蒸馏，分别得相应的草豆蔻提取物。

提取物得率＝提取物重量/样品重量×100。

实验结果见下表1。

表1草豆蔻不同处理工艺及提取物得率

由上表1看出，草豆蔻种子的提取物得率为0.43～1.26％，其中，干种子的提取物得率高于鲜种子，采用1-甲基咪唑氯盐辅助超声提取，有助于破除细胞壁，溶出草豆蔻有效成分，极大提高了草豆蔻提取物的提取率。

按干种子、蒸馏水和1-甲基咪唑氯盐的料液比为1:8:0.5，在干种子中加入蒸馏水和1-甲基咪唑氯盐，30-40℃、360W超声提取30min后，进行水蒸气蒸馏，测的草豆蔻提取物的得率为1.19％(实施例12)；在实施例4的基础上，将1-甲基咪唑氯盐替换为等量的1-乙基3-甲基咪唑溴盐，测的草豆蔻提取物的得率为1.18％(实施例13)。

试验2-草豆蔻提取物对单增李斯特菌的抑菌活性的测定

1材料

实施例4草豆蔻提取物，阳性对照药：0.04mg/ml氨苄青霉素，阴性对照药：100％乙醇。

细菌菌种：单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)购自北京北纳创联生物技术研究院。

2实验方法

2.1抑菌圈的测定

采用滤纸片琼脂平板扩散法，在无菌环境下，用移液枪吸取15μL草豆蔻提取物滴在d＝6mm的无菌滤纸片上，待纸片充分吸收后贴在已涂布菌液的胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)平板上，并标记好各药液的名称，每个药液重复3次，菌液浓度为10

抑菌圈测定标准为：抑菌圈直径大于20m为极敏，直径在15-20mm之间为高敏，在10-15mm之间为中敏，抑菌圈直径小于10mm为低敏。

2.2最低抑菌浓度(MIC)的测定

在96孔培养板上采用微量二倍稀释法进行MIC实验，将草豆蔻提取物溶于无水乙醇分别配置成400mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、10mg/mL、5mg/mL的草豆蔻提取物溶液。将96孔板上的A1孔作为起始孔，A、B、C、E、F、H六排左到右12个孔分别加入胰酪大豆胨液体培养基(TSB)100μL。在A、B、C、H的第一孔中加入100μL配置好的草豆蔻提取物溶液，在E、F排的第一孔加入氨苄青霉素100μL充分混匀至乳化，依次对1～12孔做梯度稀释，充分混匀后每孔加入100μL菌液(A-C为三个重复，E、F为阳性药物对照、H为确认草豆蔻提取物颜色是否有影响)，在另一个板的任意两排用100％乙醇进行二倍稀释作为阴性对照，再选两排的1-6孔分别加入50μL、75μL、88μL、94μL、97μL、98μL的培养基后每空再加入100μL菌液作为空白对照，用封口膜封好后标记好，在培养箱37℃中培养12h后，使用酶标仪测定样品的吸光值，抑菌率达到80％的样品浓度为草豆蔻提取物对单增李斯特菌的最低抑菌浓度MIC。

2.3最低杀菌浓度(MBC)的测定

采用琼脂培养基平板法，吸取50μL步骤2中各样品MIC值所对应的溶液均匀涂布于琼脂培养基中，培养条件为恒温培养箱37℃培养12h，而后观察培养基中有无菌株生长，草豆蔻提取物的MBC为菌落数低于5个的平板所对应孔中的最低浓度。

3结果

其结果如下表2：

表2草豆蔻提取物对单增李斯特菌的抑菌活性

注：“—”表示无MIC、MBC值、抑菌圈直径。

由上表2看出，本发明获得的草豆蔻提取物对单增李斯特菌具有良好的抑菌活性，最低抑菌浓度(MIC)为0.078mg/mL，最低杀菌浓度(MBC)为0.3125mg/mL。

对比试验例：选用干燥的肉豆蔻种子，按料液比1:8(g/mL)，加入蒸馏水，以超声功率360W、温度30-40℃，进行超声提取30min，水蒸气蒸馏，得肉豆蔻精油，经实验测定，肉豆蔻精油对单增李斯特菌的最低抑菌浓度(MIC)为0.6250mg/mL，最低杀菌浓度(MBC)为2.500mg/mL。

试验3-GC-MS测定草豆蔻提取物的成分含量

采用Agilent Technologies 7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪对草豆蔻提取物的成分进行测定。

1实验步骤

1.1色谱条件(FF5)

采用VF-WAXms色谱柱(0.25mm×30mm，0.25μm)。以60℃为起始温度，保持1min；以4℃/min升温至150℃，再以6℃/min升温至230℃；进样口温度为230℃；进样量为1.0μL，分流比为8:1。

1.2质谱条件

离子源为EI源，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70eV，接口温度230℃，倍增管电压1043V，采集类型为全扫描，质量范围30-400amu。

1.3.样品处理：

制备的草豆蔻提取物各取50μL，用异丙醇溶解配制成浓度为2.5％的溶液后，再进行GC-MS分析。

2结果

实施例4的草豆蔻提取物成分分析及其相对含量的结果如表3。

通过GC-MS测定共从草豆蔻提取物中鉴定出108个成分，共有12种化合物，其中有烯类化合物35种，醇类化合物29种，酯类化合物9种，酮类化合物9种，萘类化合物8种，酸类化合物8种，醛类2种，酚类2种，苯类2种，烷类2种，吡喃1种，呋喃1种。

实施例4中，其主要抑菌成分为桉叶油醇(9.362％)、α-水芹烯(7.298％)、石竹烯(4.586％)、α-松油醇(4.267％)、右旋萜二烯(3.368％)、2-茨酮(2.947％)、芳樟醇(2.376％)、莰烯(2.135％)、辛酸(0.480％)。

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