用抗神经酰胺抗体增强伤口愈合

相关申请的交叉引用

本申请是于2021年3月16日提交的美国临时申请第63/161,758号的继续申请，所述美国临时申请的内容以全文引用的方式并入本文中。

关于序列表的声明

与本申请相关联的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且在此通过引用并入到本说明书中。序列表的计算机可读格式副本：文件名：CERA_020_00US_SeqList_ST25.txt，记录日期：2021年3月16日，文件大小：约31.7千字节。

技术领域

本公开涉及抗神经酰胺组合物和其用于治疗或预防伤口、或增强伤口愈合，例如糖尿病伤口愈合的使用方法。

背景技术

糖尿病影响着世界上3.4亿人，包含美国的2910万人。糖尿病患者的并发症是伤口无法愈合，这导致2010年美国有73,000例下肢截肢。

在糖尿病患者中，高血糖会引发长期慢性炎症、循环不良和神经病变。这些因素的组合减缓或者甚至停止了伤口愈合过程。尽管在该领域进行了广泛的研究，糖尿病伤口的愈合受损的潜在机制是多因素的并且仍然知之甚少。

糖尿病伤口的标准治疗包含伤口清创术、用抗生素治疗感染以及减轻或消除下肢的重量压力。然而，对于加速伤口愈合的安全且有效的治疗方法，特别是对于糖尿病伤口，仍然存在未满足的需求。

附图说明

图1A-图1B示出了伤口愈合随时间的代表性照片。每行示出了指定实验组中的特定病变位点的图像。

图2示出了每个实验组中的伤口愈合随时间的平均速率。Y轴表示伤口的大小，其中每个伤口的起始大小归一化为1。X轴表示天数。“D+A2A”是糖尿病+2A2组，并且“C+A2A”是对照+2A2组。

图3A-B-示出了说明治疗之间的差异的条形图。图3A是示出了十天之后伤口大小的条形图，其中伤口大小表示为初始伤口大小的归一化％。图3B是示出了每个实验组中的小鼠达到95％愈合所用的平均天数的条形图。

图4示出了每个实验组中的伤口愈合随时间的平均速率。Y轴表示伤口的大小，其中每个伤口的起始大小归一化为1。X轴表示天数。

图5A-D-是示出了实验组中的每个实验组的小鼠分别达到25％、50％、75％和90％愈合所用的平均天数的条形图。

发明内容

一方面，本公开提供了治疗或预防有需要的受试者的伤口的方法，所述方法包括向所述受试者施用抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。

一方面，本公开提供了增强有需要的受试者的伤口愈合的方法，所述方法包括向所述受试者施用抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。

在一些实施例中，所述伤口是慢性伤口或糖尿病伤口。在一些实施例中，所述伤口是慢性伤口。在一些实施例中，所述伤口是糖尿病伤口。

在一些实施例中，施用途径选自由以下组成的组：局部施用、病灶内施用、皮下施用、经皮施用、肌内施用、静脉内施用和肠胃外施用。在一些实施例中，所述施用途径是局部施用。在一些实施例中，所述施用途径是静脉内施用。

在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段以单剂量施用。在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段以两个或更多个剂量施用。在一些实施例中，连续剂量的施用间隔至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天或至少一周。在一些实施例中，所述施用的持续时间为至少一周、至少两周、至少三周或至少四周。

在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段在伤口愈合的炎性阶段期间施用。在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段在伤口愈合的增殖阶段期间施用。在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段在伤口愈合的重塑阶段期间施用。

在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是抗体。在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。

在一些实施例中，与对照伤口相比，所述方法将伤口愈合增强至少10％、至少20％、至少30％、至少50％或至少70％。在一些实施例中，通过在受伤后第10天、第20天或第30天所述伤口的总表面积的减少来测量所述伤口愈合的增强。在一些实施例中，在受伤后第10天测量所述伤口愈合的增强。在一些实施例中，通过实现所述伤口的总表面积50％、70％、90％、95％或100％减少所用的时间的减少来测量所述伤口愈合的增强。在一些实施例中，在所述伤口的总表面积95％减少时测量所述伤口愈合的增强。

在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段在所述伤口的一种或多种症状发作之前施用。在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段在所述伤口的一种或多种症状发作之后施用。

在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包括可变重链(V

在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包括可变重链(V

在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包括可变重链(V

在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是人源化6B5(h6B5)抗体。在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是h6B5 scFv。

在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包括可变重链(V

具体实施方式

概述

本公开涉及用于增强伤口愈合的组合物和方法。在一些实施例中，提供了抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段(例如，scFv)的组合物以及用于治疗或预防伤口的方法。在一些实施例中，所述伤口是慢性伤口。在一些实施例中，所述伤口是糖尿病伤口。此类组合物和方法可以用于治疗先前对糖尿病伤口的另一种治疗失败的患者的糖尿病伤口。

定义

如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容另外明确指出，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指代物。

如在本说明书中所使用的，除非另有指示，否则在本公开中使用术语“和/或”来意指“和”或“或”。

贯穿本说明书，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise)”或如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”等变型应当理解为暗示包含所述的要素或整体或要素或整体组，但不排除任何其它要素或整体或要素或整体组。

如本申请中使用的，术语“约”和“大约”用作等同物。本申请中使用的有或无约/大约的任何数值意指涵盖相关领域普通技术人员所了解的任何正常波动。在某些实施例中，除非另有规定或另外从上下文显而易见(除了此些数字将会超过可能值的100％或低于可能值的0％的情况)，否则术语“大约”或“约”是指在规定的参考值的在任一方向(大于或小于)10％或更小的值的范围。

术语“样品”是指经受分析和/或修饰的生物组合物(例如，细胞或组织的一部分)。在一些实施例中，样品是直接从受试者获得的“原始样品”；在一些实施例，“样品”是加工原始样品例如以去除某些组分和/或以分离或以纯化所关注的某些组分的结果。

术语“受试者”包含动物，例如哺乳动物。在一些实施例中，哺乳动物是灵长类动物。在一些实施例中，哺乳动物是人。在一些实施例中，受试者是家畜，如牛、绵羊、山羊、奶牛、猪等；或家养动物，如狗和猫。在一些实施例中(例如，具体地在研究环境中)，受试者是啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔子、灵长类动物或猪，如近交系猪等。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。在一些实施例中，受试者可以是新生儿、青少年或成人。特别关注的是哺乳动物受试者。以用本方法处理的哺乳动物物种包含犬和猫；马；牛；绵羊等和灵长类动物，特别是人类。动物模型，特别是小型哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔子等)可以用于实验研究。

如本文所使用的，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“减轻”是指治疗性治疗或防治性/预防性治疗。如果接受治疗的个体的疾病的至少一种症状得到改善，或者治疗可以延缓个体的进行性疾病的恶化或防止另外的相关疾病的发作，则治疗是治疗性的。

如本文所使用的，术语“有效量”是指产生特定生理作用所需的药剂或组合物的量。特定药剂的有效量可以基于药剂的性质以多种方式表示，如质量/体积、细胞数/体积、颗粒/体积、(药剂的质量)/(受试者质量)、细胞数/(受试者质量)或粒子/(受试者质量)。特定药剂的有效量也可以表示为半最大有效浓度(EC

术语“抗体”是指能够通过位于Ig分子的可变区中的至少一个表位识别位点与特定靶标结合的免疫球蛋白(Ig)分子，如碳水化合物、多核苷酸、脂质或多肽。如本文所使用的，所述术语涵盖完整多克隆抗体或单克隆抗体和其抗原结合片段。例如，天然免疫球蛋白分子由两条重链多肽和两条轻链多肽组成。重链多肽中的每一种通过重链与轻链多肽之间的链间二硫键与轻链多肽缔合，以形成两种异二聚蛋白质或多肽(即，由两条异源多肽链组成的蛋白质)。然后，这两种异二聚蛋白质通过重链多肽之间的另外的链间二硫键缔合，以形成免疫球蛋白或多肽。

如本文所使用的术语“抗原结合片段”是指含有与所关注的抗原的至少一个表位结合的免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个互补决定区(CDR)的多肽片段。在这方面，本文所描述的抗体的抗原结合片段可以包括来自与神经酰胺特异性结合的抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列的1、2、3、4、5或全部6个CDR。抗原结合片段包含包括全长抗体的一部分的蛋白质，通常是其抗原结合或可变区，如Fab、F(ab')2、Fab'、Fv片段、微型抗体、双抗体、单结构域抗体(dAb)、单链可变片段(scFv)、由抗体片段形成的多特异性抗体，以及包括所需特异性的抗原结合位点或片段的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。在本公开的某些实施例中，使用抗原结合片段而不是完整抗体来增加组织穿透或肿瘤穿透。在其它实施例中，抗原结合片段被进一步修饰以增加血清半衰期。

“Fc区”或“Fc结构域”是指对应于或源自抗体的部分的多肽序列，所述抗体的部分能够与细胞上的Fc受体和/或补体的C1q组分结合，由此介导抗体的效应子功能。Fc代表“片段结晶”，抗体的片段将很容易形成蛋白质晶体。最初由蛋白水解消化描述的不同蛋白质片段可以定义免疫球蛋白的总体结构。如文献中最初定义的，Fc区是包括两个多肽的同源二聚蛋白质，所述两个多肽通过二硫键缔合，并且每个多肽包括铰链区、CH2结构域和CH3结构域。然而，最近所述术语已经应用于由CH3、CH2和至少一部分铰链组成的单链单体组分，足以与第二条此类链形成二硫键连接的二聚体。因此，并且根据上下文，术语“Fc区”或“Fc结构域”的使用在本文中将指二聚体形式或缔合形成二聚蛋白质的单个单体。关于免疫球蛋白结构和功能的综述，参见Putnam,《血浆蛋白(The Plasma Proteins)》,第V卷(学术出版社公司(Academic Press,Inc.),1987),第49-140页；以及Padlan,《分子免疫学(Mol.Immunol.)》31:169-217,1994。如本文所使用的，术语Fc结构域包含天然存在的序列的变体。

术语“免疫球蛋白恒定区”或“恒定区”是指对应于或源自免疫球蛋白的一个或多个恒定结构域(例如，CH1、CH2、CH3)的部分或全部的肽或多肽序列。在某些实施例中，所述恒定区不包括CH1结构域。在某些实施例中，构成恒定区的恒定结构域是人的。

术语“轻链可变区”(也称为“轻链可变结构域”或“VL”)和“重链可变区”(也称为“重链可变结构域”或“VH”)分别是指来自抗体轻链和重链的可变结合区。可变结合区由称为“互补决定区”(CDR)和“框架区”(FR)的离散、明确定义的子区构成。

术语“免疫球蛋白轻链恒定区”(也称为“轻链恒定区”或“CL”)是来自抗体轻链的恒定区。

术语“免疫球蛋白重链恒定区”(也称为“重链恒定区”或“CH”)是指来自抗体重链的恒定区。取决于抗体同种型，所述CH可进一步分为CH1、CH2和CH3(IgA、IgD、IgG)或CH1、CH2、CH3和CH4结构域(IgE、IgM)。

术语“F(ab)”是指由木瓜蛋白酶对IgG分子的蛋白水解切割产生的蛋白质片段中的两种。每个F(ab)包括VH链和VL链的共价异源二聚体并且包含完整的抗原结合位点。每个F(ab)是单价抗原结合片段。术语“Fab'”是指源自F(ab')2的片段并且可能含有Fc的小部分。每个Fab'片段是单价抗原结合片段。

术语“F(ab')2”是指由胃蛋白酶的蛋白水解切割产生的IgG的蛋白质片段。每个F(ab')2片段包括两个F(ab')片段并且因此是二价抗原结合片段。

“Fd片段”包括VH和CH1结构域。

“Fv片段”是指非共价VH::VL异源二聚体，其包含保留许多抗原识别和天然抗体分子的结合能力的抗原结合位点，但是缺少Fab内含有的CH1和CL结构域。Inbar等人(1972)《美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》69:2659-2662；Hochman等人(1976)《生物化学(Biochem)》15:2706-2710；以及Ehrlich等人(1980)《生物化学》19:4091-4096。在一些实施例中，Fv片段可以通过IgM的优先蛋白水解切割来产生，并且在极少情况下可以通过IgG或IgA免疫球蛋白分子的优先蛋白水解切割来产生。然而，更常见的是，使用本领域中已知的重组技术来得到Fv片段。

包括VH结构域的“dAb片段”(Ward等人,《自然(Nature)》341:544 546,1989)。

“单链抗体”或“scFv”是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其与十至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以提高灵活性，以及丝氨酸或苏氨酸以提高溶解度，并且可以将VH的N端与VL的C端连接起来，反之亦然。scFv保留原始免疫球蛋白的特异性，尽管去除了恒定区并引入了接头。在本公开中，对抗体或抗体片段或其用途的任何提及旨在包括scFv分子和其用途。

“微型抗体”是指包括与CH3结构域连接的scFv的融合蛋白并且也包含在本文中(S.Hu等人,《癌症研究(Cancer Res.)》,56,3055-3061,1996)。参见例如Ward,E.S.等人,《自然》341,544-546(1989)；Bird等人,《科学(Science)》242,423-426,1988；Huston等人,《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》,85,5879-5883,1988)；PCT/US92/09965；WO94/13804；P.Holliger等人,《美国国家科学院院刊》90 6444-6448,1993；Y.Reiter等人,《自然生物技术(Nature Biotech)》,14,1239-1245,1996；S.Hu等人,《癌症研究》,56,3055-3061,1996。

术语“双抗体”是指双价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链中表达，使用的接头短得无法使同一条链上的两个结构域之间配对，由此迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger等人,《美国国家科学院院刊》90:6444-48(1993)以及Poljak等人,《结构(Structure)》2:1121-23(1994))。

术语“纳米抗体”或“单结构域抗体”是指由单个单体可变抗体结构域组成的抗原结合片段。纳米克隆方法是用于基于B细胞的自动化高吞吐量选择来产生针对期望靶标的纳米抗体的方法。(参见WO 2006/079372)

如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质抗体群体中获得的抗体，即包括所述群体的单独抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变之外。

如本文所使用的术语“嵌合抗体”是指单克隆抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出所期望的生物活性即可。

术语“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其与十至约25个氨基酸的短接头肽连接。Huston等人(1988)《美国国家科学院院刊》85(16):5879-5883。接头可以将VH的N端与VL的C端连接，或反之亦然。已经描述了用于辨别用于将来自抗体V区的天然聚集但是化学分离的轻多肽链和重多肽链转换成scFv分子的化学结构的多种方法，所述scFv分子将折叠成与抗原结合位点的结构基本上类似的三维结构。参见例如Huston等人的美国专利第5,091,513号和第5,132,405号；和Ladner等人的美国专利第4,946,778号。

如本文所使用的，术语“CDR”是指免疫球蛋白(抗体)分子的“互补决定区”。CDR是抗体中的可变结构域的一部分，其中抗体与其特定抗原结合。每个可变结构域有三个CDR(即，轻链的可变结构域中的CDR1、CDR2和CDR3以及重链的可变结构域中的CDR1、CDR2和CDR3)。在可变结构域内，CDR1和CDR2存在于多肽链的可变(V)区中，CDR3示出了最大的可变性，因为其是由在轻链区的情况下的VJ和在重链区的情况下的VDJ的重组编码的。

“分离的抗体”是抗体，所述抗体(1)不与天然状态下伴随其的包含其它天然相关抗体的天然相关组分相关联，(2)不含来自相同物种的其它蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不是天然存在的。

术语“人抗体”包含具有源自人免疫球蛋白序列的一个或多个可变区和恒定区的抗体。在优选实施例中，所有可变结构域和恒定结构域源自人免疫球蛋白序列(完全人抗体)。这些抗体可以用多种方法制备，如下文所描述的。

如本文所使用的，术语“人源化的”是指源自非人物种的保留了原始非人抗体的抗原结合性质的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，抗体的结合片段(例如，轻链和重链可变区、Fab、scFv)是人源化的。非人抗原结合片段可以使用称为CDR移植的技术(Jones等人,《自然》321:522(1986))和其变体，包含“整形”(Verhoeyen等人,1988《科学》239:1534-1536；Riechmann等人,1988,《自然》332:323-337；Tempest等人,《生物/技术(Bio/Technol)》1991 9:266-271),“超嵌合(hyperchimerization)”(Queen等人,1989《美国国家科学院院刊》86:10029-10033；Co等人,1991《美国国家科学院院刊》88:2869-2873；Co等人,1992《免疫学杂志(J Immunol)》148:1149-1154)以及“镶面(veneering)”(Mark等人,“治疗活性人源化和镶面抗CD18抗体的衍生(Derivation of therapeutically activehumanized and veneered anti-CD18 antibodies.)”Metcalf BW,Dalton BJ编辑细胞粘附：治疗潜力的分子定义(Cellular adhesion:molecular definition to therapeuticpotential.)纽约：普莱纽姆出版社(Plenum Press),1994:291-312)人源化。如果源自非人来源，抗体的其它区，如铰链区和恒定区结构域也可以人源化。

如本文所使用的，术语“药学上可接受的”是指当使用本领域公知的途径施用时，通常不会产生过敏或其它严重不良反应的分子实体和组合物。由联邦或州政府的监管机构批准的或在美国药典或其它公认的药典中列出的用于动物并且更具体地用于人类的分子实体和组合物被认为是“药学上可接受的”。

术语“预防”、“防治”和“防治性地”是指在疾病发作之前(例如，在疾病的某些症状发作之前)施用化合物，例如抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。预防疾病可以包含降低疾病将发生的可能性、延迟疾病的发作、减轻长期症状或延迟疾病的最终进展。

在本文中，术语“特异性结合”是指抗体或其抗原结合片段以至少10

如本文所使用的，术语“序列同一性”是指两个或更多个多核苷酸序列之间或两个或更多个多肽序列之间的关系。当一个序列中的位置被比较序列的对应位置中的同一核酸碱基或氨基酸残基占据时，所述序列被称为在所述位置处是“相同的”。序列同一性百分比是通过以下来计算的：确定相同的核酸碱基或氨基酸残基出现在两个序列中的位置的数量，以产生相同位置的数量。然后，将相同位置的数量除以比较窗口中的总位置数量，然后乘以100，以产生序列同一性百分比。序列同一性百分比是通过在比较窗口内比较两个最佳比对的序列来确定的。多核苷酸序列的比较窗口的长度可以为例如至少20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个或更多个核酸。多肽序列的比较窗口的长度可以为例如至少20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、300个或更多个氨基酸。为了最佳地比对序列以进行比较，多核苷酸序列或多肽序列的位于比较窗口中的部分可以包括被称为缺口(gap)的添加或缺失，而参考序列保持恒定。最佳比对是即使有缺口也在参考序列与比较序列之间产生最大可能数量的“相同”位置的比对。两个序列之间的“序列同一性”百分比可以使用程序“BLAST 2序列(BLAST 2Sequences)”的版本来确定，所述程序自2004年9月1日起可从国立生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)获得，所述程序结合了程序BLASTN(用于核苷酸序列比较)和BLASTP(用于多肽序列比较)，这些程序基于Karlin和Altschul的算法(《美国国家科学院院刊》90(12):5873-5877,1993)。当利用“BLAST 2序列”时，自2004年9月1日起作为默认参数的参数可以用于字号(3)、空位开放罚分(11)、空位扩展罚分(1)、空位下降(50)、期望值(10)和任何其它所需参数，包含但不限于矩阵选项。如果两个核苷酸序列或氨基酸序列相对于彼此具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，则这两个序列被认为具有“基本上类似的序列同一性”或“实质性序列同一性”。

“血管生成”是指新血管的形成。

如本文所使用的，术语“伤口”是指对组织的损伤，包含但不限于急性、亚急性、延迟或难以愈合的伤口和慢性伤口。损伤可能来自创伤、暴力、事故、外科手术、疾病。伤口可能由于膜(如皮肤)的撕裂或破裂而发生，并且通常对下层组织造成损伤。伤口可能由长期卧床引起的压疮引起。慢性伤口可能由疾病引起，包含但不限于糖尿病；内部器官的疾病，包含但不限于肝脏、肾脏或肺部疾病；癌症；或任何其它减缓愈合过程的病状。在一些实施例中，伤口可以由本段落中描述的因素的组合引起。伤口可能发生在局部位置或内部。伤口可以是开放性或闭合性伤口。伤口包含例如糖尿病伤口或溃疡、烧伤、切口、割伤、撕裂伤、擦伤、穿刺或穿透伤口、外科手术伤口、挫伤、血肿、挤压伤和溃疡。

术语“糖尿病伤口”是指至少部分由于糖尿病病状，例如I型或II型糖尿病，在糖尿病患者中产生的伤口。糖尿病伤口经常发生在下肢(例如，糖尿病足伤口)。

术语“伤口愈合的增强”或“伤口愈合的加速”可互换使用并且是指与对照组相比，治疗组中的伤口愈合过程的改善。

抗神经酰胺抗体、抗体片段和衍生物

本公开涉及用于增强伤口愈合或用于治疗或预防伤口的抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段。在一些实施例中，所述伤口是慢性伤口。在一些实施例中，所述伤口是糖尿病伤口。

神经酰胺是蜡质脂质分子家族。神经酰胺由鞘氨醇和脂肪酸组成。在真核细胞的细胞膜内发现高浓度的神经酰胺，因为其是组成鞘磷脂的组分脂质，所述鞘磷脂是脂质双层中的主要脂质之一。神经酰胺参与多种细胞信号传导，包含调节细胞的分化、增殖和程序性细胞死亡(PCD)。作为生物活性脂质，神经酰胺已经参与多种生理功能，包含细胞凋亡、细胞生长停滞、分化、细胞衰老、细胞迁移和粘附。神经酰胺和其下游代谢物已经在许多病理状态中也有作用，包含癌症、神经变性、糖尿病、微生物发病机制、肥胖和炎症。

示例性抗神经酰胺抗体的序列和性质也公开于美国专利公开第2010/0239572号和第2017/0335014号中，所述美国专利公开中的每一个通过引用并入本文。表1提供了说明性抗神经酰胺抗体的序列。然而，根据所公开的方法和用途，可以采用任何抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。

表1：说明性抗神经酰胺抗体序列

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在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是人源化6B5(h6B5)。在一些实施例中，所述h6B5抗体或其抗原结合片段包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施例中，h6B5抗体的序列在于2020年3月18日提交的美国临时申请62/991,232中提供，所述美国临时申请的内容通过引用整体并入本文。h6B5抗体或其抗原结合片段的CDR中的每一个的序列在本说明书中公开，并总结在下表2中。

表2：h6B5抗体和其抗原结合片段的CDR序列的组合

在一些实施例中，抗神经酰胺抗体选自由以下组成的组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、重组抗体或合成抗体。在一些实施例中，抗神经酰胺抗原结合抗体片段是前述任一种的抗原结合片段。在一些实施例中，抗神经酰胺抗原结合抗体片段是Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、Fd片段、dAb片段、双抗体、scFv等。在一些实施例中，使用重组DNA技术产生抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段。重组蛋白的表达和纯化的程序在本领域中已经建立。

在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，scFv包括2A2、h2A2、6C8、7B10、9H10、h6B5或6B5抗体的CDR序列和/或可变链序列。

在一些实施例中，抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是2A2抗体或其抗原结合片段，如美国专利公开第2010/0239572号中所描述的。在一些实施例中，抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是6B5抗体或其抗原结合片段，如美国专利公开第2017/0335014号中所描述的。在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是本公开的h6B5抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是scFv。在一些实施例中，所述scFV包括表1中公开抗体的任何抗体的CDR序列。在一些实施例中，所述scFv包括2A2的CDR序列。在一些实施例中，所述scFv包括6B5的CDR序列。在一些实施例中，所述scFv包括h6B5的CDR序列。在一些实施例中，所述scFv包括h2A2的可变重链和轻链序列。在一些实施例中，所述scFv包括6B5的可变重链和轻链序列。在一些实施例中，所述scFv包括h6B5的可变重链和轻链序列。

在一些实施例中，抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段具有任何免疫球蛋白同种型。免疫球蛋白可以来自任何通常已知的同种型，包含但不限于IgA、分泌性IgA、IgG和IgM。在某些物种中，IgG同种型分为亚类：人中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及小鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。在一些实施例中，抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段在Fc区中包括一个或多个修饰。某些修饰可以提供期望的效应子功能或血清半衰期。在一些实施例中，通过合适的Fc区，结合在细胞表面上的裸抗体可以诱导细胞毒性，例如，通过抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)或通过在补体依赖性细胞毒性(CDC)中募集补体，或通过募集表达一种或多种效应配体的非特异性细胞毒性细胞，所述效应配体识别靶细胞上结合的抗体，并且随后在抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)中引起靶细胞的吞噬作用，或一些其它机制。当期望消除或降低效应子功能，以使副作用或治疗并发症最小化时，可以使用某些其它Fc区。抗体的Fc区可以被修饰以增加对FcRn的结合亲和力，并且因此增加血清半衰期。可替代地，Fc区可以与PEG或白蛋白缀合以增加血清半衰期，或产生期望的效果的一些其它缀合。

在一些实施例中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包括可检测的标记或标签。示例性可检测标记包含荧光标签、亲和力标签、放射性同位素、发光标志物、颗粒标记、发色团、磷光标志物和酶标记。示例性荧光标记包含GFP、RFP和YFP。示例性酶标记包含辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。示例性肽标签包含His标签、MBP和链霉亲和素。

检测手段由选择的标签确定。标记或其反应产物的出现可以使用肉眼实现，在标记是颗粒并积累到适当水平的情况下，或使用仪器如分光光度计、光度计、荧光计，或通过ELISA或蛋白质印迹。

伤口愈合

一方面，本公开提供了用于增强伤口愈合的方法和组合物。一方面，本公开提供了用于治疗或预防伤口的方法和组合物。

自然伤口愈合发生在明确定义的阶段。急性性质的皮肤伤口可以在1-3周内在恢复皮肤和下层组织的完整性和功能的生物过程中愈合。这种伤口可能是皮肤刮伤、擦伤(abrasion)、割伤、擦伤(graze)、切口、撕裂或青肿的结果。

根据伤口的深度，可以将伤口分为四个等级之一：i)I级：仅限于上皮的伤口；ii)II级：伤口延伸至真皮中；iii)III级：伤口延伸至皮下组织中；和iv)IV级(或全厚度伤口)：骨头暴露的伤口(例如，骨头压力点，如大转子或骶骨)。术语“部分厚度伤口”是指涵盖I-III级的伤口；部分厚度伤口的实例包含压疮、静脉淤血性溃疡和糖尿病伤口或溃疡。术语“深度伤口”意指包含III级和IV级伤口两者。

自然伤口愈合主要根据三个主要的时间顺序发生。这些序列中的每一个的特征在于特定的细胞活性并受大量调节信号(阳性和阴性两者)的控制，所述大量调节信号共同管理和支持修复过程的进展。因此，以下被区分为：

(a)炎性期；

(b)增殖期(其包括肉芽期和上皮形成期)；以及

(c)重塑期。

作为炎性期的第一期是血管一破裂就开始，这一事件触发凝块(血液凝固)的形成，所述凝块主要由纤维蛋白和纤连蛋白组成并且将构成临时基质。这种基质部分地填充了病变并使得所募集的炎性细胞能够在损伤区域内迁移，以确保伤口的恶化。血小板还存在释放因子(例如细胞因子和/或生长因子)，使得涉及愈合过程的细胞能够被募集。这一期的特征在于在病变的位点处的大量炎性细胞(多形核细胞、巨噬细胞)的浸润和激活，所述细胞保护机体免受任何外来微生物的侵害并且也清洁或阻止伤口。

第二期与肉芽组织的发展相对应。首先，通过成纤维细胞的迁移和增殖观察到损伤的定居。然后，来自健康血管的内皮细胞的迁移允许受损组织的新血管形成或血管生成。在肉芽组织中，成纤维细胞被激活并分化成肌成纤维细胞，所述肌成纤维细胞具有由肌动蛋白微丝提供的显著收缩性质，因此使得伤口能够收缩。微丝通过蛋白质α-平滑肌肌动蛋白表达。这些肌成纤维细胞在肉芽组织的形成和收缩中起重要作用，所述肉芽组织的形成和收缩导致病变的愈合。角质细胞然后从伤口的边缘迁移并且然后分化，导致表皮的重建。肉芽组织的发展的这一阶段是在病变的一般炎症状态减轻、多形核中性粒细胞逐渐消失和巨噬细胞，包含“修复”巨噬细胞出现之后开始的。这种从炎性期到增殖/修复期的转变被称为炎症的消退期。

过程的第三期是重塑阶段，目标是重建功能性组织，使得新形成的组织呈现原始组织的初始特性和性质。部分细胞外基质被蛋白酶(主要是基质金属蛋白酶和弹性蛋白酶)消化，并观察到细胞外基质的重组。在肉芽组织中占优势的III型胶原逐渐被作为真皮的主要基质组分的I型胶原所取代。在成熟期结束时，成纤维细胞、肌成纤维细胞和血管细胞的增殖和/或活性降低。然后，多余的细胞通过凋亡死亡，伴随着细胞外基质的重塑。

如果伤口在正常时间段内没有愈合，则被认为是“慢性伤口”。例如，慢性伤口可能需要超过2周、超过3周、超过4周、超过5周、超过6周、超过6周、超过7周、超过8周、超过9周、超过10周、超过11周、超过12周、超过3个月、超过4个月、超过5个月或超过6个月来愈合。在一些实施例中，慢性伤口在从伤口出现开始的3、4、5、6、7、8、9或10周之后不会开始愈合。

在慢性伤口的情况下，伤口可能在愈合的阶段之一变薄，或者不能进展通过正常的愈合阶段。慢性伤口可以包含例如至少部分特征在于以下中的一种或多种的伤口：1)延长的炎性期，2)缓慢形成或有缺陷的细胞外基质(ECM)以及3)上皮形成的停滞或降低的速率。慢性伤口可能已经存在了相对短的时间段，如一个月，或者可能已经存在了几年。本文所描述的组合物和方法可以启动和增强慢性伤口的愈合。

慢性皮肤伤口包含但不限于皮肤溃疡、褥疮、压疮、糖尿病伤口(例如，糖尿病溃疡和疮)以及其它皮肤病症。在一些实施例中，慢性伤口选自糖尿病伤口、静脉性溃疡、动脉性溃疡、压力性溃疡和血管炎性溃疡。在一些实施例中，所述慢性伤口是糖尿病伤口。

慢性皮肤伤口可以是任何大小、形状或深度，并且与正常、健康的皮肤色素相比可能会出现变色。慢性皮肤伤口会出血、肿胀、渗出脓性分泌物或其它液体，引起疼痛或使受影响区域的活动困难或疼痛。慢性皮肤伤口可能会受到感染，导致体温升高，以及乳白色、黄色、绿色或棕色的脓液或分泌物。分泌物可以是无味的或有刺激性气味。如果感染，慢性皮肤伤口可能是红色、触痛或温暖的。

慢性皮肤伤口可以由糖尿病、血液供应不良、低氧血症、因低血压导致血流减少的病状或特征在于血管闭塞、阻塞或狭窄的病状引起。低氧供应可能由某些血液、心脏和肺部疾病和/或吸烟引起。慢性皮肤伤口也可能是皮肤反复创伤的结果，如组织中的肿胀或压力增加，或伤口区域上的持续压力。慢性皮肤伤口也可能是由免疫系统减弱或受损引起的。免疫系统减弱或受损可能是由年龄增加、辐射、营养不良和/或如抗癌药物或类固醇等药物引起的。慢性皮肤伤口也可能由细菌、病毒或真菌感染或外来物体的存在引起。

糖尿病受试者受伤后伤口愈合受损是主要的临床问题，导致长期住院和大量的医疗费用。三分之二的非创伤性截肢手术之前有糖尿病伤口。糖尿病伤口的愈合受损是多因素的并且其特征在于趋化因子产生减少、血管生成减少和异常炎性应答。

不受任何特定理论的束缚，经考虑这些糖尿病伤口没有愈合至少部分与葡萄糖的生物利用度增加有关。这导致许多生理和代谢变化，如皮肤变厚，或导致神经病变和动脉病变的显著氧化应激。动脉病变和神经病变是糖尿病伤口，并且更具体地糖尿病足伤口的慢性化并且因此延迟愈合的两个主要风险因素。最众所周知的慢性非糖尿病伤口类型，如褥疮或静脉、动脉或混合溃疡，并不是由相同的病理引起的。例如，静脉功能不全是静脉溃疡形成、慢性化并且因此延迟愈合的原因。褥疮，就其本身而言，是在皮肤组织上过度和长时间的压力和摩擦后的局部缺血和再灌注循环之后产生的伤口。

几个主要问题扰乱了糖尿病患者的正确伤口愈合顺序。愈合的第一延迟发生在炎性期：从炎性期到增殖期的过渡被中断。炎性期是愈合中的基本期，但其必须是暂时的。炎症的消退是决定其它愈合期开始的关键点。这一动态事件涉及炎性细胞(多形核中性粒细胞)的消失和巨噬细胞的出现。然后，产生趋化性和血管生成性抗炎介质，其显著地使成纤维细胞迁移和分化，所述成纤维细胞是肉芽期的关键细胞。如在上述受试者中的情况，对该炎性期的破坏导致炎性期的异常延长，并引起伤口的慢性化，由此延迟愈合的所有后续阶段。最后，尤其是在上皮形成期间的伤口闭合期被延迟或者在大多数情况下甚至不发生。

神经酰胺和ASM在伤口愈合中的作用

不受任何特定理论的束缚，经考虑富含神经酰胺的平台(CRP)的形成是微血管内皮发病机制的基础，其导致伤口愈合困难，例如在慢性伤口或糖尿病伤口的情况下。

鞘脂表示膜微结构域的主要组分，富含神经酰胺的微结构域似乎是炎性细胞因子信号传导的先决条件。酸性鞘磷脂酶(ASM)和中性鞘磷脂酶(NSM)是鞘脂代谢的关键调节酶，促进鞘磷脂水解为促炎性神经酰胺。ASM是炎性细胞因子信号传导的重要早期应答者。

内皮组织损伤导致膜损伤和细胞膜的胞外小叶中的酸性鞘磷脂酶依赖性神经酰胺形成。在损伤后组织损伤的演变期间，CRP依赖性凋亡可能表示前馈过程。在免疫介导的组织损伤中，溶细胞性T细胞也在靶细胞上诱导有效细胞杀伤所需的CRP。这一过程的破坏阻止了免疫介导的组织损伤的进一步发展，并导致了稳健而持久的组织修复过程的启动。

施用抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段恢复血管内皮稳态，并导致血液与组织之间的信号传导的调节、造血细胞的运输、非血栓形成性血流的维持、免疫和炎性应答的促进以及稳态修复和再生，而不会在损伤之后引起纤维化。另外，由于富含神经酰胺的平台主要存在于受损细胞中，抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的系统递送可以局部作用于受损组织而不影响正常组织，因此潜在地提供了广泛的治疗指数。

药物组合物、施用途径、剂量和给药方案

在一些实施例中，本公开提供了包括抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的药物组合物，用于增强伤口愈合，或用于治疗或预防伤口。

对于施用，本公开的抗体或片段(例如，抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段)可以被调配成药物组合物。药物组合物可以包括：(i)抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段；以及(ii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。包括抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段和/或scFv的药物组合物可以根据已知方法调配以制备药学上有用的组合物，其中治疗分子与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合成混合物。合适的载体、稀释剂或赋形剂是本领域技术人员熟知的。(参见例如，Gennaro(编辑),《雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》(麦克出版公司(Mack Publishing Company),第19版1995)。)调配物可以进一步包含一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、白蛋白，以防止蛋白质在小瓶表面上的损失等等。

在一些实施例中，药物组合物可以以以下剂型之一调配：口服单位剂型、静脉内单位剂型、鼻内单位剂型、栓剂单位剂型、皮内单位剂型、肌内单位剂型、腹膜内单位剂型、皮下单位剂型或局部剂型。在一些实施例中，药物组合物可以以局部剂型调配。在一些实施例中，药物组合物可以以静脉内剂型调配。

在一些实施例中，调配药物组合物以供局部施用。在一些实施例中，抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的局部药物组合物可以与药学上可接受的载体组合调配。局部组合物的剂型的非限制性实例包含粉末、喷雾剂、泡沫、凝胶剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂、栓剂和脂质体制剂。剂型可以用粘膜粘附聚合物调配，用于活性成分的持续释放。活性化合物可以在无菌条件下与药学上可接受的载体和可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。局部制剂可以通过将活性成分与常用于局部干、液体、乳膏剂和气雾剂调配物中的常规药物稀释剂和载体组合来制备。软膏剂和乳膏剂可以例如用水基质或油基质同时添加合适的增稠剂和/或胶凝剂调配。此类基质可以包含水和/或油，如液体石蜡或植物油，如花生油或蓖麻油。根据基质的性质，可以使用的增稠剂包含软石蜡、硬脂酸铝、鲸蜡硬脂醇、丙二醇、聚乙二醇、羊毛脂、氢化羊毛脂、蜂蜡等。洗剂可以用水基质或油基质调配，并且通常还包含以下中的一种或多种：稳定剂、乳化剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、香料等。粉末可以在任何合适的粉末基的帮助下形成，例如滑石、乳糖、淀粉等。可以用水基质或非水基质调配滴剂，所述基质还包括一种或多种分散剂、悬浮剂、增溶剂等。

在一些实施例中，软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶也可以含有赋形剂，如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。粉末和喷雾剂还可以含有赋形剂，如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可以另外含有常规推进剂，如氯氟烃和挥发性未经取代的烃，如丁烷和丙烷。

在一些实施例中，抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段可以用药学上可接受的载体和以下第二药物试剂中的至少一种调配：局部麻醉剂(例如，利多卡因、丙胺卡因等)、局部抗炎剂(例如萘普生、普拉莫昔康等)、皮质类固醇(例如，可的松、氢化可的松等)、止痒剂(例如，洛哌丁胺、草酸二苯酯等)，干扰外周感觉神经元激活的试剂，包含二价和三价金属离子(例如，锰、钙、锶、镍、镧、铈、锌等)、止痛剂、润滑剂、基于酵母的产物(例如，冻干酵母、酵母提取物等)、已知促进上皮再形成的杀精子剂、生长促进剂和/或伤口愈合促进剂(例如，血小板源性生长因子受体(PDGF)、白介素-11(IL-11)等)、抗微生物剂(例如，新孢霉素、多粘菌素B硫酸盐、杆菌肽锌等)、粘膜粘附剂(例如，纤维素衍生物等)、细胞保护剂(例如，胶体铋、米索前列醇、硫糖铝等)，如Goodman和Gilman,《治疗学的药理学基础(ThePharmacological Basis of Therapeutics)》所定义的或甲醇。

本文所描述的抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段可以通过一种或多种施用途径施用于受试者。可能的施用途径包含，例如，肌内、皮下、静脉内、心房内、关节内、肠胃外、鼻内、肺内、经皮、鞘内、口服、局部和病灶内途径。在一些实施例中，所述施用途径选自由以下组成的组：局部途径、病灶内施用、皮下施用、经皮施用、肌内施用、静脉内施用和肠胃外施用。

在一些实施例中，本文所公开的抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段或其药物组合物的施用包括局部施用或由其组成。在一些实施例中，本文所公开的抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段或其药物组合物的施用包括病灶内施用或由其组成。在一些实施例中，本文所公开的抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段或其药物组合物的施用包括皮下施用或由其组成。在一些实施例中，本文所公开的抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段或其药物组合物的施用包括经皮施用或由其组成。在一些实施例中，本文所公开的抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段或其药物组合物的施用包括肌内施用或由其组成。在一些实施例中，本文所公开的抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段或其药物组合物的施用包括静脉内施用或由其组成。在一些实施例中，本文所公开的抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段或其药物组合物的施用包括肠胃外施用或由其组成。

为了预防和治疗目的，抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段可以以单次团注递送、通过延长时间段的连续递送(例如，连续经皮递送)或以重复施用方案(例如，每小时、每天、每周、每月或每年)施用于受试者。

在一些实施例中，本文所提供的方法包括施用治疗有效剂量的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。如上所定义的治疗有效剂量、剂量或量是指产生特定生理效应所需的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的量，所述生理效应例如预防或减轻伤口的一种或多种症状，或增强伤口愈合。在这种情况下，治疗有效剂量的确定通常基于动物模型研究，随后进行人临床试验并通过确定有效剂量和施用方案来指导，所述有效剂量和施用方案显著减少模型受试者中的伤口的发生或严重程度或增强伤口愈合。本公开的组合物的有效剂量根据许多不同的因素而变化，包含施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其它药物、治疗是防治性的还是治疗性的、以及组合物本身的比活性和其在个体中引发期望的应答的能力。通常，调整剂量方案以提供最佳治疗应答，即优化安全性和有效性。

在一些实施例中，抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的剂量介于约0.1μg至100mg/kg或1μg/kg至约50mg/kg或10μg至5mg/kg之间。在一些实施例中，抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的有效量介于约1μg/kg与约20mg/kg之间，介于约10μg/kg与约10mg/kg之间或介于约0.1mg/kg与约5mg/kg之间。本文所描述的抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段也可以以每千克(mpk)体重约0.001至约10毫克(mg)的剂量施用，以单剂量或两个或更多个剂量给药。对于对成人患者的施用，治疗有效量可以以每剂量介于0.2mg至800mg的范围的剂量施用，包含但不限于每剂量0.2mg、每剂量0.5mg、每剂量1mg、每剂量5mg、每剂量10mg、每剂量25mg、每剂量100mg、每剂量200mg和每剂量400mg，并且可以在治疗过程中施用一个或多个剂量。在一些实施例中，本文所描述的抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段的总日剂量可以在约1mg至约2g、约100mg至约1.5g或约200mg至约1200mg的范围内。

在一些实施例中，抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的剂量介于伤口的表面积的约0.1μg/cm

在一些实施例中，抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段或包括的组合物可以以约0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL或50mg/mL的浓度调配。浓度可以是0.1-1mg/mL、1-5mg/mL、5-10mg/mL或10-50mg/mL。在一些实施例中，所公开的抗体、片段或组合物可以以约0.05mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg或1mg的剂量施用。剂量的体积可以是约0.005mL、0.01mL、0.02mL、0.03mL、0.04mL、0.05mL、0.06mL、0.07mL、0.08mL、0.09mL或0.1mL。

本文所描述的抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段可以在一天的不同时间施用。在一个实施例中，剂量可以在晚上施用。在另一个实施例中，剂量可以在早上施用。剂量可以单次或多次施用，包含例如每周、每两周、每月或每年多次施用。在一些实施例中，将单剂量的抗神经酰胺抗体或抗体片段施用于有需要的受试者。在一些实施例中，患者可以接受两个或更多个剂量的抗神经酰胺抗体治疗。在一些实施例中，患者可以接受两个或更多个剂量的抗神经酰胺抗体治疗，其中连续剂量相隔至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少一周。在一些实施例中，患者可以接受两个或更多个剂量的抗神经酰胺抗体治疗，其中连续剂量间隔的时间段为至少一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少五周、至少六周、至少七周、至少八周、至少一个月、至少两个月或至少三个月。在一些实施例中，可以向有需要的患者施用两个或更多个剂量，间隔的时间段为约一周至约两周、约两周至约四周、约一个月至约两个月、约两个月至约四个月或约一个月至约六个月。在一些实施例中，施用的持续时间为至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少一周、至少两周、至少三周、至少一个月、至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少九个月、至少一年、至少两年、至少三年、至少四年或至少五年。在一些实施例中，施用可以是不规则的，如通过监测病症的临床症状所指示的。

主治临床医生可以改变包括抗神经酰胺抗体和其抗原结合片段的药物组合物的剂量，以在靶位点处维持期望的浓度。可以基于递送模式选择更高或更低的浓度。抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段可以在受试者一生期间的任何时间施用。施用可以发生在伤口愈合的炎性阶段、增殖阶段、重塑阶段或其组合期间。在一些实施例中，施用发生在伤口愈合的炎性阶段期间。在一些实施例中，施用发生在伤口愈合的增殖阶段期间。在一些实施例中，施用发生在伤口愈合的重塑阶段期间。

治疗方法和用途

在一些实施例中，本公开提供了治疗、预防或减轻受试者的伤口的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述伤口是慢性伤口。在一些实施例中，所述伤口是糖尿病伤口。

在一些实施例中，本公开提供了增强有需要的受试者的伤口愈合的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述伤口是慢性伤口。在一些实施例中，所述伤口是糖尿病伤口。

受试者

根据本文所公开的方法进行治疗的受试者包含那些具有伤口(例如，糖尿病伤口)或有发展伤口风险的受试者。具有伤口(例如，糖尿病伤口)的受试者可能患有早期或晚期疾病。

在一些实施例中，受试者是那些先前已经接受了伤口(例如，糖尿病伤口)的一种或多种治疗但对先前的治疗没有应答的受试者。在此类实施例中，“无应答”表示先前的治疗未能减轻和/或改善伤口(例如，糖尿病伤口)。在一些实施例中，先前的疗法可能已经显示出一些结果，但是可能没有达到期望的性能，或者可能在一段时间之后已经停止显示功效。

治疗读数

伤口愈合可以通过多种方法来测量。在一些实施例中，伤口愈合通过伤口的总表面积的变化来测量。在一些实施例中，伤口愈合通过伤口的主轴的长度(长度和宽度)的变化来测量。在一些实施例中，伤口愈合通过距伤口中心的伤口边缘距离来测量。在一些实施例中，伤口愈合通过伤口的周长的变化来测量。在一些实施例中，伤口愈合通过表面积与周长(S/P)比率的变化来测量。这些参数的评估可以通过多种方法进行，例如计算机辅助测面法。在一些实施例中，伤口愈合的程度通过随时间变化的值与这些参数中任何一个的初始值相比的百分比来表示。

提供了用抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段增强伤口愈合的方法。可以基于几个参数来表征、评估、测量和/或监测此类治疗的功效。

在一些实施例中，通过达到某个程度的伤口愈合的时间的减少来测量改善。例如，如果对照组中的伤口愈合需要25天并且治疗组中的伤口愈合只需要20天，那么通过此类测量，伤口愈合增强/加速了20％。在一些实施例中，通过在预设时间点伤口愈合的相对程度的增加来测量改善。例如，如果在受伤后第20天，治疗组达到平均50％的伤口愈合程度(例如，通过总表面积测量)，并且所述组仅达到平均40％的伤口愈合程度，则通过此类测量，伤口愈合增强/加速了25％。本领域技术人员将容易识别合适的对照组(例如，对照伤口)。在一些实施例中，除了抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段(例如，权利要求中所述的那些)之外，对照伤口接受相同的治疗。在一些实施例中，对照伤口接受标准护理治疗。在所有情况下，提及对照组意指所述性质(例如，增强的伤口愈合)是使用抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的结果。

在一些实施例中，与对照伤口相比，本文所提供的方法将受试者的伤口愈合增强至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，包含其间的所有范围和子范围，如根据预设程度的伤口愈合参数之一改善伤口所用的时间的减少所测量的。在一些实施例中，本文所提供的方法将伤口愈合增强至少10％。在一些实施例中，本文所提供的方法将伤口愈合增强至少20％。在一些实施例中，本文所提供的方法将伤口愈合增强至少30％。在一些实施例中，本文所提供的方法将伤口愈合增强至少50％。在一些实施例中，本文所提供的方法将伤口愈合增强至少70％。在一些实施例中，伤口愈合参数是伤口的总表面积、伤口的周长、伤口的S/P比率或距伤口中心的边缘距离。在一些实施例中，伤口愈合参数是伤口的总表面积。在一些实施例中，预设程度是约30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％减少。在一些实施例中，预设程度是50％。在一些实施例中，预设程度是95％。在一些实施例中，通过实现所述伤口的总表面积50％减少所用的时间的减少来测量所述伤口愈合的增强。在一些实施例中，通过实现所述伤口的总表面积95％减少所用的时间的减少来测量所述伤口愈合的增强。在一些实施例中，通过达到伤口的完全闭合所用的时间的减少来测量所述伤口愈合的增强。在一些实施例中，所述伤口是慢性伤口。在一些实施例中，所述伤口是糖尿病伤口。

在一些实施例中，与对照伤口相比，本文所提供的方法将受试者的伤口愈合增强至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍或至少10倍，包含其间的所有范围和子范围，如根据伤口愈合参数之一在预设时间点通过伤口愈合的相对程度的增加所测量的。在一些实施例中，本文所提供的方法将伤口愈合增强至少10％。在一些实施例中，本文所提供的方法将伤口愈合增强至少20％。在一些实施例中，本文所提供的方法将伤口愈合增强至少30％。在一些实施例中，本文所提供的方法将伤口愈合增强至少50％。在一些实施例中，本文所提供的方法将伤口愈合增强至少70％。在一些实施例中，伤口愈合参数是伤口的总表面积、伤口的周长、伤口的S/P比率或距伤口中心的边缘距离。在一些实施例中，伤口愈合参数是伤口的总表面积。在一些实施例中，预设时间点是受伤后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天、第20天、第21天、第22天、第23天、第24天、第25天、第26天、第27天、第28天、第29天或第30天。在一些实施例中，预设时间点是受伤后第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周、第7周、第8周、第9周、第10周、第11周、第12周、第13周、第14周、第15周、第16周、第17周、第18周、第19周或第20周的结束。在一些实施例中，预设时间点是受伤后第10天。在一些实施例中，预设时间点是受伤后第20天。在一些实施例中，预设时间点是受伤后第30天。在一些实施例中，通过在受伤后第10天所述伤口的总表面积的减少来测量所述伤口愈合的增强。在一些实施例中，通过在受伤后第20天所述伤口的总表面积的减少来测量所述伤口愈合的增强。在一些实施例中，通过在受伤后第30天所述伤口的总表面积的减少来测量所述伤口愈合的增强。在一些实施例中，所述伤口是慢性伤口。在一些实施例中，所述伤口是糖尿病伤口。

在一些实施例中，本公开的治疗在治疗浅表伤口，如皮肤伤口方面是有效的。在一些实施例中，本公开的治疗在治疗内部伤口，如可能由于外伤或外科手术而出现的伤口方面是有效的。

在一些实施例中，在损伤(例如，伤口)发生之后进行治疗。在一些实施例中，防治性地施用本公开的治疗，如在从事可能引起伤口的活动之前，或在外科手术程序之前。

实例

实例1：抗神经酰胺抗体加速小鼠糖尿病模型的伤口愈合。

为了研究抗神经酰胺抗体对糖尿病伤口愈合的作用，在MSU的核心机构中使用了标准化的基于穿孔活检的鼠表伤口模型。

在这项研究中，小鼠被分为四个实验组：

(a)1)应用抗神经酰胺抗体2A2(糖尿病+2A2)的糖尿病小鼠(6只动物)；

(b)2)不具有抗神经酰胺抗体2A2(糖尿病)的糖尿病小鼠(6只动物)；

(c)3)应用抗神经酰胺抗体2A2(对照+2A2)的对照小鼠(3只动物)；

(d)4)不具有抗神经酰胺抗体2A2(对照)的对照小鼠(5只动物)。

通过每4天IV注射1mg的2A2抗神经酰胺抗体或媒剂对照(PBS)，用5mm活检针将伤口引入对照(非糖尿病)和STZ诱导的糖尿病SKH1无毛小鼠的上背部。受伤后第0、1、4、8、10、12、13、16、20和25天伤口位点的代表性照片如图1A-图1B所示。

图2示出了每个实验组中的伤口愈合的平均速率，用病变随时间的大小表示。对于病变大小的标准化，每种情况下病变的原始大小设置为1。在糖尿病和非糖尿病小鼠两者中，2A2抗体的应用加速了伤口愈合过程，并且这种效果在糖尿病小鼠组中更显著。

图3A示出了在第10天以原始伤口大小的％计算的平均伤口闭合。在对照组和糖尿病组两者中，注射2A2的小鼠在10天之后比注射PBS媒剂对照的小鼠实现了更大程度的伤口闭合。

图3B示出了在每个实验组中，小鼠达到95％伤口闭合(与伤口的原始大小相比)所用的平均天数。在糖尿病小鼠组中，应用2A2抗体显著缩短了达到95％愈合所用的时间长度。

总的来说，这项研究证明了抗神经酰胺抗体的应用显著加速了伤口的愈合，并且尤其是糖尿病伤口。

研究方案：

以下是实例1中进行的动物研究的方案。

研究目的：当对经历链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病的雄性SKH1小鼠每4天静脉内(IV)施用一次时，检验抗神经酰胺抗体2A2对伤口愈合的作用。

将体重在20-25g之间的雄性SKH1小鼠驯化大约2周。将动物分为对照(C)和糖尿病诱导(D)小鼠。通过连续五天腹膜内注射链脲佐菌素(每公斤体重65mg)产生糖尿病。在最后一次注射之后两周，根据从足背静脉采集的血滴测量血糖并且通过血糖水平>300mg/dl来确定糖尿病。每天监测体重减轻、多尿、水和食物消耗，并根据动物的临床病状提供NPH胰岛素注射(0-2单位/天)。如先前所描述的，在糖尿病被确认之后引入伤口。

将动物随机分为2组，进行媒剂或2A2 IV注射治疗。

治疗从伤口引入的当天开始。持续每4天IV给药一次，直到伤口完全愈合(约30天)为止。对照(C)动物在糖尿病动物受伤的同一天受伤，并随机分成2组进行媒剂或2A2 IV注射治疗。在受伤当天开始IV治疗。持续每4天给药一次，直到伤口完全愈合(约15天)为止。2A2抗体的IV剂量为每4天1mg/25g小鼠。

外科手术后立即拍摄伤口测量照片，并且然后每隔一天拍摄，并计算愈合时间速率。在实验结束时，将伤口切除，固定并分析真皮层厚度、基质沉积、再血管化、免疫细胞浸润。

实例2：另外的实验验证。

用另外的小鼠受试者重复实例1中进行的实验。表3-6以及图3和5A-D提供了来自该实验的结果。

表3-结果

表4-结果

表5-结果

表6-结果

图4示出了每个实验组中的伤口愈合随时间的平均速率。Y轴表示伤口的大小，其中每个伤口的起始大小归一化为1。X轴表示天数。

图5A-D-是示出了实验组中的每个实验组的小鼠分别达到25％、50％、75％和90％愈合所用的平均天数的条形图。

该实验进一步验证了用抗神经酰胺抗体治疗小鼠在统计学上显著加速了伤口愈合，并且尤其是糖尿病伤口。

实例3：局部抗体施用

实例1-2中描述的抗体治疗加速伤口愈合被认为是由于伤口位置的局部神经酰胺信号传导作用。因此，预期局部施用本文所公开的抗神经酰胺抗体和/或其抗原结合片段将表现出与实例1-2中所描述的类似效果。这些抗体和抗原结合片段的效果将在如小鼠等动物模型上测试。实验将类似于实例1-2中所描述的实验进行，不同之处在于抗体将通过洗剂、保存剂或本领域技术人员已知的其它局部调配物局部施用。在与实例1-2中所描述的实验类似的另一个实验中，将通过皮下注射抗体或其抗原结合片段来治疗伤口。将根据实例1和2的方法测试如丙咪嗪等其它神经酰胺信号传导抑制剂的局部施用对伤口愈合的影响。预期用抗体和/或其抗原结合片段(或丙咪嗪)治疗的伤口将加速/改善对照和/或糖尿病动物的伤口愈合。

实例4：内部伤口

将进行另外的验证实验来证明当前所公开的治疗增强/加速内部伤口的能力。将在模型动物上进行实验，其中在对照和糖尿病受试者上造成内部伤口，并且在用媒剂/无媒剂、或用本公开的抗神经酰胺抗体或丙咪嗪治疗的受试者中随时间追踪内部伤口的愈合。将通过本领域技术人员已知的任何技术来追踪愈合，包含声谱图、MRI、CT或通过外科手术手段的视觉评估。

实例5：所公开的抗体和其抗原结合片段的另外的验证

本公开通过2A2抗体的验证实验举例说明了抗神经酰胺抗体和/或其抗原结合片段的作用。将使用本说明书中公开的另外的抗体和抗原结合片段中的任何一种，或能够与神经酰胺结合或抑制富含神经酰胺的平台形成的其它抗体/抗原结合片段来重复实例1-2的实验。例如，将使用6b5鼠(US2019-0389970，其通过引用并入本文)和6b5人源化(PCT/US2021/022914和其对应的美国临时62/991,232，两者通过引用并入本文)抗体和其片段来重复实例1-2中所描述的伤口愈合实验。

另外编号的实施例

在以下编号的实施例中提供了本发明的另外的实施例：

实施例1.一种治疗或预防有需要的受试者的伤口的方法，所述方法包括向所述受试者施用抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。

实施例2.一种增强有需要的受试者的伤口愈合的方法，所述方法包括向所述受试者施用抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。

实施例3.根据实施例1或2所述的方法，其中所述伤口是慢性伤口或糖尿病伤口。

实施例4.根据实施例1或2所述的方法，其中所述伤口是慢性伤口。

实施例5.根据实施例1或2所述的方法，其中所述伤口是糖尿病伤口。

实施例5.1根据实施例1或2所述的方法，其中所述伤口是外部伤口。

实施例5.2根据实施例1或2所述的方法，其中所述伤口是内部伤口。

实施例5.3根据实施例1或2所述的方法，其中所述伤口是内皮组织。

实施例6.根据实施例1至5.3中任一项所述的方法，其中施用途径选自由以下组成的组：局部施用、病灶内施用、皮下施用、经皮施用、肌内施用、静脉内施用和肠胃外施用。

实施例7.根据实施例6所述的方法，其中所述施用途径是局部施用。

实施例8.根据实施例6所述的方法，其中所述施用途径是静脉内施用。

实施例9.根据实施例1至8中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段以单剂量施用。

实施例10.根据实施例1至8中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段以两个或更多个剂量施用。

实施例11.根据实施例10所述的方法，其中连续剂量的施用间隔至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天或至少一周。

实施例12.根据实施例10或11所述的方法，其中所述施用的持续时间为至少一周、至少两周、至少三周或至少四周。

实施例13.根据实施例1至12中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段在伤口愈合的炎性阶段期间施用。

实施例14.根据实施例1至13中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段在伤口愈合的增殖阶段期间施用。

实施例15.根据实施例1至14中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段在伤口愈合的重塑阶段期间施用。

实施例16.根据实施例1至15中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是抗体。

实施例17.根据实施例1至15中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。

实施例18.根据实施例1至17中任一项所述的方法，其中与对照伤口相比，所述方法将伤口愈合增强至少10％、至少20％、至少30％、至少50％或至少70％。

实施例19.根据实施例18所述的方法，其中通过在受伤后第10天、第20天或第30天所述伤口的总表面积的减少来测量所述伤口愈合的增强。

实施例20.根据实施例19所述的方法，其中在受伤后第10天测量所述伤口愈合的增强。

实施例21.根据实施例18所述的方法，其中通过实现所述伤口的总表面积50％、70％、90％、95％或100％减少所用的时间的减少来测量所述伤口愈合的增强。

实施例22.根据实施例21所述的方法，其中在所述伤口的总表面积95％减少时测量所述伤口愈合的增强。

实施例23.根据实施例1至22中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段在所述伤口的一种或多种症状发作之前施用。

实施例24.根据实施例1至22中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段在所述伤口的一种或多种症状发作之后施用。

实施例25.根据实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包括可变重链(VH)和可变轻链(VL)，

a)其中所述VH包括：重链互补决定区1(HCDR1)，所述HCDR1包括GYTFTDHTIH(SEQID NO:1)的氨基酸序列；HCDR2，所述HCDR2包括YNYPRDGSTKYNEKFKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列；以及HCDR3，所述HCDR3包括GFITTVVPSAY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列，并且

b)其中所述VL包括：轻链互补决定区1(LCDR1)，所述LCDR1包括RASKSISKYLA(SEQID NO:4)的氨基酸序列；LCDR2，所述LCDR2包括SGSTLQS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；以及LCDR3，所述LCDR3包括QQHNEYPWT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。

实施例26.根据实施例1至25中任一项所述的方法，其中所述VH包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且其中所述VL包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

实施例27.根据实施例1至26中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是6B5抗体。

实施例28.根据实施例1至26中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是6B5 scFv。

实施例29.根据实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包括可变重链(VH)和可变轻链(VL)，

a)其中所述VH包括：重链互补决定区1(HCDR1)，所述HCDR1包括NYWMH(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列；HCDR2，所述HCDR2包括AIYPGDSDTSYNQKFKG(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列；以及HCDR3，所述HCDR3包括LYYGYD(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列，并且

b)其中所述VL包括：轻链互补决定区1(LCDR1)，所述LCDR1包括KSSQSLIDSDGKTFLN(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列；LCDR2，所述LCDR2包括LVSKLDS(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列；以及LCDR3，所述LCDR3包括WQGTHFPYT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列。

实施例30.根据实施例1至29中任一项所述的方法，其中所述VH包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列，并且其中所述VL包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列。

实施例31.根据实施例1至24和29至30中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是2A2抗体。

实施例32.根据实施例1至24和29至30中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是2A2 scFv。

实施例33.根据实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包括可变重链(VH)和可变轻链(VL)，

a)其中所述VH包括：重链互补决定区1(HCDR1)，所述HCDR1包括选自由SEQ ID NO:1和43组成的组的氨基酸序列或由其组成；HCDR2，所述HCDR2包括选自由SEQ ID NO:44-47组成的组的氨基酸序列或由其组成；以及HCDR3，所述HCDR3包括GFITTVVPSAY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列或由其组成，并且

b)其中所述VL包括：轻链互补决定区1(LCDR1)，所述LCDR1包括RASKSISKYLA(SEQID NO:4)的氨基酸序列或由其组成；LCDR2，所述LCDR2包括SGSTLQS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列或由其组成；以及LCDR3，所述LCDR3包括QQHNEYPWT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列或由其组成。

实施例34.根据实施例33所述的方法，其中所述HCDR1包括GYTFTDHTIH(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列或由其组成，并且所述HCDR2包括YNYPRDGSTKYNEKFQG(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列或由其组成。

实施例35.根据实施例33所述的方法，其中所述HCDR1包括GYTFTDHTIH(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列或由其组成，并且所述HCDR2包括YNYPREGSTKYNEKFQG(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列或由其组成。

实施例36.根据实施例33所述的方法，其中所述HCDR1包括GYTFTDHTIH(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列或由其组成，并且所述HCDR2包括YNYPRDVSTKYNEKFQG(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列或由其组成。

实施例37.根据实施例33所述的方法，其中所述HCDR1包括GYTFTDHTIH(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列或由其组成，并且所述HCDR2包括YNYPRDGSTKYAEKFQG(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或由其组成。

实施例38.根据实施例33所述的方法，其中所述HCDR1包括GYTFTDHTMH(SEQ IDNO:43)的氨基酸序列或由其组成，并且所述HCDR2包括YNYPRDGSTKYNEKFQG(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列或由其组成。

实施例39.根据实施例33所述的方法，其中所述HCDR1包括GYTFTDHTMH(SEQ IDNO:43)的氨基酸序列或由其组成，并且所述HCDR2包括YNYPREGSTKYNEKFQG(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列或由其组成。

实施例40.根据实施例33所述的方法，其中所述HCDR1包括GYTFTDHTMH(SEQ IDNO:43)的氨基酸序列或由其组成，并且所述HCDR2包括YNYPRDVSTKYNEKFQG(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列或由其组成。

实施例41.根据实施例33所述的方法，其中所述HCDR1包括GYTFTDHTMH(SEQ IDNO:43)的氨基酸序列或由其组成，并且所述HCDR2包括YNYPRDGSTKYAEKFQG(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或由其组成。

实施例42.根据实施例33所述的方法，其中所述VH包括与SEQ ID NO:48至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成，并且所述VL包括与SEQ IDNO:53至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成。

实施例43.根据实施例33所述的方法，其中所述VH包括与SEQ ID NO:48至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成，并且所述VL包括与SEQ IDNO:54至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成。

实施例44.根据实施例33所述的方法，其中所述VH包括与SEQ ID NO:48至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成，并且所述VL包括与SEQ IDNO:55至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成。

实施例45.根据实施例33所述的方法，其中所述VH包括与SEQ ID NO:49至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成，并且所述VL包括与SEQ IDNO:53至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成。

实施例46.根据实施例33所述的方法，其中所述VH包括与SEQ ID NO:49至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成，并且所述VL包括与SEQ IDNO:54至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成。

实施例47.根据实施例33所述的方法，其中所述VH包括与SEQ ID NO:49至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成，并且所述VL包括与SEQ IDNO:55至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成。

实施例48.根据实施例33所述的方法，其中所述VH包括与SEQ ID NO:50至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成，并且所述VL包括与SEQ IDNO:53至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成。

实施例49.根据实施例33所述的方法，其中所述VH包括与SEQ ID NO:50至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成，并且所述VL包括与SEQ IDNO:54至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成。

实施例50.根据实施例33所述的方法，其中所述VH包括与SEQ ID NO:50至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成，并且所述VL包括与SEQ IDNO:55至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成。

实施例51.根据实施例33所述的方法，其中所述VH包括与SEQ ID NO:51至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成，并且所述VL包括与SEQ IDNO:53至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成。

实施例52.根据实施例33所述的方法，其中所述VH包括与SEQ ID NO:51至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成，并且所述VL包括与SEQ IDNO:54至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成。

实施例53.根据实施例33所述的方法，其中所述VH包括与SEQ ID NO:51至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成，并且所述VL包括与SEQ IDNO:55至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成。

实施例54.根据实施例33所述的方法，其中所述VH包括与SEQ ID NO:52至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成，并且所述VL包括与SEQ IDNO:53至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成。

实施例55.根据实施例33所述的方法，其中所述VH包括与SEQ ID NO:52至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成，并且所述VL包括与SEQ IDNO:54至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成。

实施例56.根据实施例33所述的方法，其中所述VH包括与SEQ ID NO:52至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成，并且所述VL包括与SEQ IDNO:55至少90％、至少95％、至少97％相同或100％相同的氨基酸序列或由其组成。

实施例57.根据实施例33至56中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是人源化6B5(h6B5)抗体。

实施例58.根据实施例33至56中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是h6B5 scFv。

实施例59.根据实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包括可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述VH包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列，并且其中所述VL包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列。

实施例60.根据实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包括可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述VH包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列，并且其中所述VL包括SEQ ID NO:55的氨基酸序列。

实施例61.根据实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包括可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述VH包括SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且其中所述VL包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列。

实施例62.根据实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包括可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述VH包括SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且其中所述VL包括SEQ ID NO:54的氨基酸序列。

实施例63.根据实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包括可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述VH包括SEQ ID NO:50的氨基酸序列，并且其中所述VL包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列。

实施例64.根据实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包括可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述VH包括SEQ ID NO:50的氨基酸序列，并且其中所述VL包括SEQ ID NO:54的氨基酸序列。

实施例65.根据实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包括可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述VH包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列，并且其中所述VL包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列。

实施例66.根据实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包括可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述VH包括SEQ ID NO:52的氨基酸序列，并且其中所述VL包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列。

实施例67.根据实施例59至66中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是人源化抗体。

实施例68.根据实施例59至66中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段是人源化scFv。

实施例69.一种治疗或预防有需要的受试者的伤口的方法，所述方法包括向所述受试者施用丙咪嗪或其盐。

实施例70.一种增强有需要的受试者的伤口愈合的方法，所述方法包括向所述受试者施用丙咪嗪或其盐。

实施例71.根据实施例70或71所述的方法，其中所述伤口是慢性伤口或糖尿病伤口。

实施例72.根据实施例70或71所述的方法，其中所述伤口是慢性伤口。

实施例73.根据实施例70或712所述的方法，其中所述伤口是糖尿病伤口。

实施例74.根据实施例70至73中任一项所述的方法，其中施用途径选自由以下组成的组：局部施用、病灶内施用、皮下施用、经皮施用、肌内施用、静脉内施用和肠胃外施用。

实施例75.根据实施例74所述的方法，其中所述施用途径是局部施用。

实施例76.根据实施例74所述的方法，其中所述施用途径是静脉内施用。

实施例77.根据实施例70至76中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段以单剂量施用。

实施例78.根据实施例1至8中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段以两个或更多个剂量施用。

实施例79.根据实施例78所述的方法，其中连续剂量的施用间隔至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天或至少一周。

实施例80.根据实施例78或79所述的方法，其中所述施用的持续时间为至少一周、至少两周、至少三周或至少四周。

实施例81.根据实施例70至80中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段在伤口愈合的炎性阶段期间施用。

实施例82.根据实施例70至81中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段在伤口愈合的增殖阶段期间施用。

实施例83.根据实施例70至82中任一项所述的方法，其中所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段在伤口愈合的重塑阶段期间施用。

通过引用并入

出于所有目的，本文中引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请均通过引用的方式完全并入本文。然而，对本文所引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请的提及不被视为并且不应当被视为对其构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分的承认或任何形式的暗示。

序列表

<110> 纪念斯隆-凯特琳癌症中心

密歇根州立大学董事会

　　　癌症及相关疾病纪念医院

　　　斯隆-凯特林癌症研究院

<120> 用抗神经酰胺抗体增强伤口愈合

<130> CERA-020/00US 328726-2101

<160> 55

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Thr Ile His

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 2

Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 1015

Gly

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 3

Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 4

Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 5

Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 6

Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His

202530

Thr Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

354045

Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

505560

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65707580

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

859095

Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 8

Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 1015

Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr

202530

Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile

354045

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65707580

Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp

859095

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6C8 HCDR1

<400> 9

Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn

1 5 10

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6C8 HCDR2

<400> 10

Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

1 5 1015

Gly

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6C8 HCDR3

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Arg Cys Tyr Tyr Gly Leu Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6C8 LCDR1

<400> 12

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6C8 LCDR2

<400> 13

Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp

1 5

<210> 14

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6C8 LCDR3

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Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr

1 5

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<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6C8 VH

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

202530

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

354045

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

505560

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65707580

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

859095

Thr Arg Arg Cys Tyr Tyr Gly Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6C8 VL

<400> 16

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Arg Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 1015

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr

202530

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

354045

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Ser Arg Phe Ser

505560

Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65707580

Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro

859095

Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7B10 HCDR1

<400> 17

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 18

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7B10 HCDR2

<400> 18

Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Gln Phe Lys Asp

1 5 1015

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7B10 HCDR3

<400> 19

Gly Gly Tyr Tyr Gly Phe Ala Tyr

1 5

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7B10 LCDR1

<400> 20

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr

1 5 10

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7B10 LCDR2

<400> 21

Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7B10 LCDR3

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Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7B10 VH

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

202530

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

354045

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe

505560

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65707580

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Tyr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 24

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7B10 VL

<400> 24

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 1015

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

202530

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

354045

Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

505560

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65707580

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

859095

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 9H10 HCDR1

<400> 25

Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly Val His

1 5 10

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 9H10 HCDR2

<400> 26

Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser

1 5 1015

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 9H10 HCDR3

<400> 27

Asn Tyr Gly Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 9H10 LCDR1

<400> 28

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His

1 5 10

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 9H10 LCDR2

<400> 29

Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 9H10 LCDR3

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Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe Thr

1 5

<210> 31

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 9H10 VH

<400> 31

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Val Gln Pro Ser Ser Leu

1 5 1015

Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val

202530

His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val

354045

Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg

505560

Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met

65707580

Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn

859095

Tyr Gly Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 9H10 VL

<400> 32

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 1015

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser

202530

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

354045

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65707580

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe

859095

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 33

Asn Tyr Trp Met His

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<210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 34

Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 1015

Gly

<210> 35

<211> 6

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 35

Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asp

1 5

<210> 36

<211> 16

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 36

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ile Asp Ser Asp Gly Lys Thr Phe Leu Asn

1 5 1015

<210> 37

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 37

Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser

1 5

<210> 38

<211> 9

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 38

Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 39

<211> 115

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 39

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

202530

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Val Gln Gly Leu Glu Trp Ile

354045

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

505560

Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Phe

65707580

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Thr Gly Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 40

<211> 112

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 40

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 1015

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ile Asp Ser

202530

Asp Gly Lys Thr Phe Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

354045

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

505560

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65707580

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

859095

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 41

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化2A2（h2A2）重链

<400> 41

Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly

1 5 1015

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

202530

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

354045

Thr Asn Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

505560

Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ser Tyr Asn

65707580

Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser

859095

Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asp Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

130 135 140

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

145 150 155 160

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

165 170 175

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

180 185 190

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

195 200 205

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

210 215 220

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

225 230 235 240

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

245 250 255

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

260 265 270

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

275 280 285

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

290 295 300

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

305 310 315 320

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

325 330 335

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

340 345 350

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

355 360 365

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

370 375 380

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

385 390 395 400

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

405 410 415

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

420 425 430

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

435 440 445

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 42

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化2A2（h2A2）轻链

<400> 42

Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro

1 5 1015

Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro

202530

Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

354045

Leu Ile Asp Ser Asp Gly Lys Thr Phe Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg

505560

Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp

65707580

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

859095

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

165 170 175

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

195 200 205

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

210 215 220

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 43

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h6B5 HCDR1 (IH-MH)

<400> 43

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Thr Met His

1 5 10

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h6B5 HCDR2 (DG)

<400> 44

Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Gln

1 5 1015

Gly

<210> 45

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h6B5 HCDR2 (DG-EG)

<400> 45

Tyr Asn Tyr Pro Arg Glu Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Gln

1 5 1015

Gly

<210> 46

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h6B5 HCDR2 (DG-DV)

<400> 46

Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Val Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Gln

1 5 1015

Gly

<210> 47

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h6B5 HCDR2 (NE-AE)

<400> 47

Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe Gln

1 5 1015

Gly

<210> 48

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h6B5 VH-1

<400> 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His

202530

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

354045

Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe

505560

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65707580

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h6B5 VH-2

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His

202530

Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

354045

Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

505560

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65707580

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 50

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h6B5 VH-3

<400> 50

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His

202530

Thr Ile His Trp Met Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

354045

Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

505560

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65707580

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 51

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h6B5 VH-4

<400> 51

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His

202530

Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

354045

Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Glu Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

505560

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65707580

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 52

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h6B5 VH-5

<400> 52

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His

202530

Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

354045

Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Val Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

505560

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65707580

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 53

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h6B5 VL-1

<400> 53

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 1015

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr

202530

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

354045

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65707580

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<210> 54

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h6B5 VL-2

<400> 54

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1 5 1015

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr

202530

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354045

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505560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65707580

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 55

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h6B5 VL-3

<400> 55

Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 1015

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr

202530

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

354045

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65707580

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp

859095

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105