刺梨多糖、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及刺梨多糖、其制备方法及应用。

背景技术

刺梨属于多年生的落叶灌木植物，主要生长在中国西南部的偏远山区，特别是贵州省分布最为广泛。刺梨是一种可食用的野生水果，具有强烈的香气，松脆的质地和略带酸味的涩味。

多糖是一种在生物中广分存在的化合物，其结构复杂，是生物体内生物活性不可替代的生命大分子物质。实际上，多糖通过大量单糖的脱水缩合反应形成醛基或酮基，与天然大分子一起，形成糖苷。多糖无处不在，几乎存在于各种生物中，例如动物、植物、微生物和病毒，充斥在大自然的角角落落。多糖具有多种生物学功能，如能量储存和抗原决定因素结构支持，此外，多糖还具有保护生物膜、抗肿瘤等作用。迄今为止，从天然产物中分离出大量多糖，如来自植物的党参多糖、枸杞多糖、百合多糖，来自微生物的红曲霉多糖、黄原胶、普鲁兰多糖，来自动物的糖原、甲壳素、肝素、透明质酸等。研究人员通过研究多糖活性，揭示多糖生物学作用，发现多糖对人体细胞的危害较小，服用时可以大大减少对身体的损失。大量试验研究证明了多糖在生命有机体中还有其他重要的角色，例如，多糖是一种重要的信息分子，影响着每一种生命活动，多糖及其衍生物还具有降血脂(Sima et al.,2018)、作为抗凝血剂(Yu et al.,2018)等特殊的生物学功能。

选择合适的方法提高多糖的得率是多糖的基础与核心问题，对多糖药理活性有着重要意义。常用的传统方法是溶剂法，具特点是成本低廉和操作简单，但同时也具有时间长、得率低等缺点。例如热水提取法，是多糖的提取手段中最为传统的，但在提取过程中，提取温度、提取次数、提取时间和液料比等因素都会影响提取效率。此外，还有利用碱提取法来提取含有糖酸酸或者是酸性的多糖。然而糖苷键容易在碱性条件下断裂，因此在提取过程中需要加以保护，如充入氮气或者加入测氨化钢等。

发明内容

本发明旨在从刺梨中提取多糖，并提高多糖得率，同时旨在提供刺梨多糖在生物活性中的新应用。

本发明的技术方案如下：

一种刺梨多糖的制备方法，步骤如下：

将刺梨洗净烘干，粉碎过筛，置于回流瓶中，加入石油醚，在60℃条件下回流加热4h，离心取沉淀，干燥；向沉淀中加15倍量的水，在80℃条件下煎煮2.5h；然后重复上述加水煎煮过程一次，离心，合并两次滤液；将滤液加热浓缩，加入4倍体积的乙醇，边加边搅拌，静置过夜；收集沉淀，冷冻干燥，获得深棕色固体，即刺梨多糖粗品；除去刺梨多糖粗品中的蛋白质；然后加入3倍体积的乙醇，混合均匀，置于4℃条件下静置24h，离心收集沉淀物，冲洗，干燥，获得刺梨多糖。

上述制备方法中，采用Sevag法除去刺梨多糖中的蛋白质，步骤如下；

配制浓度为50mg/mL的刺梨粗多糖溶液，加入Sevag混合液(正丁醇：三氯甲烷＝1:4)；加热搅拌，静置分层后，将混合液进行离心，收集最上层的糖液；其中，刺梨粗多糖溶液与Sevag混合液的体积比为5:1。

本发明提供了由上述方法制备的刺梨多糖。

在本发明中，所述刺梨多糖至少含有如下多糖成分：岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。

上述各多糖成分在总多糖中的占比选自如下比例：

岩藻糖0.33～0.82％、阿拉伯糖5.14～15.86％、半乳糖6.30～21.59％、葡萄糖31.61～61.96％、木糖1.99～2.46％、甘露糖0.76～1.48％、半乳糖醛酸22.10～28.85％和葡萄糖醛酸1.01～2.47％；

上述多糖成分占比进一步优选为：

岩藻糖0.73％、阿拉伯糖12.97％、半乳糖19.29％、葡萄糖32.22％、木糖1.99％、甘露糖1.48％、半乳糖醛酸28.85％和葡萄糖醛酸2.47％；或，岩藻糖0.33％、阿拉伯糖5.14％、半乳糖6.30％、葡萄糖61.96％、木糖2.40％、甘露糖0.76％、半乳糖醛酸22.10％和葡萄糖醛酸1.01％；或，岩藻糖0.82％、阿拉伯糖15.86％、半乳糖21.59％、葡萄糖31.61％、木糖2.46％、甘露糖1.15％、半乳糖醛酸24.32％和葡萄糖醛酸2.19％。

本发明提供了上述刺梨多糖在制备具有抗氧化作用的药物中的应用。

本发明提供了上述刺梨多糖在制备具有免疫调节作用的药物中的应用。

本发明提供了上述刺梨多糖在制备具有抗炎作用的药物中的应用。

本发明提供了上述刺梨多糖在制备具有促进细胞增殖作用的药物中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明的方法可使制备的刺梨多糖中总多糖含量高达15％以上，所制备的刺梨多糖包含岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等多糖成分，且在抗氧化、免疫调节、抗炎以及促进细胞增殖等方面展现出了较好的生物活性，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为刺梨多糖的液相色谱图；

图2为刺梨多糖的DPPH自由基清除能力；其中，最上方的曲线为Vc；

图3为刺梨多糖的羟自由基清除能力；其中，最上方的曲线为Vc；

图4为刺梨多糖的ABTS+自由基清除能力；

图5为刺梨多糖的总抗体氧化能力；其中，从上往下第二条曲线为Vc；

图6为刺梨多糖对RAW 264.7细胞增殖实验结果；其中，横坐标各数值下的柱状图中，从左至右依次为RTP1、RTP2和RTP3；

图7为刺梨多糖对LPS刺激的RAW 264.7细胞增殖实验结果；其中，横坐标各数值下的柱状图中，从左至右依次为RTP1、RTP2和RTP3；

图8为刺梨多糖对RAW 264.7细胞分泌NO含量的实验结果；其中，横坐标各数值下的柱状图中，从左至右依次为RTP1、RTP2和RTP3；

图9为刺梨多糖对LPS刺激的RAW 264.7细胞分泌IL-6含量实验结果；其中，横坐标各数值下的柱状图中，从左至右依次为RTP1、RTP2和RTP3；

图10为刺梨多糖对脾脏(a)和血清(b)中标记物(IL-1β)水平的影响；其中，横坐标各数值下的柱状图中，从左至右依次为RTP1、RTP2和RTP3；

图11为刺梨多糖对脾脏(a)和血清(b)中标记物(IL-2)水平的影响；其中，横坐标各数值下的柱状图中，从左至右依次为RTP1、RTP2和RTP3；

图12为刺梨多糖对脾脏(a)和血清(b)中标记物(IL-10)水平的影响；其中，横坐标各数值下的柱状图中，从左至右依次为RTP1、RTP2和RTP3；

图13为通过HE染色获得不同组小鼠脾脏切片的组织学细节；其中，黑色箭头代表髓外造血；黄色箭头代表多核巨细胞；蓝色箭头代表实质细胞坏死；红色箭头代表炎症亲润；

图14为刺梨多糖对肝脏(a)和血清(b)中标记物(TNF-α)水平的影响；其中，横坐标各数值下的柱状图中，从左至右依次为RTP1、RTP2和RTP3；

图15为刺梨多糖对肝脏(a)和血清(b)中标记物(IL-6)水平的影响；其中，横坐标各数值下的柱状图中，从左至右依次为RTP1、RTP2和RTP3；

图16为通过HE染色获得不同组小鼠肝脏切片的组织学细节；其中，黑色箭头代表血管壁；黄色箭头代表细胞核收缩与核膜溶解；蓝色箭头代表造血灶；红色箭头代表凋亡细胞聚集；

图17为刺梨多糖对肺组织中标记物(IL-6)水平的影响；其中，横坐标各数值下的柱状图中，从左至右依次为RTP1、RTP2和RTP3；

图18为刺梨多糖对LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺部MPO含量的影响；其中，横坐标各数值下的柱状图中，从左至右依次为RTP1、RTP2和RTP3；

图19为通过HE染色获得不同组小鼠肺脏切片的组织学细节；其中，黑色箭头代表肺泡；黄色箭头代表凋亡细胞聚集；蓝色箭头代表造血灶；红色箭头代表炎细胞浸润、实质细胞坏死。

具体实施方式

本发明所采用的其它材料，如无特殊声明，均可通过市售渠道获得。本发明所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

1、刺梨多糖提取

将新鲜的刺梨果实用蒸馏水洗净后，置于40℃的干燥箱中烘干，将100g干燥后的刺梨使用破碎机粉碎，过80目筛，置于回流瓶中，加入适量石油醚60℃回流加热4h，400rpm离心，取沉淀，置于干燥箱中干燥，加15倍量蒸馏水，80℃下煎煮2.5h，重复一次，4000rpm离心后，合并两次滤液。加热浓缩至200mL，加入四倍体积的无水乙醇，边加边搅拌，静置过夜。收集沉淀，冷冻干燥，得深棕色固体，碾成粉末，放入干燥器，获得刺梨多糖粗品，备用。将刺梨多糖粗品采用Sevag法除多糖中多余蛋白质。配制浓度为50mg/mL的刺梨粗多糖溶液300mL，加入60mL Sevag混合液(正丁醇：三氯甲烷＝1:4)。加热搅拌45min，静置分层后，将混合液进行离心，4000rpm/15min，收集最上层的糖液。连续重复8次上述操作。去除蛋白质后的刺梨粗多糖溶液加入3倍体积的无水乙醇混合均匀后置于4℃条件下静置24h，4000rpm离心15min，收集沉淀物，并用蒸馏水冲洗，置于40℃鼓风干燥机去除多余的乙醇和水分，得到刺梨多糖。刺梨多糖采用AB-8大孔树脂进行脱色处理，树脂与提取液的体积比为1:6，37℃水浴中振荡处理8h。

本发明共采用了三种刺梨，编号刺梨1(贵州遵义市绥阳县野生刺梨)、刺梨2(青岛市浮山野生刺梨)和刺梨3(贵州贵定县贵农5号品种)，并根据上述方法提取获得三种刺梨多糖，即RTP1、RTP2和RTP3。采用苯酚-硫酸法测定三种刺梨中的多糖含量，经检测，RTP1的得率为15.84％，RTP2的得率为17.21％，RTP3的得率为16.32％。

2、单糖组成测定

采用柱前衍生化HPLC法测定刺梨多糖的单糖组成，步骤如下；

(1)刺梨多糖酸水解

分别称取20mg的RTP1、RTP2、RTP3于安瓿瓶中，分别加入浓度为2mol/L的三氟乙酸(TFA)溶液4mL，之后，使用酒精喷灯封口，置于105℃的环境下孵育6h。孵育完成冷却至室温，将三种RRT多糖水解液与适量的甲醇混合后，减压旋转蒸干，再加入适量的甲醇，减压浓缩，重复5次以完全去除残留的三氟乙酸。

(2)衍生化

将RRT多糖水解物冷冻干燥，取干燥的RRT多糖水解物置于烧杯中，加入0.5mL吡啶和10mg盐酸羟胺，在95℃条件震荡反应30min，然后自然冷却。反应产物加入0.5mL乙酸酐，置于95℃条件下进行乙酰化反应，35min后得到腈乙酸酯衍生物。同样地，将所有的单糖标准品也进行腈乙酸酯衍生化。最后将水相稀释到合适的浓度，于高效液相色谱仪进样分析。

分别精密称取各标准单糖1mmol/L，置于10mL的容量瓶中，加入0.3mol/L的NaOH溶液至刻度，作为各单糖标准品溶液。精密量取相同体积的各种单糖储备液，混匀，作为单糖标准品混合溶液。将上述各溶液分别精密量取100μL加入试管中，与100μL0.5mol/L的PMP甲醇溶液漉匀，其余操作同上。

(3)色谱条件

色谱柱：Phenomenon Luna C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈：磷酸缓冲盐(50mM，pH 6.8,)＝22:78；流速；1.0mL/min；进样体积：10μL；柱温：30℃；检测波长：250nm。

经完全酸水解后，将多糖水解产物衍生物的保留时间与单糖标准品衍生物的保留时间进行对比，即可推断出三种RTP多糖的单糖组成。图1为多糖水解产物衍生物的液相色谱图；表1反映了单糖标准品中各种单糖的出峰时间；表2反映了各刺梨多糖中的单糖含量。试验结果如下：

RTP1、RTP2、RTP3主要色谱峰的出峰时间分别为3.692min，7.7837min，9.6503min，11.367min，13.5003min，14.5587min，31.767min，33.4837min，即各组分水解产物主要色谱峰为Fuc(岩藻糖)、Ara(阿拉伯糖)、Gal(半乳糖)、Glc(葡萄糖)、Xyl(木糖)、Man(甘露糖)、Gal-UA(半乳糖醛酸)、Glc-UA(葡萄糖醛酸)。由此可知，各RRT多糖大部分由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸组成，且每种多糖的单糖含量不同。

表1

由表2可知，三种刺梨多糖中均含有上述几种多糖成分。其中，在RTP2中，Glc含量较高，但其它成分含量相对较低。与RTP2相比，RTP1和RTP3除了Glc低于RTP2外，其它成分均高于RTP2。

表2

一、体外活性研究

1、抗氧化能力评价

(1)DPPH自由基清除

DPPH·很稳定，DPPH用无水乙醇溶解后，其DPPH乙醇溶液在517nm有最高的吸光值，并且吸光度与浓度呈线性关系。当加入具有清除作用的试剂后，可以与DPPH发生还原等作用，使其数目变少，样品颜色变淡，因而吸光度降低，借此可以评价样品的抗氧化能力。

用无水乙醇配制浓度为0.05mmol/L的DPPH乙醇溶液备用。分别将1mL不同浓度(0、2.0、4.0、8.0、10.0mg/mL)的RTP1、RTP2、RTP3和抗坏血酸(Vc)溶液置于试管中，分别加入2mLDPPH溶液，使用涡旋仪混匀，置于室温下避光静置30min，之后测量混合液517nm处吸光度，记录吸光度值，记为A

试验结果如图2所示：

抗坏血酸(Vc)为天然抗氧化剂、食品添加剂，常常作为抗氧化实验中的阳性对照；由图2可知，RTP1-3清除DPPH自由基能力随着浓度的升高逐渐增加，RTP1和RTP3效果相似，且高于RTP2，且在10mg/mL时达到最高为57.6％，而RTP3的DPPH清除能力在最高浓度即10mg/mL时达到最高的47.7％，说明三种RTP多糖均具有较好的DPPH清除能力。

(2)羟自由基清除

羟自由基经常存在于机体生命活动代谢中形成，有极强的氧化能力。同样地，使用Fe

配制浓度为70mmol/L的FeSO

上述公式中，A

试验结果如图3所示：

各浓度RTP1-3均有清除羟自由基能力，且呈现浓度依赖的关系，且在10mg/mL时，三种RTP多糖的对羟自由基清除能力均达到最高，其中RTP1的对羟自由基的清除效果最好，达到了95.4％；同样地，RTP2和RTP3也在10mg/mL时，达到各自最大羟自由基清除率，分别为57.3％和74.4％。说明三种RTP多糖均对羟自由基有较好的清除能力。

(3)ABTS+自由基清除

ABTS可与过硫酸钾反应，生成ABTS自由基，显绿色，同样地，ABTS自由基在734nm有最大吸收，所以，检测734nm的吸光度，可以测定的其浓度。多糖加入到ABTS自由基溶液后，如果734nm的吸光度降低，则说明该物质具有自由基清除活性。

用蒸馏水配制浓度为2mmol/L的ABTS溶液和浓度为70mmol/L的K

分别将10L的不同浓度的RTP1、RTP2、RTP3和抗坏血酸加入96孔细胞板中，每个浓度重复三个孔，向每个孔加入200L孵育好的ABTS+·溶液，混匀6min后检测各孔在734nm处的吸光度(A

试验结果如图4所示：

随RTP1、RTP2、RTP3浓度的升高，其对ABTS+自由基清除能力逐渐提高，且在10mg/mL时达到最高为61.52％、49.2％、41.5％，其中RTP1对ABTS+自由基清除能力最高，表明三种刺梨多糖可以增强RTP1、RTP2、RTP3对ABTS+自由清除能力；说明RTP1、RTP2、RTP3清除ABTS+自由基能力较强。

(4)总抗体氧化能力检测(FRAP法)

铁氰化钾的Fe

用蒸馏水配制浓度为0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mmol/L的FeSO

试验结果如图5所示：

当浓度为10.0mg/mL时，RTP总还原能力达到1级以上。随着浓度的升高，总还原能力逐渐提高，且RTP1和RTP3在10mg/mL时最高达到2级，而RTP2总还原能力弱于其他品种，最高仅能达到1级。

2、细胞免疫调节、抗炎作用测定

(1)准备工作

A、刺梨多糖溶液的配制

用DMEM培养基将RTP1、RTP2和RTP3溶解后，分别配成1mg/mL的母液，在无菌条件下过0.22μm微孔滤膜除菌，将滤液等梯度稀释成1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL和62.5μg/mL五个剂量组。

B、细胞复苏

将冻存于-80℃冰箱或液氮中的细胞取出，37℃水浴使其完全融化，100rpm低速离心，将冻存液倒出，后将冻存管中细胞加入适量培养液的培养皿里，吹打混匀，置于培养箱(37℃、5％CO

C、细胞培养

将复苏细胞置于10％灭活胎牛血清DEME高糖培养基(内含100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中，放入培养箱(37℃、5％ CO

D、细胞传代

将培养的细胞置于显微镜下官观察，确定细胞生长状况，若细胞密度达到80％以上，则满足传代条件，用无菌吸管吸取培养皿中的细胞培养液，弃去；加PBS洗涤，并弃去。用胰酶消化细胞，加入3～5mL新的培养基，置于10mL无菌离心管中，1000rpm低速离心3min后弃上清液，用新鲜培养基重悬细胞，按1:3-1:6的比例进行传代，每培养皿加培养液至3-5mL，置于培养箱(37℃、5％ CO

(2)MTT法检刺梨多糖细胞增殖活性

分别吸取100μL的RAW 264.7细胞悬液(1×10

计算细胞相对存活率＝(实验组OD均值/对照组OD均值)*100％

试验结果如图6所示：

随着RTP多糖浓度从62.5μg/mL上升到1000μg/mL，RTP多糖对RAW 264.7细胞的增殖作用呈现线性增长，呈现出剂量依赖关系，不同浓度的RTP多糖对小鼠巨噬细胞的增值率在250-1000μg/mL有显著的差异性，RTP3的细胞增值率最高，且最高达到60％。上述结果表明，在本实验设置的RTP1、RTP2和RTP3浓度中，最高浓度也不会对RAW 264.7细胞造成毒害作用，并且有较强的促细胞增殖效果，RTP3的粗增殖效果明显高于其余两中RTP多糖。

(3)MTT法检刺梨多糖抗炎活性

分别吸取100μL的RAW 264.7细胞悬液(1×10

试验结果如图7所示：

LPS刺激巨噬细胞产生抑制效果，抑制效果达到40％左右，与LPS组相比，RTP1、RTP2和RTP3在浓度为250μg/mL时，显著缓解RAW 264.7细胞的炎症情况，使得细胞增殖率回到正常细胞水平，表现出抗炎效果；而在500-1000μg/mL范围内，均具有显著缓解炎症效果。同时，在500-1000μg/mL浓度范围内，同一浓度RTP1、RTP2和RTP3中，RTP3抗炎效果显著高于RTP1、RTP2，而且表现出明显的浓度依赖，由上可知，当细胞受到外源物质如LPS刺激后，一定浓度的RTP1、RTP2和RTP3可诱导并启动细胞增殖和活性的恢复，从而缓解LPS的刺激损伤，以缓解细胞炎症效果。

(4)刺梨多糖对小鼠巨噬细胞RAW 264.7分泌细胞因子的影响

分别吸取100μL的RAW 264.7细胞悬液，分别加入96孔细胞培养板中，每孔5000个细胞左右，置于培养箱(37℃，5％ CO

试验结果如图8和图9所示：

由图8可知，在250-1000μg/mL浓度范围内，RTP1、RTP2和RTP3均能促进RAW 264.7细胞分泌细胞因子NO，且随着RTP1、RTP2和RTP3的浓度上升，NO的表达量也升高，呈现浓度依赖，在浓度达到1000μg/mL时，RTP3的效果比RTP1、RTP2显著性更高。在62.5-125μg/mL浓度范围内，RTP1、RTP2和RTP3对应的NO分泌量未表现出显著性差异。说明RTP1、RTP2和RTP3在适合浓度上可能具有免疫增强的作用效果，且表现出明显的剂量依赖，RTP3表现出了最好的免疫增强活性，结合RTP多糖细胞增殖活性结果。

由图9可知，与LPS组相比，RTP1、RTP2和RTP3在浓度为250-1000μg/mL范围内，显著缓解RAW 264.7细胞IL-6的释放，有显著缓解炎症效果。同时，在250-1000μg/mL浓度范围内，同一浓度时RTP2抗炎效果显著高于RTP1和RTP3，同时，三种RTP多糖均表现出浓度依赖。由上可知，当细胞受到外源物质如LPS刺激后，一定浓度的RTP1、RTP2和RTP3可诱导并启动细胞增殖和活性的恢复，从而缓解LPS的刺激损伤，减少炎性因子IL-6的释放，表现出较好的抗炎活性。

白介素-6(IL-6)是多效性细胞因子，在免疫和炎症等生理活动中扮演不可或缺的角色，如在抗原特异性免疫反应(Tanaka et al.,2014)中，IL-6的含量会明显上升，在急性炎症发生过程中，IL-6的含量也会随之上升，而LPS做为炎症刺激药物，被LPS刺激的RAW264.7细胞的IL-6含量会明显升高，证明其处于炎症状态(Rose-John,2018)。

综上所述，当三种RTP多糖浓度达到10mg/mL时，对DPPH自由基清除率最高的RTP3达到了57.6％，对羟基自由基清除率最高的RTP1为95.4％，对ABTS+清除率最高的RTP1为61.52％，在总还原力测定中，三种RTP多糖均达到2级还原能力，三种RTP多糖表现出明显的体外抗氧化活性。

此外，本发明使用RAW 264.7细胞(小鼠巨噬细胞)系作为体外实验的细胞模型，通过MTT法检测了三种RTP多糖对细胞增的殖作用和释放NO能力，以及对LPS刺激下的RAW264.7细胞的增殖作用及IL-6释放量，用来评价其对巨噬细胞的免疫调控作用及抗炎活性。试验结果表明三种RTP多糖可以增强RAW 264.7巨噬细胞增加的增殖作用、可以增加RAW264.7细胞NO分泌量，可以缓解细胞因子(IL-6)释放量作用，并且呈剂量依赖性。

细胞实验表明：(1)不同浓度的RTP多糖对小鼠巨噬细胞的增值率对RTP1、RTP2和RTP3设置浓度的的最高浓度也不会对RAW 264.7细胞造成毒害作用，并且有较强的促细胞增殖效果，RTP3的粗增殖效果明显高于其余两中RTP多糖；RTP1、RTP2和RTP3对应的NO分泌量未表现出显著性差异。说明RTP1、RTP2和RTP3在适合浓度上可能具有免疫增强的作用效果，且表现出明显的剂量依赖，RTP3表现出了最好的免疫增强活性；(2)同一浓度RTP1、RTP2和RTP3中，RTP3抗炎效果显著高于RTP1、RTP2，而且表现出明显的浓度依赖，当细胞受到外源物质如LPS刺激后，一定浓度的RTP1、RTP2和RTP3可诱导并启动细胞增殖和活性的恢复，从而缓解LPS的刺激损伤，以缓解细胞炎症效果，RTP1、RTP2和RTP3可显著缓解RAW 264.7细胞IL-6的释放，有显著缓解炎症效果，同一浓度时RTP2抗炎效果显著高于RTP1和RTP3，三种RTP多糖均表现出浓度依赖。

二、体内活性研究

本发明选用三种刺梨多糖，对环磷酰胺刺激建立非特异性免疫抑制小鼠模型，随后检测免疫器官(脾脏)、血清中细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-10)含量，并对免疫器官(脾脏)进行HE染色、组织切片分析，评价RTP多糖的对免疫丧失的小鼠治疗效果；同样地，实验中使用脂多糖(LPS)刺激小鼠建立肺炎模型，随后检测炎症器官(肺)、血清中细胞因子(TNF-α、IL-6)含量，并对其炎症器官(肺)进行HE染色、组织切片分析，评价RTP多糖的全身性炎症小鼠治疗效果；同时，对小鼠连续30天给药的方式建立小鼠模型，随后对小鼠进行急性肝损伤，观察小鼠状态变化，检测损伤器官(肝)、血清中细胞因子含量及损伤器官HE染色、组织切片，观察损伤情况与预防情况。

具体操作如下：

选取体重为20g±2g的Balb/c雌性小鼠，饲养环境符合SPF级动物饲养环境，将小鼠按体重平均分为若干组，饲养一周后进行实验。自饲养小鼠后开始对小鼠外观进行观察，分析进食量、饮水量、活跃程度、敏捷性、体重变化、毛色情况等，并与正常空白组进行对比。

组织病理观察和细胞因子测定方法如下：

血液样本采集：

采用眼球取血的方式收集血液，在室温中静置0.5h，在4℃的条件下，400rpm离心10min，取上清液即血清，置于-80℃冷冻待测。

小鼠组织病理变化观察：

采用HE染色观察小鼠组织病理。小鼠左肺组织采用4％多聚甲醛进行固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，后进行HE染色，使用200倍光学显微镜下对小鼠肺组织病理学情况进行记录。

小鼠血清及组织中细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α)含量检测：

取小鼠组织，使用匀浆器充分匀浆，10000r/min离心10min，收集离心后上清，即为肺脏组织匀浆液。根据ELISA试剂盒说明书的操作步骤测定匀浆液在480nm处的吸光度值(OD值)，根据吸光度值计算组织的活性。

计算公式：

活性＝(测定OD值－对照OD值)/11.3×取样量(g)。

采用ELISA法检测肺组织匀浆中IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α，用酶标仪测定OD

1、刺梨多糖对免疫抑制小鼠治疗作用

试验组别分别记为空白对照组(Control)、环磷酰胺模型组(CTX)、RTP多糖高剂量组(H)、RTP多糖中剂量组(M)、RTP多糖低剂量组(L)；使用腹腔注射的形式进行实验。

具体方法如下：

空白对照组(Control)：每日腹腔注射生理盐水(10mL/kg)，持续至实验结束。环磷酰胺模型组(CTX)：连续5天腹腔注射环磷酰胺(CTX)溶液(100mg/kg)，之后注射生理盐水持续至实验结束。RTP多糖高剂量组(H)：连续5天腹腔注射环磷酰胺(CTX)溶液(100mg/kg)，后连续14天腹腔注射三种RTP多糖溶液(200mg/kg)。RTP多糖中剂量组(M)：连续5天腹腔注射环磷酰胺(CTX)溶液(100mg/kg)，后连续14天腹腔注射三种RTP多糖溶液(100mg/kg)。RTP多糖低剂量组(L)：连续5天腹腔注射环磷酰胺(CTX)溶液(100mg/kg)，后连续14天腹腔注射三种RTP多糖溶液(50mg/kg)。实验结束后，小鼠麻醉后处死，眼球取血并解剖，取脾脏待用。

试验结果如下所示：

(1)小鼠生理活动观察

空白组：小鼠饮食正常，行动灵活，反应灵敏，毛发平顺有光泽，无脱毛，体重均衡。CTX对照组：小鼠食量减少，行动迟缓、嗜睡，精神萎靡，反应减慢，毛发暗淡无光泽，脱毛，体重下降。RTP多糖高浓度治疗组(H)：小鼠活动食量逐渐恢复，行动恢复、嗜睡情况减轻，毛发稍暗淡，无脱毛，体重逐步回升。RTP多糖中浓度治疗组(M)：与高浓度组情况相似。RTP多糖低浓度治疗组(L)：小鼠食量较正常组减少，行动迟缓、嗜睡情况未减弱，精神萎靡，毛发暗淡无光泽，脱毛，体重未有回升。

(2)血清和脾脏中IL-1β、IL-2、IL-10含量测定

A、小鼠血清和脾脏中IL-1β含量测定

IL-1β主要由吞噬细胞产生，与抗原具有协同作用。可增强NK细胞分泌IL-1β或干扰素的活性，增强免疫力。结果如图10所示，与CTX组相比，RTP1、RTP3高、中浓度组(H、M组)中IL-1β浓度高于RTP1、RTP3低浓度组(L组)中IL-1β浓度，且表现出显著的促进效果，说明RTP1、RTP3明显促进脾脏和血清中IL-1β的产生，并可调节至正常水平；而RTP2对血清IL-1β的促进作用不明显。

B、小鼠血清和脾脏中IL-2含量测定

IL-2可以促进NK细胞的增殖，维持NK细胞的长期生长。NK细胞是自然杀伤细胞和重要的免疫细胞，IL-2通过维持NK细胞以达到促进免疫的效果。结果如图11所示，与IL-1β相似，与CTX组相比，RTP1、RTP3高、中浓度组(H、M组)中IL-2浓度高于RTP1、RTP3低浓度组(L组)中IL-2浓度，且表现出显著的治疗效果，但不同的是，RTP2在高浓度时也表现出了治疗效果。在中浓度组(M)中，RTP1的在脾组织中刺激机体释放IL-2的水平显著高于RTP2、RTP3。

C、小鼠血清和脾脏中IL-10含量测定

IL-10是由多种细胞参与分泌的细胞因子，在免疫调节反应中起到关键作用。结果如图12所示，与CTX组相比，RTP1-3高、中浓度组(H、M组)均表现出显著的治疗效果，且在中浓度组(M)中，可以看出RTP3的治疗效果最优，说明，RTP1-3均能刺激机体释放IL-10，参与调节免疫应答，以增强免疫。

(3)小鼠脾脏组织的病理学组织切片观察

如下图13所示，其中，a为Control group×200；b为Control group×400；c为CTXgroup×200；d为CTX group×400；e为H group of RTP1×200；f为H group of RTP1×400；g为H group of RTP3×400；h为H group of RTP3×400；i为M group of RTP1×200；j为Mgroup of RTP1×400；k为M group of RTP3×200；l为M group of RTP3×400；m为L groupof RTP1×200；n为L group of RTP1×400；o为L group of RTP3×200；p为L group ofRTP3×400。

由图13可知，RTP1、RTP3治疗后的小鼠脾脏组织的病理学组织切片可以明显的观察到脾脏组织的损伤与再生，而RTP2治疗后的小鼠脾脏组织未表现出病理学治疗特征。对照组腺体正常，无粘膜增生，浸润性免疫细胞水平有限。相比之下，CTX组表现出严重的组织学损伤和炎症反应，包括大量多核巨细胞(黄色箭头)、弥漫性中性粒细胞浸润和脾脏组织中的炎性细胞浸润。与CTX组相比，在高浓度组(H)RTP1、RTP3治疗下的小鼠脾组织学改变和炎性细胞浸润水平降低，实质细胞坏死和溶解减少(红色箭头)，脾脏组织中病变区域扩张减少。在低浓度时，RTP1、RTP3同样表现出不俗的效果，但是RTP3的治疗效果更好，与病理变化一致。综上RTP1、RTP3治疗显著降低了脾脏组织的组织损伤，表现出了治疗作用，增强免疫效果。

2、刺梨多糖对全身性炎症小鼠治疗作用

试验组别分别记为空白对照组(Control)、脂多糖模型组(LPS)、地塞米松阳性对照组(DSMX)、RTP多糖高剂量组(H)、RTP多糖中剂量组(M)、RTP多糖低剂量组(L)；具体方法如下：

空白对照组(Control)：每日腹腔注射生理盐水(10mL/kg)，持续至实验结束。脂多糖模型组(LPS)：连续5天腹腔注射脂多糖生理盐水溶液(100mg/kg)，之后注射生理盐水持续至实验结束。地塞米松阳性对照组(DSMX)：连续5天腹腔注射LPS生理盐水溶液(100mg/kg)，后连续14天腹腔注射地塞米松溶液(200mg/kg)。RTP多糖高剂量组(H)：连续5天腹腔注射LPS生理盐水溶液(100mg/kg)，后连续14天腹腔注射三种RTP多糖溶液(200mg/kg)。RTP多糖中剂量组(M)：连续5天腹腔注射LPS生理盐水溶液(100mg/kg)，后连续14天腹腔注射三种RTP多糖溶液(100mg/kg)RTP多糖低剂量组(L)：连续5天腹腔注射LPS生理盐水溶液(100mg/kg)，后连续14天腹腔注射三种剂量的RTP多糖溶液(50mg/kg)。实验结束后，小鼠麻醉后处死，眼球取血并解剖，取肝脏待用。

试验结果如下所示：

(1)小鼠生理活动观察

空白组：小鼠活动饮食均正常，毛发光泽，无脱毛。LPS对照组：小鼠行动迟缓，嗜睡，饮食减少，体重下降严重，毛发不平顺无光泽，脱毛。地塞米松阳性对照组(DXMS)：小鼠活动较LPS对照组多，行为相对正常，毛发稍暗淡，无脱毛，体重逐渐回升。RRT多糖高浓度组(H)：小鼠饮食恢复，体重逐步回升，行动趋于正常，毛发光泽，无脱毛。RRT多糖高浓度组(M)：与高浓度相若，但整体体征较弱。RRT多糖高浓度组(L)：与LPS对照组相若，无明显改观。

(2)血清和肝脏中TNF-α、IL-6含量测定

A、小鼠血清和肝脏中TNF-α含量测定

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是哺乳动物在健康生物体和疾病状态下免疫反应的关键介质和调节剂。TNF控制免疫系统的发育、细胞存活信号通路、增殖过程，同时也可以刺激细胞死亡。结果如图14所示，LPS组中，血清与肝脏组织的TNF-α含量明显下降，说明LPS已刺激小鼠机体产生全身性炎症，与高浓度组浓度相同的的地塞米松使TNF-α含量明显回升，达到正常水平，而RTP2在高浓度时，与同浓度地塞米松作用效果相似，另外，高浓度的RTP3在血清中，与同浓度地塞米松作用效果相同，综上，表明高浓度的RTP2、RTP3可以有效地刺激小鼠机体释放TNF-α缓解炎症程度。

B、小鼠血清和脾脏中IL-6含量测定

IL-6是一种用于维持体内平衡的典型促炎细胞因子,当体内平衡被感染或组织损伤破坏时，IL-6会立即产生，并通过激活急性期和免疫反应来帮助宿主防御这种紧急压力。然而，IL-6的过度和持续合成失调分别对急性全身炎症反应综合征和慢性免疫介导疾病具有病理作用，同时，IL-6的含量也可以反应机体炎症侵染程度。结果如图15所示，LPS组中的肝组织和血清中IL-6含量大幅升高，表明LPS已成功诱导小鼠产生全身性炎症；在高浓度的地塞米松使得肝组织和血清中的IL-6含量明显降低，说明地塞米松可以明显的治疗小鼠机体全身性炎症，使得IL-6含量降低，同时高浓度的RTP1、RTP2和RTP3，与同浓度的地塞米松保持相同的治疗效果，而且RTP2的治疗效果明显高于RTP1与RTP3。

(3)小鼠肝脏组织的病理学组织切片观察

同样地，RTP1治疗后的肝脏组织病理学特征不明显。如下图16所示，其中，a为Control group×200；b为Control group×400；c为CTX group×200；d为CTX group×400；e为H group of RTP1×200；f为H group of RTP1×400；g为H group of RTP3×400；h为Hgroup of RTP3×400；i为M group of RTP1×200；j为M group of RTP1×400；k为M groupof RTP3×200；l为M group of RTP3×400；m为L group of RTP1×200；n为L group ofRTP1×400；o为L group of RTP3×200；p为L group of RTP3×400。

由图16可知，RTP2、RTP3治疗后的小鼠肝脏组织的病理学组织切片可以明显的观察到肝脏组织的损伤与再生，而RTP1治疗后的小鼠肝脏组织并未表现出病理学治疗特征。模型组肝脏组织瘀血水肿，细胞核坍缩核膜溶解情况严重，炎细胞浸润严重，死亡细胞较多；说明小鼠炎症模型造膜成功。在高、中浓度的RTP2、RTP3的治疗下，炎症浸润情况好转，死亡细胞聚集情况较少，整体趋于正常，炎症恢复效果较好，而在低浓度下的RTP2、RTP3的恢复效果不如高、中浓度，肝组织炎症情况得到缓解，但效果不如高、中浓度，炎症浸润情况依旧严重，细胞塌陷程度依旧较大。

3、刺梨多糖对急性肺损伤小鼠预防作用

急性肺损伤(ALI)是多种因素引起的弥漫性肺实质损伤，也是全身炎症反应综合征或多器官功能障碍综合征在肺部的典型表现，其特点是肺泡－毛细血管屏障损伤所造成的弥散性肺泡损伤及肺间质水肿，炎症细胞浸润及炎症介质过量表达和释放(Kosutova etal.,2018)。

试验组别分别记为空白对照组(Control)、脂多糖模型组(LPS)、RTP多糖高剂量组(H)、RTP多糖中剂量组(M)、RTP多糖低剂量组(L)；使用滴鼻的形式建立小鼠肺损伤模型；具体方法如下：

空白对照组(Control)：连续14天腹腔注射生理盐水(10mL/kg)，第14天腹腔注射后0.5h，从小鼠鼻孔滴入10μL生理盐水。LPS模型组(LPS)：连续14天腹腔注射生理盐水(10mL/kg)，第14天腹腔注射后0.5h，从小鼠鼻孔滴入10μL LPS溶液(2μmol/L)。RTP多糖高剂量组(H)：连续14天腹腔注射多糖溶液(200mg/kg)，第14天腹腔注射后0.5h，从小鼠鼻孔滴入10μL LPS溶液(2μmol/L)。RTP多糖中剂量组(M)：连续14天腹腔注射多糖溶液(100mg/kg)，第14天腹腔注射后0.5h，从小鼠鼻孔滴入10μL LPS溶液(2μmol/L)。RTP多糖低剂量组(L)：连续14天腹腔注射多糖溶液(50mg/kg)，第14天腹腔注射后0.5h，从小鼠鼻孔滴入10μLLPS溶液(2μmol/L)。各组均以水合氯醛腹腔麻醉后滴鼻处理，7h处死，取出双肺，观察肺组织学变化，ELISA法检测肺组织中细胞因子。

试验结果如下所示：

(1)小鼠生理活动观察

空白组：小鼠呼吸正常，行动正常。LPS组：滴鼻后小鼠呼吸能力降低、呼吸频率增加，身体抖动出现缺氧情况，无法站立。高浓度RRT多糖组(H)：滴鼻后小鼠呼吸能力略微减弱情况，呼吸略微急促，身体未出现异常反应，可正常站立，缺氧反应不明显。中浓度RRT多糖组(M)：滴鼻后小鼠情况与高浓度组情况相似，但缺氧反应较为明显。低浓度RRT多糖组(L)：滴鼻后出现明显缺氧反应，无法正常站立。

(2)肺组织中IL-6、MPO含量测定

A、小鼠肺组织中IL-6含量测定

结果如图17所示，LPS组中的肺组织的IL-6含量大幅升高，表明LPS对小鼠产生急性肺损伤；在用高、中浓度的RTP1-3预处理下，肺组织中的IL-6含量明显低于LPS组，说明RTP1-3对急性肺损伤有很好的预防效果，可以使得IL-6的分泌量降低，减轻炎症影响，而且RTP3的治疗效果明显高于RTP1。

B、小鼠肺组织中MPO含量测定

MPO通过催化作用，使氧化氯离子生成次氯酸，对机体产生和调节炎症的作用，而MPS与中性粒细胞关系密切，可通过测定MPO含量来测定中性粒细胞在肺组织内聚集情况，实验结果中显示，与空白组相比，其他各组小鼠受LPS刺激肺组织内MPO含量明显升高；而经过高浓度RTP2、RTP3预处理的小鼠肺组织内MPO含量相对于LPS组有显著下降(图18)，同时，RTP3的预防效果强于RTP1。

C、小鼠肺组织的病理学组织切片观察

RTP1治疗后的肝脏组织病理学特征不明显，对LPS刺激的急性肺损伤无明显预防作用。如图19所示，其中，a为Control group×200；b为Control group×400；c为CTX group×200；d为CTX group×400；e为H group of RTP1×200；f为H group of RTP1×400；g为Hgroup of RTP3×400；h为H group of RTP3×400；i为M group of RTP1×200；j为M groupof RTP1×400；k为M group of RTP3×200；l为M group of RTP3×400；m为L group ofRTP1×200；n为L group of RTP1×400；o为L group of RTP3×200；p为L group of RTP3×400。

由图19可知，生理盐水滴鼻后，对肺部影响较小，肺泡分布均匀充盈，仅存在少量死亡细胞；而LPS滴鼻刺激后的肺部结构破坏较大，出现了典型的组织学变化，如c图和d图，肺泡坍缩分离，炎细胞浸润严重，肺部呈现纤维化，见许多小灶出血，在高浓度RTP2、RTP3预防后的小鼠肺部，肺泡较为充盈，分离较少，炎症浸润程度较轻，可见完整及清晰的肺泡结构，说明RTP2、RTP3能够明显改善因LPS刺激所引起的肺部组织的病理变化。

综上所述，本发明采用动物实验证明RRT多糖可以有效地调节机体免疫功能，进一步从体内水平上验证了RRT多糖的免疫调节功效，说明RRT多糖对机体免疫功能有保护作用。具体地：(1)本发明选择环磷酰胺免疫抑制小鼠为模型，以免疫器官、免疫细胞以及绌胞因子(IL-1β、IL-2、IL-10)为指标，综合评价了RRT多糖在小鼠体内的免疫调节活性，进而在小鼠免疫器官(脾脏)的病理学组织切片分析，表明RRT多糖对脾脏之治疗作用。结果表明RRT多糖能够激活体内免疫反应，对机体的细胞免疫和体液免疫功能均具有积极的调节作用；(2)建立LPS刺激RAW 264.7的细胞炎症模型，以IL-6释放量为评价指标，初步探索了三种RRT多糖体外抗炎活性。用于筛选了三种RRT多糖抗炎活性的高低，建立了LPS诱导的小鼠全身性炎症模型，动物实验结果表明：RTP2和RTP3均可以改善全身性炎症小鼠的健康状况、减轻小鼠肝组织病理损伤。与LPS组相比，随着给药剂量的提高，小鼠体重下降幅度减缓、病理指数评分下降、肝组织损伤情况也逐步好转；LPS模型组中，小鼠肝组织出现组织水肿和大量淋巴细胞浸润。(3)在炎症的发生、发展、炎症过程的调控、以及肺泡结构破坏到肺脏纤维化形成的全过程中肺泡上皮细胞都参与其中而且在每一过程中都有着不可忽视的作用。病理组织学的结果表明在所有肺纤维化动物模型及肺间质纤维化病人中肺泡上皮细胞的结构和功能均不能维持正常。动物试验中，小鼠急性肺损伤模型是由严重感染，其病理生理机制表现为肺泡－毛细血管屏障损伤、炎症、氧化损伤和肺泡细胞凋亡。在急性肺损伤过程中，炎症细胞在肺内大量积聚浸润，炎症介质过度释放、活化和抗炎因子相对减少，引发体内炎症反应失衡。此外，炎性细胞因子和趋化因子可以募集中性粒细胞和其他炎性细胞，以进一步释放促进肺部炎症的炎性因子和细胞因子，导致急性肺损伤的发展。RRT多糖预处理能够减轻LPS诱导的肺组织病理损伤，肺组织切片可以验证RTP1、RTP2、RTP3对急性肺损伤产生了有效的保护作用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。