一种丁酸梭菌和屎肠球菌的联合液态发酵工艺

技术领域

本发明属于微生物菌剂生产工艺技术领域，尤其涉及一种丁酸梭菌和屎肠球菌的联合液态发酵工艺。

背景技术

随着我国严令禁止在饲料中添加抗生素政策的执行，微生态制剂日益受到养殖业研究人员的重视，并得到广泛使用。微生态制剂是一类在微生态学研究与应用理论的指导下，利用益生菌等微生物经过加工制成的生物制品。微生态制剂通过平衡肠道微生态环境、提升动物机体免疫力、促进营养物质吸收等多种作用机制来提升动物生产性能，已经在畜禽、水产养殖等领域成为替代抗生素的新一代绿色环保饲料添加剂，具有广阔的应用前景。同时，微生态制剂也在临床中被应用于多种感染性疾病的防控。

丁酸梭菌作为益生菌在体内可以维持或恢复宿主肠道优势菌群，通过分泌短链脂肪酸、抗菌肽和丁酸梭菌素等物质，抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、嗜水气单孢菌、副溶血性弧菌和幽门螺杆菌等常见致病菌的的生长，因此得到了广泛的应用。屎肠球菌属于肠球菌，是人和动物肠道中常见的有益菌种，能分泌脂肪酶、蛋白酶等多种有助于消化的酶，还能将多种碳水化合物转化为乳酸，可以软化饲料纤维，提高饲料利用率。还可用于改善食品质量。

丁酸梭菌的生长繁殖需要严格的无氧环境，一般需要提供氮气、二氧化碳等惰性气体来维持其适宜的生长环境。而本发明采用的联合液态培养方法则无需考虑此问题。屎肠球菌为兼性厌氧菌，其生长繁殖能消耗培养空间中的氧气，为丁酸梭菌营造适宜的生长繁殖环境。

益生菌发酵过程中会产生大量的离心废液，这些废液中含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素以及多种糖类和微量元素等营养物质，是理想的饲料原料。此外离心废液中含有未被彻底离心的菌体，若能探索出一种益生菌离心废液重复利用方法，将极大地节约资源，减轻环保压力，并为生产企业带来经济效益。

我国每年都在畜牧业中投入大量的抗生素类饲料添加剂。抗生素作为饲料添加剂可以提高动物生长及免疫机能，但长期大量使用则会造成致病菌耐药性增强，这为食品安全埋下了隐患，因此，研究和开发新型的绿色、无公害饲料添加剂来替代抗生素势在必行。中药发酵饲料添加剂具有毒副作用小、无抗药性、功能多样等优点，近年来受到越来越多研究人员的关注。中药是最受养殖户欢迎的“替抗产品”之一。通过益生菌发酵可以降解中药中纤维素等成分，提高有效成分的吸收利用效率。发酵中药是新兴的替抗产品。

发明内容

本发明提供一种丁酸梭菌和屎肠球菌的联合液态发酵工艺，解决了现有发酵技术中丁酸梭菌产量低、转孢率低等问题，弥补了现有联合发酵技术中所缺乏的丁酸梭菌和屎肠球菌混合发酵工艺的欠缺。同时，为了资源的重复利用，减轻发酵废液的后续处理负担，本发明也提供了一种离心废液的回收利用方法。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种丁酸梭菌和屎肠球菌的联合液态发酵工艺，包括以下步骤：

(1)制备丁酸梭菌和屎肠球菌种子液；

(2)制备发酵培养基，调整联合发酵培养基的初始pH至6.0～7.5，灭菌，将发酵培养基装入发酵罐中；

(3)将2％～6％的屎肠球菌接种于发酵罐中培养5～8h后再接种1％～5％的丁酸梭菌，33～37℃静置发酵36～44h；

(4)将发酵液高速离心，收集菌泥，喷雾干燥获得菌粉。

所述发酵工艺还包括步骤(5)：离心获得的上清液用于中药固态发酵；将离心上清液接种到中药培养基内，于30～37℃培养7-10天。

优选的，所述步骤(1)中丁酸梭菌种子液培养使用的培养基为RCM液体培养基，包括蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉3g/L、葡萄糖5g/L、可溶性淀粉1g/L、氯化钠5g/L、醋酸钠3g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH 6.8；

屎肠球菌种子液培养使用的培养基为MRS液体培养基，包括酪白蛋白胨10g/L、牛肉浸取物10g/L、酵母提取液5g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸二胺2g/L、吐温-801g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁0.2g/L、七水硫酸锰0.05g/L、碳酸钙20g/L，pH 6.8。

优选的，所述丁酸梭菌种子液为37℃绝对厌氧培养14～20h所得，所述屎肠球菌种子液为37℃液体深层静置培养18～22h所得。

优选的，所述步骤(2)中发酵培养基成分包括糖蜜5～25g/L、葡萄糖8～10g/L、酵母浸粉5～15g/L、蛋白胨5～20g/L、硫酸镁0.5～5g/L、磷酸氢二钾-磷酸二氢钠0.1～5g/L、柠檬酸-柠檬酸钠0.1～5g/L。

优选的，所述联合液态发酵工艺还包括联合液态发酵过程中发酵罐的转速为0～50rpm，培养18～22h后进行第一次补料，第一次补料的补料液成分为糖蜜2～10g/L，持续5～9h，第一次补料结束后进行第二次补料，第二次补料的补料液成分为糖蜜2～8g/L，蛋白胨2～8g/L，磷酸氢二钾-磷酸二氢钠1～3g/L，补料至对数期结束。

优选的，所述步骤(3)中发酵罐装液系数为20％～80％。

优选的，所述步骤(5)中中药培养基包括97％～99％粉碎后的中药材、0.1％～1.5％的磷酸氢二钾-磷酸二氢钠、1.0％～5.0％的硫酸镁和0.1％～1.5％的柠檬酸-柠檬酸钠。

优选的，所述中药材包括黄芪、党参、茯苓、甘草、山楂和麦冬。

优选的，所述步骤(5)中混菌发酵上清液的接种比例为15％～25％。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

在厌氧发酵过程中需要氮气或厌氧剂为发酵过程提供无氧空间，本研究提供了一种绿色节能培养新模式。在联合液态发酵过程中，通过采用错时接种方法，满足了丁酸梭菌和屎肠球菌的生长需求。除此之外，将丁酸梭菌和屎肠球菌的联合液态发酵产物进行喷雾干燥所得菌粉中同时含有丁酸梭菌(250～300)×10

传统的发酵废液处理技术耗时长，能耗大，且不利于绿色环境的创建，本专利提供了丁酸梭菌和屎肠球菌联合液态发酵所产生废液的回收利用方法，将发酵废用于中药发酵，使中药与益生菌协同增效。所得发酵中药产品表现出更优良的抑制有害菌、调节肠道菌群和促进肠道屏障修复的作用。

与专利CN 111500508 B《一种丁酸梭状芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌液体混合发酵方法》和专利CN 110241053 A《一种混合发酵培养丁酸梭菌的方法》相比，本发明将丁酸梭菌的活菌浓度分别由5.8×10

本发明所选择的中药材中，山楂富含黄酮类化合物和维生素，能有效防止自由基的产生，增强免疫力；茯苓味甘淡，质平，有利于水分渗透，健脾健胃，安心安神；党参性平，味甘，具有生津止渴、补气、益肺等功效，用于缓解脾肺气虚、食欲不振等病症；黄芪性微温，味甘，具有利尿、益气固表等功效；麦冬性微温，味甘，常用于缓解咳嗽、心悸、食欲不振等症状；甘草常用于脾胃虚弱，倦怠乏力、心悸气短等病症，同时，甘草在整个系统中起调和诸药的作用。在以益生菌为菌种的中药发酵过程中，益生菌的酶解作用增加了中药活性成分的释放量；益生菌的代谢产物也丰富了发酵中药产品的活性成分。而中药则为益生菌提供营养物质，促进益生菌的增殖。在发酵过程中还可能产生新的药效物质。益生菌发酵中药产品不但富含多种生物活性物质，还含有活益生菌，可更好地提高动物生产性能。

附图说明

图1为实施例1中丁酸梭菌和屎肠球菌的生长曲线；

图2为实施例2中碳源对菌株生长的影响；

图3为实施例2中氮源对菌株生长的影响；

图4为实施例2中无机盐对菌株生长的影响；

图5为实施例3中温度对菌株生长的影响；

图6为实施例3中pH对菌株生长的影响；

图7为实施例3中装液系数对菌株生长的影响；

图8为实施例3中静置培养中菌株的生长曲线；

图9为实施例4中10L罐发酵过程中补料液碳氮比对菌株生长的影响；

(其中左侧坐标轴适用于丁酸梭菌及其芽孢，右侧坐标轴适用于屎肠球菌)

具体实施方式

为对本发明进行更好的说明，特列举实施例如下。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分，而不是全部实施例，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的的其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

以下实施例涉及到的培养基

丁酸梭菌活化培养基与种子培养基组分相同，包括：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉3g/L、葡萄糖5g/L、可溶性淀粉1g/L、氯化钠5g/L、醋酸钠3g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH 6.8；

丁酸梭菌计数培养基：在RCM液体培养基成分中再加入2.0％的琼脂粉。

屎肠球菌的活化培养基与种子培养基组分相同，均为MRS液体培养基，包括：酪白蛋白胨10g/L、牛肉浸取物10g/L、酵母提取液5g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸二胺2g/L、吐温-80 1g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁0.2g/L、七水硫酸锰0.05g/L、碳酸钙20g/L，pH 6.8；

屎肠球菌计数培养基：在MRS液体培养基成分中再加入2.0％的琼脂粉；

实施例1菌种生长曲线的测定

丁酸梭菌的培养方式为液体静置培养，锥形瓶装液系数50％，接种量4％，用8层纱布和2层牛皮纸封口，37℃静置培养48h。

屎肠球菌的培养方式：液体静置培养，锥形瓶装液系数30％，接种量3％，于39℃静置培养48h。

按照上面的方法进行菌种活化与培养，在培养期间每隔4h取样测定活菌浓度，分别绘制其生长曲线。

根据图1中的生长曲线，对数后期菌浓高，菌体生命力旺盛，故丁酸梭菌和屎肠球菌种子培养时间分别选择16h和20h。

实施例2混合发酵培养基成分的优化

混合培养初始发酵方式：根据丁酸梭菌和屎肠球菌的生长曲线，以MRS培养基为初始联合培养基，先将屎肠球菌以4％的接种量接种至联合液态培养基中，6h后将丁酸梭菌以4％的接种量接种至联合液态培养基中，锥形瓶装液系数为50％，37℃静置培养，锥形瓶用8层纱布和2层牛皮纸封口。

在初始培养基的基础上对碳源进行优化，选取糖蜜、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、果糖、麦芽糊精、低聚异麦芽糖共9种碳源，探索不同碳源对联合培养菌种生长的影响。

利用选定的优化碳源，从胰蛋白胨、牛肉浸粉、硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆干粉、豆粕粉、鱼粉、牛肉膏中选取优选氮源。

根据碳源和氮源种类优化结果设计正交实验，对碳源和氮源的浓度进行优化，碳源浓度设置15g/L、20g/L、25g/L三个浓度，氮源浓度设置为10g/L、15g/L、20g/L三个浓度。

初试时选缓冲盐系统有磷酸氢二钾-磷酸二氢钠、柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸-乙酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌和氯化钙。在无机盐种类优化基础上，设计正交实验，对无机盐浓度进行优化。在优化过程中选取丁酸梭菌活菌浓度及芽孢浓度和屎肠球菌活菌浓度为考察指标，以丁酸梭菌作为主要考察对象。每组实验重复3次。

由图2可以看出，葡萄糖为碳源时，丁酸梭菌活菌浓度和芽孢浓度均达到了最大值。碳源为糖蜜时，屎肠球菌的活菌浓度达到最大值。糖蜜为碳源时丁酸梭菌和屎肠球菌的活菌浓度均较理想；为进一步优化碳源，将葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精分别与糖蜜复合，来探索复合碳源对菌种生长的影响，结果如表1。

表1复合碳源优化结果

注：组合一为葡萄糖8g/L+糖蜜12g/L；组合二为麦芽糖10g/L+糖蜜10g/L；组合三为蔗糖8g/L+糖蜜12g/L；组合四为麦芽糊精10g/L+糖蜜10g/L；对照为葡萄糖20g/L。

由表1可知，复合碳源的效果比使用单一碳源理想。复合碳源为葡萄糖和糖蜜时，丁酸梭菌的活菌浓度和芽孢浓度均达到了最大值，复合碳源为麦芽糖和糖蜜时，屎肠球菌的活菌浓度达到了最大值，丁酸梭菌的活菌浓度和芽孢浓度较低。综合考虑，选取葡萄糖和糖蜜作为联合培养的碳源。

由图3可见，当氮源为蛋白胨时，丁酸梭菌的活菌浓度和芽孢浓度也达到了最大值，分别达到了4.06×10

表2复合氮源优化结果

注：蛋白胨和其他氮源比例1:1，氮源含量为20g/L，对照为20g/L蛋白胨。

由表2可知，复合氮源的效果普遍优于单一氮源。在复合氮源为蛋白胨和酵母浸粉的组合中，丁酸梭菌的活菌浓度及芽孢浓度均达到了最大值，此时屎肠球菌的活菌浓度也较为理想。因此选取蛋白胨和酵母浸粉作为复合氮源。

通过单因素实验确定了最佳碳源和氮源的种类，其浓度与配比对菌体生长也有很大影响，因此设计正交实验来进一步确定复合碳氮源的最优添加比例，用SPSS20.0软件设计L9(3

表3正交试验因素水平表

对结果进行极差和K值分析，结果如表4。

表4正交试验结果

注：A

由表4可知：各因素对丁酸梭菌活菌浓度影响大小为C＞A＞B＞D，说明蛋白胨对丁酸梭菌活菌浓度影响较大，对丁酸梭菌芽孢浓度影响大小为A＞D＞C＞B，说明葡萄糖对丁酸梭菌转孢影响较大，对屎肠球菌活菌浓度影响大小为A＞D＞C＞B，说明糖蜜对屎肠球菌活菌浓度影响较大。通过比较K值可得优化实验条件为：A

除碳源和氮源外，无机盐对发酵菌体的活菌浓度也有着至关重要的影响。几种常见的缓冲盐体系对菌体生长影响结果如图4，磷酸氢二钾-磷酸二氢钠、柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸-乙酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠和磷酸氢二钾-磷酸二氢钾的添加量均为0.2g/L，硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌和氯化钙的添加量均为2g/L。

由图4可以看出，磷酸氢二钾-磷酸二氢钠可促进丁酸梭菌生长，此时屎肠球菌的活菌浓度也较为理想。无机盐为硫酸镁时，屎肠球菌的活菌浓度达到了最大值，此时丁酸梭菌的活菌浓度及芽孢浓度仅次于磷酸氢二钾-磷酸二氢钠。无机盐为柠檬酸-柠檬酸钠时，丁酸梭菌的芽孢浓度达到最大值。综合考虑，可选用磷酸氢二钾-磷酸二氢钠、柠檬酸-柠檬酸钠和硫酸镁作为丁酸梭菌和屎肠球菌联合液态培养的最佳无机盐成分。

上一步实验结果表明磷酸氢二钾-磷酸二氢钠、柠檬酸-柠檬酸钠和硫酸镁为最佳无机盐，用SPSS20.0软件设计L9(3

表5正交试验因素水平表

表6正交试验结果

注：A

通过对实验进行极差分析可知：各因素对丁酸梭菌活菌浓度影响力大小为A＞C＞B；对芽孢浓度影响力大小为A＞C＞B；对屎肠球菌活菌浓度影响力大小为C＞B＞A。通过比较K值大小可得最佳实验条件为A

由以上的结果可知，本发明的最优发酵培养基包括葡萄糖10g/L，糖蜜15g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，磷酸氢二钾-磷酸二氢钠0.2g/L，柠檬酸-柠檬酸钠0.6g/L、硫酸镁4g/L。

实施例3联合发酵培养条件的优化

在最优发酵培养基的基础上，对联合发酵培养条件进行优化。

在250mL锥形瓶中装入50％体积培养基，初始pH为6.5；灭菌，冷却后接入4％丁酸梭菌和4％屎肠球菌种子液，37℃静置培养42h后检测菌体浓度。

(1)发酵温度选择31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃考察发酵温度对发酵的影响，结果如图5所示。由图5可以看出，温度对联合发酵过程中菌株的生长影响较显著，当温度在31～37℃范围内时，丁酸梭菌和屎肠球菌的菌体浓度随温度的升高而逐渐增加，在37℃时丁酸梭菌的活菌浓度达到最大值，为4.75×10

(2)调整最适pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，考察pH对联合发酵过程中菌株生长的影响，由图6的结果可以看出：在初始pH为5.5时，丁酸梭菌和屎肠球菌几乎不怎么生长，而在初始pH为5.5～7.0范围内，丁酸梭菌和屎肠球菌的活菌浓度随着初始pH的升高而逐渐增加，当初始pH为7.0时，丁酸梭菌和屎肠球菌的活菌浓度均达到最大值。查阅相关文献并结合本实验的研究结果，将两菌联合发酵的最适初始pH定为7.0。

(3)选取30％、40％、50％、60％、70％五个梯度考察装液系数对联合发酵的影响。由图7可以看出，装液量在30％～50％范围内时，丁酸梭菌和屎肠球菌的活菌浓度随装液量的增加而增加。装液系数为50％时，丁酸梭菌和屎肠球菌的活菌浓度均达到最大值。结合相关文献的研究结果以及以往操作经验，考虑到过高或过低的装液系数不利于丁酸梭菌的生长，故将此两菌联合发酵的最适装液系数定为50％。

(4)以丁酸梭菌和屎肠球菌的接种量为三个因素，每个因素设置3个水平，按L

表7正交试验因素水平表

表8正交试验结果

注：A1、B1、C1分别对应表中的各物质的第一水平，如A1代表丁酸梭菌的接种量为2％。

由极差分析可知，各因素对丁酸梭菌活菌浓度影响力大小为B＞A；对芽孢浓度影响力大小为B＞A；对屎肠球菌活菌浓度影响力大小为A＞B。通过比较K值大小可得最佳实验条件为A

按照上述发酵工艺，先将屎肠球菌以2％的接种量接种至联合液态培养基中，6h后丁酸梭菌以5％的接种量接种至联合液态培养基中。在0～48h内每4h取样检测菌体浓度，以确定培养时间，结果如图8所示。由图8可以看出，在0～20h，屎肠球菌利用培养基中的营养成分迅速繁殖，8h时丁酸梭菌开始繁殖，并迅速进入对数期，屎肠球菌在大量繁殖的同时消耗培养基中残留的氧气为丁酸梭菌的生提供无氧环境。在8～20h，丁酸梭菌和屎肠球菌共同生长，屎肠球菌为丁酸梭菌的生长提供营养环境，丁酸梭菌则为屎肠球菌提供维生素等生长因子。丁酸梭菌在16h开始生成孢子，32h丁酸梭菌活菌浓度达到最大值，但其芽孢浓度36h时达到最大值。综合考虑，将36h作为混合发酵的终点。

实施例4补料工艺优化

(1)不同补料碳氮比对发酵的影响

在10L发酵罐中装入50％体积优化后的培养基，初始pH调至7.0，121℃灭菌30min，冷却后溶氧设置为100％，接种2％的屎肠球菌种子，于39℃，静置培养6h后溶氧降低至50％时，接种5％的丁酸梭菌于37℃静置培养。静置培养期间每30min间歇以50rpm搅拌2min以防止培养沉淀。20h开始补入10g/L糖蜜，持续流加7h，第一次补料后马上进行第二次补料，补料液为糖蜜8g/L，蛋白胨2g/L，磷酸氢二钾-磷酸二氢钠1g/L组成的复合补料液，补料至对数期结束，对复合补料液碳源和氮源含量和比例进行探究。在发酵过程中定时取样至48h，检测菌体浓度和发酵液残糖含量。结果如图9所示。由图9可以看出，补料液中氮源对屎肠球菌的影响较大。当补料液中只有糖蜜时，丁酸梭菌的活菌浓度有所增加，加入不同比例的氮源后，丁酸梭菌的活菌浓度和芽孢率有所提高，当碳氮比为1:1时，丁酸梭菌的活菌浓度及发酵液中的总活菌浓度均达到最高，此时丁酸梭菌的芽孢率也较为理想。综合考虑，将丁酸梭菌和屎肠球菌联合发酵中补料液的碳氮比定为1:1。

(2)发酵过程pH和补料对发酵的影响

在发酵过程中，控制pH为7.0或不调整pH，发酵过程补料或不补料，考察发酵过程中pH和补料对发酵的影响，具体结果见表9。

表9流加补料并调节pH发酵结果

注：对照1为调控pH为6.8，不补料，对照2为自然发酵，不进行补料和调节pH。

由表10可知，补料和pH控制对发酵结果有着重要影响，通过补料和pH控制可有效提高丁酸梭菌芽孢率，还可以提高丁酸梭菌和屎肠球菌的活菌浓度。

实施例5离心废液的回收利用

将发酵液于4000rpm离心10min，菌泥通过喷雾干燥工艺制备菌粉，进口温度为150～180℃，所用保护剂为10％的海藻酸钠、10％的麦芽糊精、2％的壳聚糖、1％的乳酸钙、0.2％的羧甲基纤维素钠和0.1％的二氧化硅。所得菌粉中丁酸梭菌浓度为(250～300)×10

上清液含丁酸梭菌1.5×10

制备固态培养基：分别将1Kg的黄芪、党参、茯苓、甘草、山楂和麦冬粉碎至30目，混合均匀。将95％～99％粉碎后的中药材与0.1％～1.5％的磷酸氢二钾-磷酸二氢钠、1.0％～5.0％的硫酸镁和0.1％～1.5％的柠檬酸-柠檬酸钠混合均匀，于121℃灭菌20min。

取固态发酵培养基10.0Kg，装入带单向放气阀的发酵袋中，每袋1Kg，将上清液按照不同的比例加入袋中，搅拌均匀后封口，置于37℃培养7天，期间每天通过抖动使物料混合均匀。

为达到最好的固态发酵结果，以每个发酵袋中磷酸氢二钾-磷酸二氢钠的添加量为10g，硫酸镁的添加量为25g，柠檬酸-柠檬酸钠的添加量为10g为初始条件，选择中药材添加量、料水比和上清液接种量3个因素，按L

表10正交试验因素水平表

表11正交试验结果

/>

注：A1、B1、C1分别对应表中的各物质的第一水平，如A1代表料水比为1:0.4。

分析极差可知，各因素对丁酸梭菌活菌浓度影响力大小为C＞A＞B，对屎肠球菌活菌浓度的影响力大小为B＞C＞A。通过比较K值可得最佳实验条件为A

为进一步优化无机盐的添加量，在以上优化条件的基础上，选择硫酸镁、磷酸氢二钾-磷酸二氢钠和柠檬酸-柠檬酸钠添加量三个因素，按L9(3

表12正交试验因素水平表

表13正交试验结果

/>

注：A1、B1、C1分别对应表中的各物质的第一水平，如A1代表磷酸氢二钾-磷酸二氢钠的添加量为5g/L。

分析极差可知，各因素对丁酸梭菌活菌浓度影响力大小为A＞B＞C，对屎肠球菌活菌浓度的影响力大小为A＞B＞C，通过比较K值可得磷酸氢二钾-磷酸二氢钠、柠檬酸-柠檬酸钠和硫酸镁的最佳添加比例为A

由以上正交试验已得出利用离心上清液和中药复合物进行固态发酵的最佳实验条件，在固态发酵后，丁酸梭菌活菌浓度达到了6.87×10

实施例6动物喂养试验

本实施例用于说明固态发酵产物对于仔猪生长状态及免疫力的影响。

选取20日龄(7.5kg)左右健康仔猪60头，随机分成3组，每组20只，对照组饲喂基础日粮，试验组一在饲喂基础饲料的基础上据仔猪体重每日添加0.2g/Kg实施例5中的固态发酵产物，试验组二在饲喂基础饲料的基础上据仔猪体重每日添加0.5g/Kg专利CN112336828A《一种防治仔猪腹泻的发酵中药微生态制剂》中的复合菌剂(据专利中相同的实验条件制备，该复合菌剂是利用复合微生物对中药组合物发酵制得，复合微生物包括丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸性乳酸杆菌、地衣芽孢杆菌及粪肠球菌，中药组成物包括黄芪、甘草、茜草、马齿苋、益智和杨树花)，采用漏斗式饲槽自由采食，供水充足，日常管理按照常规，共进行为期35天的饲喂实验。

基础饲料成分组成：玉米64％，豆粕22％，乳清粉5％，鱼粉5％，豆油0.9％，L-赖氨酸盐0.3％，DL-蛋氨酸0.15％，石粉0.4％，磷酸氢钙0.8％，食盐0.3％，氯化胆碱0.15％，预混料1％。

在试验开始(0天)，7天，21天与试验结束时(35天)分别称量饲料重量并在实验结束时(35天)称量仔猪重量。每日上午9点统计腹泻仔猪数量，计算平均日增重(averagedaily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(feed:gain，F/G)。

其中，平均日增重(ADG)＝(试验末重－试验初重)/试验天数；

料重比＝平均日采食量/平均日增重。

腹泻率＝腹泻猪头数/(试验猪头数×总天数)×100％

其中，实验期腹泻仔猪头次＝第1天腹泻仔猪数+第2天腹泻仔猪数+……第35天腹泻仔猪数。

采用SAS(Statistical Analysis)7.2版本进行统计分析和方差分析，结果以P＜0.05为显著。显著性差异用字母标记法表示：首先将全部平均数从大到小依次排列，然后在最大的平均数上标字母a；并将该平均数与以下各平均数相比，凡相差不显著的，都标上字母a，直至某一个与之相差显著的平均数，标记字母b；再以该标有b的平均数为标准，与上方各个比它大的平均数比较，凡不显著的也一律标以字母b；再以标有b的最大平均数为标准，与以下各未标记的平均数比，凡不显著的继续标以字母b，直至遇到某一个与其差异显著的平均数标记c。结果见表14，每组数据取平均值。

表14动物喂养实验效果比对

注：同列数字肩标上的字母a、b、c表示差异极显著(P＜0.01)，相同字母表示差异不显著(P＞0.05)

由表14的统计分析结果可知，试验组在平均日增重、料重比、腹泻率方面，与对照组差异性显著(P＜0.05)。试验组一在降低仔猪腹泻率方面，与试验组二差异性显著。另外，本专利固态发酵中使用了黄芪、党参、茯苓、甘草、山楂和麦冬为原料，固态发酵产品成本较低。因此，从饲喂成本和生长性能综合评估，利用丁酸梭菌和屎肠球菌联合发酵的上清液对中药复合物进行固态发酵的产物可以满足一部分仔猪养殖所需，达到改善仔猪生长性能和降低腹泻率的效果。

在试验结束当天仔猪禁食12h，每组选择5头仔猪颈静脉采血10mL，3000rpm离心15min，取上层血清，-20℃保存，用于测定仔猪血清中免疫球蛋白G(IgG)含量。

试验组一仔猪血清中IgG含量的平均值为27.35mg/mL，试验组二仔猪血清中IgG含量的平均值为23.43mg/mL，试验组一和试验组二之间差异性显著(P＜0.05)，对照组仔猪血清中IgG含量的平均值为17.56mg/mL，试验组与对照组之间差异性显著(P＜0.05)。

从以上结果可以看出，利用离心上清液进行固态发酵的产物可提高仔猪的生长性能，使血清免疫水平有所提高，降低腹泻率。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。