喹啉在防治副溶血性弧菌中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及喹啉在防治副溶血性弧菌中的应用。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)为革兰氏阴性菌，广泛分布于世界各地的沿海以及河口等水域中，是我国主要的食源性致病菌之一。除了食用后对人体产生负面影响，副溶血性弧菌还能引起水产养殖动物弧菌病，导致养殖虾等急性肝胰腺坏死病，常引起养殖早期发生的快速感染和死亡，给水产养殖产业带来巨大损失。目前，针对由副溶血性弧菌引起的细菌性疾病的研究主要是使用现有的抗生素，但大量使用抗生素，不仅破坏生态环境，还会导致副溶血性弧菌产生耐药性。

喹啉是一类重要的含氮杂环化合物，具有抗菌、抗癌等生物活性，已被广泛应用于各类药物制作中，如制备烟酸类及羟基喹啉类药物、农药8-羟基喹啉酮、内吸性杀菌剂等。加之其低毒、高效、对环境友好、易降解等特点，在农作物病害药物研究领域中，其已成为高效低毒、绿色农药研究主流。迄今为止，喹啉及其衍生物还未见应用于水产养殖病害防治。

发明内容

本发明的目的之一是提供喹啉在防治副溶血性弧菌中的应用，为水产养殖业提供一类可代替抗生素且低毒高效的抗弧菌性疾病的药物。

本发明的目的之二是提供一种水产养殖药物制剂，其活性成分为喹啉。

本发明研究了喹啉对副溶血性弧菌的抑菌活性，并深入探究了喹啉对副溶血性弧菌生长抑制率、生物膜形成情况的影响，以及喹啉对多齿新米虾副溶血性弧菌的预防及治疗作用的影响，结果证明喹啉能有效防治多齿新米虾副溶血性弧菌病害。

附图说明

图1为喹啉对副溶血性弧菌的抗菌活性结果。

图2为通过SEM观察喹啉对副溶血性弧菌形态的影响结果。

图3为不同时间、不同喹啉浓度处理后生物膜OD

图4为副溶血性弧菌生物膜共聚焦显微镜(CLMS)观察结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1喹啉对副溶血性弧菌的抑菌活性检测

将5μL副溶血性弧菌接种到5mL LB液体培养基(表1)中，培养至OD

表1液体LB培养基配方(1L)

注：用1mol/L的NaOH调节pH值到7.0，定容至1L。121℃，20min高压灭菌，4℃储存。

培养24h后，喹啉在1 000，2 000，5 000μg/mL浓度下完全抑制了副溶血性弧菌的生长，在100，200，500μg/mL浓度下抑菌率分别为21％，35％，64％，而在10μg/mL浓度下对副溶血性弧菌的生长未产生显著的影响。

结果如图1所示，喹啉对副溶血性弧菌具有显著抑制效果。在培养0，1，2，4，8，16，24h后，1000μg/mL喹啉完全抑制了细菌的生长(IC

实施例2喹啉对副溶血性弧菌生物膜完整性形成的影响

在含有0，100，200μg/mL喹啉的5mL LB液体培养基中200r/min培养副溶血性弧菌至OD

结果如图2所示，在未经喹啉处理的对照组中，副溶血性弧菌细胞聚集并形成生物膜，并且观察到大量的分泌物结构覆盖了细菌细胞之间的空隙。然而在用100和200μg/mL喹啉处理过后的细菌细胞中，形成的生物膜减少，这表明该化合物抑制了副溶血性弧菌生物膜的形成。

实施例3利用紫外分光光度计检测喹啉对副溶血性弧菌生物膜形成过程的影响

将5μL副溶血性弧菌接种到5mL LB液体培养基中，培养至OD600＝1.2，4℃、10000r/min条件下离心5min，获得菌体沉淀，加入5mL无菌水，吹打混匀制备成细菌悬浮液。向含有0，200，500μg/mL喹啉的3mL LB液体培养基中各加入30μL上述细菌悬浮液，置于28℃培养箱中静置培养，分别在0，2，4，6，8d后检测生物膜形成情况。吸去试管中的上层悬浮液，向所有试管中各加入6mL 10％结晶紫溶液，室温下静置1h。吸去试管中的结晶紫溶液，分别用无菌水洗涤6次，室温下晾干。每个试管中各加入3mL混合溶液(40％甲醇+10％冰醋酸+50％ddH2O)，吹打混匀之后，用NanodropOne超微量紫外分光光度计测定OD575的值。在静置培养4d后还需测量生物膜的厚度。

结果如图3所示，经过200和500μg/mL喹啉处理过的副溶血性弧菌的生物膜与未经喹啉处理的对照组相比，在培养2、4、6、8d后，200μg/mL喹啉分别使副溶血性弧菌所形成的生物膜减少了55.3％，38.3％，18.4％，16.4％，500μg/mL喹啉分别使副溶血性弧菌所形成的生物膜减少了89.6％，81.8％，82.3％，69.6％。

实施例4利用共聚焦激光扫描显微镜检测喹啉对副溶血性弧菌生物膜形成的影响

将1μL副溶血性弧菌分别接种到含有0，100，200μg/mL喹啉的1mL LB液体培养基中，置于28℃培养箱中静置培养，室温、10 000r/min条件下离心5min，用无菌水洗涤3次，分别加入50μL钙荧光白染料，遮光条件下对生物膜染色处理1min。再分别用无菌水洗涤3次，各加入100μL无菌水，吹打混匀制备成悬浮液，最后用共聚焦显微镜观察生物膜形成情况。

结果如图4所示，对照组的副溶血性弧菌生物膜呈现出密集分布的结构。然而经喹啉处理后的细菌生物膜含量较低，且呈现出不均匀分散的现象，抑制效果与喹啉的浓度成正比，在使用200μg/mL喹啉后几乎没有观察到生物膜结构。

实施例5喹啉对多齿新米虾的预防作用

根据前期预实验的数据，每组40只多齿新米虾，一共5组，使用200μg/mL的喹啉预先处理虾2.5h，洗净水缸，换水，再将每小组分成5份，分别放在不同浓度的副溶血性弧菌中浸泡20min、40min、60min、120min，泡好后捞出分别放在净水中，继续观察2d，并记录虾的状态及活力。结果如表2所示。

表2喹啉对多齿新米虾副溶血性弧菌病害预防效果结果分析

从中可看出，200μg/mL喹啉预处理后的多齿新米虾，再被不同浓度副溶血性弧菌侵染过程中，当副溶血性弧菌的OD值低于1.5时，喹啉都起到很好的预防治疗效果。

实施例6喹啉对多齿新米虾的治疗作用

通过实验观察并记录喹啉是否能降低副溶血性弧菌感染多齿新米虾后的死亡率。把多齿新米虾放在5L玻璃水箱中暂养5d，使其适应实验室条件，以进行进一步研究。将50只多齿新米虾放在含有副溶血性弧菌的水中，OD值为1.9，处理1h，然后洗净水缸去除细菌悬液，换水，在水缸中加入200μg/mL喹啉处理多齿新米虾，分别处理20min、40min、60min、120min，每组按照时间处理完就捞出放在净水中，继续观察记录。对照组即在OD＝1.9的副溶血性弧菌中处理1h，但不使用200μg/mL的喹啉治疗，直接捞出放在净水中观察。结果如表3所示。

表3喹啉对多齿新米虾治疗实验结果分析

*对照即不使用200μg/mL喹啉治疗，直接放入净水观察。

从中可看出，200μg/mL喹啉对感染过副溶血性弧菌的多齿新米虾有很好的治疗作用。如果不经喹啉治疗，将产生23.3％的死亡率。而经过喹啉治疗后，死亡率显著降低。