一种苜蓿根际被孢霉抑制杂草的技术

技术领域

本发明涉及微生物领域，农业领域，具体涉及一种苜蓿根际被孢霉抑制杂草的技术。本发明使用的被孢霉菌株MXBP304筛选于苜蓿田的根际土壤，菌株易培养，生产安全性高，对马唐的生根及生物量抑制效果好。通过采用该被孢霉菌株MXBP304的发酵液接种马唐，在种子萌发期，其根长与株重均低于未接种处理；在种子苗期，其处理组的生物量显著低于未处理组。

本发明能抑制马唐的生根与发芽，减轻苜蓿田的杂草危害，从而更好地促进苜蓿草的产量与品质，应用价值高。

背景技术

全世界土地的30％用于牧草和草食动物生产，其中“牧草之王”紫花苜蓿(Medicago sativa)因其具有产草量高，蛋白质含量高，适口性好，生物固氮能力强等优点，在世界范围内被广泛种植，也是我国种植面积最大的优质高蛋白豆科牧草。但是在苜蓿种植过程中，杂草的发生是影响苜蓿产量及品质的重要因素。在对紫花苜蓿田间杂草调研中发现，其中一年生的禾本科植物马唐(Digitaria sanguinalis(L.)Scop.)是苜蓿田中的优势杂草之一，其适应性强，生长迅速，与牧草争夺养料、水分、阳光和空间，通过竞争导致苜蓿严重减产，此外，它还可以通过分泌一些化感物质直接或间接地抑制作物的生长，同时还是一些害虫和病原菌的中间寄主，会使苜蓿发生病害。据报道，这种杂草目前均对化学除草剂产生了群体抗性，极难防除。

在苜蓿种植过程中，为减少杂草的危害，通常施用除草剂来进行杂草防除，虽然对杂草有一定的抑制作用，但除草剂的使用对地下水源、土壤活力等都产生了负面影响，对生态环境也造成一定的污染。除草剂的使用已经不符合绿色发展的要求，因此，在作物和牧草生产中，亟需一种生态防控杂草的技术与方法。目前，在苜蓿草的生产过程中，可以替代除草剂的杂草生态防控技术匮乏，是苜蓿生产中迫切需要解决的瓶颈问题。

杨超等人研究发现，苜蓿根际真菌群落中被孢霉属(Mortierella)、链格孢属(Alternaria)和枝孢属(Cladosporium)的丰度极显著高于杂草。其中微生物被孢霉属真菌对作物的生长发育具有促进作用，因此成为国际研究热点；李芳等人发现长孢被孢霉菌株(M.elongata)在矿质土壤的养分转化和促进植物生长方面起着显著作用；宁琪等人发现在砂姜黑土中，被孢霉菌株显著提高了土壤速效氮和有效磷的含量以及β-葡萄糖苷酶和磷酸酶的活性。这些研究表明，微生物被孢霉属真菌对作物生长发育有促进作用，但其对牧草及杂草影响的研究较少。我们研究发现，被孢霉菌株发酵液对马唐种子有抑制生根的效果，种子萌发是植物生长发育的开端，若在幼苗生长发育阶段受到抑制，将会影响植物后期的出苗。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明的目的是提供一种被孢霉抑制杂草的技术，该菌株易培养，生产安全性高，通过该菌株发酵液处理的马唐的根长和株重以及苗期的生物量均显著低于对照组。

为了解决以上技术问题，本发明中的微生物菌株MXBP304，该菌株属于被孢霉属(Mortierella sp.)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2021年12月22日，保藏号：CCTCC NO；M20211660，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。

本发明所述的被孢霉菌株，从苜蓿根际土壤里提取得到。

本发明所述的被孢霉菌株在制备在防控杂草的试剂中的应用。

本发明所述的应用，其中所述防控杂草是抑制马唐的生长。

本发明所述的应用，其中所述防控杂草是能够减轻苜蓿田恶性杂草马唐的生根与发芽，从而提高苜蓿草的产量与品质。

本发明所述的应用，其中防控马唐的生根与发芽的方法，包括如下步骤：

(1)菌种保存：将从苜蓿田根际土壤中分离得到的被孢霉菌株MXBP304菌种，一份用试管斜面保藏，斜面为GY固体培养基；另一份用50％甘油作为保护剂，放置于－80℃低温冰箱中进行保藏；

(2)菌种活化：将保存的菌种接到GY培养基上进行活化4-6天；

(3)菌种扩繁：将上述菌株接种于GY培养基上进行扩繁12-14天；

(4)发酵液制备：将上述菌株用直径为6mm的打孔器在菌落边缘打取3菌饼，将菌饼接入含有100mlPD(Potato Dextrose，PD)培养液的三角瓶中培养，三角瓶置于(28±1)℃，180r/min摇床振荡培养7天，无菌条件下进行过滤，得到发酵液。

(5)施用：该发酵液应在苜蓿田间马唐发生前期施用，发酵液使用时按照1:10的比例兑水施用，施用次数根据杂草的实际情况而定，杂草少时施用1-2次，杂草多时施用3-4次。

本发明所述的制备方法，其特征在于：步骤2中所述GY培养基包括以下组份及用量：葡萄糖20.0g，酵母膏10.0g，蒸馏水1000mL，pH自然。

本发明所述的制备方法，其特征在于：步骤4中所述PD培养液包括以下组份及用量：葡萄糖10.0g，马铃薯200.0g，蒸馏水1000mL，pH自然。

本发明所述的制备方法，其特征在于：步骤4中PD培养液的制备具体如下：称取200.0g马铃薯，洗净去皮切成1cm左右的小块，加蒸馏水1000mL煮沸30min，双层纱布过滤后加水补足至1000mL，再加20.0g葡萄糖，煮沸至固体充分溶解后分装。250mL三角瓶每瓶装100mL培养液，采用高压蒸汽湿热灭菌，在0.1MPa蒸汽压下，温度达121℃，灭菌20min。

本发明所述的被孢霉菌株，其特征在于：该菌株取自于苜蓿根际土壤，对苜蓿田杂草马唐种子有抑制生根和减少生物量的效应，今后将其制作成微生物菌剂或菌肥有能够返施回苜蓿田的潜力。

本发明所述的一种苜蓿根际被孢霉抑制杂草的技术，其特征在于：该菌株发酵液对马唐的生根和生物量起到抑制作用。

本发明所述的技术，其特征在于：所述技术，能够减轻苜蓿田恶性杂草马唐的生长，从而提高苜蓿草的产量与品质。

本发明菌株经多次传代，依旧稳定遗传，目前在传代过程中，并未出现明显的变异菌株。

本发明从苜蓿根际筛选出的被孢霉菌株易培养，生产安全性高。通过将菌株发酵液稀释10倍后接种马唐，在种子萌发期间，其根长、株重与未接种该菌株相比有明显的降低，平均根长从8.9067cm降低到5.4133cm，平均鲜株重从0.0105g降低到0.0088g，如表1；马唐种子在萌发期间的根长与鲜株重

注：CK为无菌水

表1采用稀释10倍的该被孢霉发酵液处理的马唐种子在萌发期间的根长与鲜株重，与对照组无菌水相比，平均根长从8.9067cm降低到5.4133cm，平均鲜株重从0.0105g降低到0.0088g；

在苗期，其株高从29.0444cm降低到19.5667cm，差异显著(p<0.05)，如图1；其茎叶鲜重从17.5133g降低到11.5433g，根鲜重从7.6267g降到了5.65g，差异显著(p<0.05)，如图2；其茎叶干重从2.62g降低到1.38g，根鲜重从0.9g降到了0.5533g，差异显著(p<0.05)，如图3；对马唐苗期的抑制效果图如图4所示。本发明通过抑制马唐种子萌发期间的生根和苗期的生物量，以减轻苜蓿田的杂草危害，从而提高苜蓿草的产量和品质，为苜蓿田杂草的生态防控提供新方向，具有重要科学价值，应用前景广阔。

附图说明

图1采用稀释10倍的该被孢霉发酵液处理的马唐苗期的株高，与对照组无菌水相比，平均株高从29.0444cm降低到19.5667cm，差异显著(p<0.05)；

图2采用稀释10倍的该被孢霉发酵液处理的马唐苗期的茎叶鲜重与根鲜重，与对照组无菌水相比，其茎叶鲜重从17.5133g降低到11.5433g，根鲜重从7.6267g降到了5.65g，差异显著(p<0.05)；

图3采用稀释10倍的该被孢霉发酵液处理的马唐苗期的茎叶干重与根干重，与对照组无菌水相比，其茎叶干重从2.62g降低到1.38g，根鲜重从0.9g降到了0.5533g，差异显著(p<0.05)；

图4采用稀释10倍的该被孢霉发酵液处理的马唐苗期的抑制效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明，所用原料及试剂均可由试剂公司购得：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法本发明所涉及的被孢霉菌株MXBP304是苜蓿根际土壤中分离得到的一株菌，经过形态学和生理生化特性鉴定，最终鉴定该菌株MXBP304为被孢霉属(Mortierella sp.)。该菌株已经于2021年12月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO；M20211660。

实施例1、被孢霉菌株发酵液的制备

1、菌种保藏

将从苜蓿田根际土壤中分离得到的被孢霉菌株MXBP304菌种，一份用试管斜面保藏，斜面为GY固体培养基；另一份用50％甘油作为保护剂，放置于－80℃低温冰箱中进行保藏。

2、菌种活化

将上诉步骤1中保存的菌种接到GY培养基上进行活化4-6天；其中GY培养基包括以下组份及用量：葡萄糖20.0g，酵母膏10.0g，蒸馏水1000mL，pH自然。

3、菌种扩繁

将上述步骤2中活化的菌株接种于GY培养基上进行扩繁14天左右，直至长满整个培养皿，其中GY培养基包括以下组份及用量：葡萄糖20.0g，酵母膏10.0g，蒸馏水1000mL，pH自然。

4、发酵培养液的制备

发酵培养液采用液体马铃薯葡萄糖培养基(Potato Dextrose，PD)：称取200g马铃薯，洗净去皮切成1cm左右的小块，加蒸馏水1000mL煮沸30min，双层纱布过滤后加水补足至1000mL，再加20g葡萄糖，煮沸至固体充分溶解后分装。250mL三角瓶每瓶装100mL培养液，采用高压蒸汽湿热灭菌，在0.1MPa蒸汽压下，温度达121℃，灭菌20min。

5、菌株的发酵

将扩繁的菌株用直径为6mm的打孔器在菌落边缘打取3菌饼，将菌饼接入含有100mlPD培养液的三角瓶中培养，三角瓶置于(28±1)℃，180r/min摇床振荡培养7天，无菌条件下进行过滤，得到发酵液。

6、发酵液的稳定性

步骤5所得的发酵液，经过试验测定，其在4℃条件下放置120天后其抑制效果仍未减弱。

实施例2、被孢霉菌株MXBP304发酵液对马唐种子萌发时期的抑制作用1、材料

马唐种子于2021年10月份收于山东省青岛市胶州农业示范园苜蓿田间；净种后，将其装入信封纸袋置于4℃冰箱冷藏。

发酵液:实施例1制备的被孢霉菌株MXBP304的发酵液。

施用：使用时将发酵液按照1：10的比例兑水施用，现配现用。

2、种子预处理

本试验精选籽粒饱满、大小均一的马唐种子4袋(每袋约50粒)，先用95％的次氯酸钠溶液消毒10min，然后用蒸馏水冲洗2遍，再用无菌水冲洗3～5遍，洗净后置于烧杯中待用。

3、实验设计

通过滤纸发芽法对稗草进行发芽试验。

处理分别为无菌水对照、稀释10倍的被孢霉菌株MXBP304发酵液。

PD培养液配方为：葡萄糖10.0g，马铃薯200.0g，蒸馏水1000mL，自然。培养基均采用高压灭菌锅121℃灭菌20min。

将洗净的种子均匀摆放在垫有双层无菌滤纸的培养皿((12cm×12cm×1.5cm)中，分别加入5mL的无菌水、被孢霉菌株MXBP304发酵液进行种子萌发，每皿50粒。

实验条件为光照/黑暗(16/8h，25/20℃)。记录1-7天发芽数，之后测定其根长、苗长、株重。

实施例3、被孢霉菌株MXBP304发酵液对马唐苗期的抑制作用

1、材料

马唐种子于2021年10月份收于山东省青岛市胶州农业示范园苜蓿田间；净种后，将其装入信封纸袋置于4℃冰箱冷藏。

发酵液:实施例1制备的被孢霉菌株MXBP304的发酵液。

施用：使用时将发酵液按照1：10的比例兑水施用，现配现用。

2、种子预处理

本试验精选籽粒饱满、大小均一的马唐种子4袋(每袋约50粒)，先用95％的次氯酸钠溶液消毒10min，然后用蒸馏水冲洗2遍，再用无菌水冲洗3～5遍，洗净后置于烧杯中待用。

3、实验设计

首先在室内对消毒后的马唐种子进行催芽，在花盆里面加入适量的经灭菌的田间土，处理组为稀释10倍的该被孢霉菌株发酵液，对照组为无菌水，每个处理5个重复；催芽后将马唐移栽到花盆中，2天后补加1次相应的发酵液和无菌水，5天后再补加1次，后期均定期定量补加无菌水；待马唐到抽穗期时测定其株高和生物量。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。