一种生产5-碳化合物或其聚合物的方法

技术领域

本发明涉及微生物合成生物学、发酵工程的领域。具体涉及一种生产5-碳化合物和5-羟基戊酸相关PHA的方法。

背景技术

五碳化合物包括高附加值且昂贵的5- 氨基戊酸（5-AVA）和 5-羟基戊酸（5HV）等。5-氨基戊酸是合成新型生物基尼龙 5 的重要单体，尼龙 5 表现出最高的剩余极化率，是铁电聚合物等许多应用中理想的材料，如用于传感器和介电储能介质。并且 5-氨基戊酸作为一种添加剂可以增强混合过氧化物薄膜的机械完整性。在医疗、机械、食品和化工行业中也会有广泛的应用前景。5-氨基戊酸除了本身的功能，还是很多五碳化合物的前体物质，是构建高附加五碳平台化合物的中间枢纽，为下游衍生物应用开拓了重要的工业价值和广阔的发展空间。5-氨基戊酸能够用于合成5-羟基戊酸（5-hydroxyvaleric acid）、戊二酸（Glutarate）、δ-戊内酰胺（δ-Valerolactone）和 1,5-戊二醇（1,5-Pentanediol）等五碳化合物。5-羟基戊酸能够作为药物合成中间体，合成过程中可作为碳骨架或者增加药物的生物相容性等。含有 5-羟基戊酸单体的聚羟基脂肪酸酯（PHA）具有优越的材料性能和生物可降解性。

聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate,PHA）是一类可以由多种细菌发酵生产的环境友好型生物聚酯，是极具潜力的传统石油基替代品之一。同时，PHA在医疗保健、可降解材料、包装涂层和动物饲料等领域也有着广泛的应用前景。截至目前，组成PHA的单体结构逾160种，在赋予PHA材料较大性能差异的同时也可以更好地满足不同的应用场景。聚3-羟基丁酸-5-羟基戊酸共聚酯即Poly(3-hydroxybutyrate-

传统的发酵工业技术灭菌复杂，需消耗大量的淡水资源，容易染菌，严重制约现代工业生物技术的发展。清华大学陈国强课题组在新疆艾丁湖分离出的一株耐盐、耐碱的嗜盐菌。野生型

因此，面对日益增加的市场需求，基于嗜盐菌底盘和NGIB工艺开发更加经济、可持续和高效益生产五碳化合物、5-羟基戊酸相关PHA的方法，对进一步降低生产成本，提高可持续发展方面具有重要的作用。

发明内容

本申请将原本不产生5-氨基戊酸、5-羟基戊酸等化合物的盐单胞菌经过改造生产5-氨基戊酸、5-羟基戊酸以及5-羟基戊酸相关的PHA。对工业生产高附加值5-碳化合物和高性能PHA具有重要意义。

本发明的第一方面，提供了一种生产5-碳化合物的重组菌，所述的重组菌为盐单胞菌。

优选的，所述的重组菌的基因组中包含5-碳化合物的合成基因，所述5-碳化合物的合成基因包含L-赖氨酸单氧酶编码基因（

优选的，所述的5-碳化合物为被氨基、羟基和/或羧基取代的5-碳烷基，或者，所述的5-碳化合物为被氨基、羟基和/或羧基取代的5-碳环，或者，1位或5位分别被氨基或羧基取代后成环。

优选的，所述的5-碳化合物包括但不限于5-氨基戊酸或5-羟基戊酸。

优选的，所述的重组菌缺失戊二酸半醛脱氢酶编码基因（

优选的，所述的重组菌缺失4-氨基丁酸转氨酶编码基因（

优选的，所述的重组菌缺失

优选的，所述的 L-赖氨酸单氧酶编码基因和5-氨基戊酰胺酶编码基因来源于恶臭假单胞菌（

优选的，所述的乙醇脱氢酶编码基因来源于盐单胞菌（

优选的，所述的重组菌包含L-赖氨酸至5氨基戊酸途径；

所述的重组菌包括：

A）缺失

B）缺失

C）缺失

优选的，所述的重组菌包含5-氨基戊酸至5-羟基戊酸途径，所述的重组菌包括：

a）缺失

b）缺失

c）缺失

优选的，所述的重组菌包含L-赖氨酸至5羟基戊酸途径；

所述的重组菌包括：

A）缺失

B）缺失

C）缺失

优选的，所述的合成基因插入基因组的拷贝数为一个或两个以上。

优选的，所述的合成基因可以整合至染色体基因组上也可以包含在所携带的一个或多个重组质粒载体上游离在重组菌中。

所述的合成基因在重组菌中过表达。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的合成基因在染色体上不同位置表达。

优选的，所述的合成基因由启动子调控表达。所述的启动子可以为组成型和/或诱导型。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的组成型启动子可以为组成型孔蛋白基因porin启动子或其突变体。所述的组成型启动子可以为低强度启动子、中等强度启动子或高强度启动子。例如

在本发明的一个具体实施方式中，所述的诱导型启动子可以为IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导型T7启动子，或者AHL（高丝氨酸内酯）诱导型启动子。

优选的，所述的诱导型启动子包括但不限于P

优选的，所述的诱导剂包括但不限于IPTG或者AHL。

优选的，所述的AHL诱导浓度为0-2mM，例如0、5×10

优选的，所述的IPTG诱导浓度为0-5 g/L，例如0、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.5、2g/L，优选为0.02-2 g/L中任一数值。

优选的，所述的合成基因在一个或多个启动子的控制下表达，也可以组合为一个操纵子由一个启动子控制表达。

优选的，所述的合成基因中每个基因可以在一个质粒或几个基因组合在一个或多个质粒上。

所述的盐单胞菌属（

优选的，所述的合成基因在重组菌基因组中G4、G7位点中的任一个或两个导入。

优选的，所述的各合成基因为单拷贝或双拷贝。

根据具体实施方式的需要，所述的单拷贝或多拷贝可以通过将合成基因导入基因组中的一个或多个位点实现。例如，将合成基因导入基因组中G4或G7位点中的任一个，实现单拷贝；将合成基因导入基因组中G4和G7位点，实现双拷贝。

优选的，所述的G4位点上游序列包括SEQ ID NO：14，下游序列包括SEQ ID NO：15。

优选的，所述的G7位点上序列包括SEQ ID NO：16，下游序列包括SEQ ID NO：17。

本发明的第二方面，提供了一种生产包含5-碳化合物单体的聚合物的重组菌，所述的重组菌为盐单胞菌。

优选的，所述的重组菌的基因组中包括包含5-碳化合物单体的聚合物的合成基因，所述的5-碳化合物单体的聚合物的合成基因包括PHA合成酶编码基因（

优选的，所述的重组菌包括包含L-赖氨酸的底物生产包含5-羟基戊酸单体的PHA的途径，所述的重组菌包括上述的重组菌进一步导入PHA合成酶编码基因和5-羟基戊酸辅酶A转移酶编码基因。

所述的重组菌包括以下任一组中进一步导入PHA合成酶编码基因和5-羟基戊酸辅酶A转移酶编码基因：

A）缺失

B）缺失

C）缺失

所述的重组菌包括以下任一组中进一步导入PHA合成酶编码基因和5-羟基戊酸辅酶A转移酶编码基因：

A）缺失

B）缺失

C）缺失

优选的，所述的重组菌包括包含5-氨基戊酸的底物生产包含5-羟基戊酸单体的PHA途径，所述的重组菌包括上述的重组菌进一步导入PHA合成酶编码基因和5-羟基戊酸辅酶A转移酶编码基因。

优选的，所述的重组菌包括以下任一组中进一步导入PHA合成酶编码基因和5-羟基戊酸辅酶A转移酶编码基因：

a）缺失

b）缺失

c）缺失

优选的，所述的PHA合成酶编码基因来源于

优选的，所述的5-碳化合物为被氨基、羟基和/或羧基取代的5-碳烷基，或者，所述的5-碳化合物为被氨基、羟基和/或羧基取代的5-碳环，或者，1位或5位分别被氨基或羧基取代后成环的。

优选的，所述的5-碳化合物包括但不限于5-氨基戊酸或5-羟基戊酸。

优选的，所述的聚合物为5-羟基戊酸均聚物，或，5-羟基戊酸与其他单体的共聚物。

优选的，所述的共聚物包括无规共聚物、交替共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。

优选的，所述的单体包括但不限于3-羟基丙酸、3-羟基丁酸、4-羟基丁酸、3-羟基戊酸、5-羟基戊酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸、3-羟基十一酸或3-羟基十二酸中的一种或两种以上。

优选的，所述的合成基因插入基因组的拷贝数为一个或两个以上。

优选的，所述的合成基因可以整合至染色体基因组上也可以包含在所携带的一个或多个重组质粒载体上游离在重组菌中。

所述的合成基因在重组菌中过表达。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的合成基因在染色体上不同位置表达。

优选的，所述的合成基因由启动子调控表达。所述的启动子可以为组成型和/或诱导型。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的组成型启动子可以为组成型孔蛋白基因porin启动子或其突变体。所述的组成型启动子可以为低强度启动子、中等强度启动子或高强度启动子。例如

在本发明的一个具体实施方式中，所述的诱导型启动子可以为IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导型T7启动子，或者AHL（高丝氨酸内酯）诱导型启动子。

优选的，所述的诱导型启动子包括但不限于P

优选的，所述的诱导剂包括但不限于IPTG或者AHL。

优选的，所述的AHL诱导浓度为0-2mM，例如0、5×10

优选的，所述的IPTG诱导浓度为0-5 g/L，例如0、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.5、2g/L，优选为0.02-2 g/L中任一数值。

优选的，所述的合成基因在一个或多个启动子的控制下表达，也可以组合为一个操纵子由一个启动子控制表达。

优选的，所述的合成基因中每个基因可以在一个质粒或几个基因组合在一个或多个质粒上。

所述的盐单胞菌属（

优选的，所述的各合成基因为单拷贝或双拷贝。

本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体包含5-碳化合物的合成基因，所述5-碳化合物的合成基因至少包含L-赖氨酸单氧酶编码基因（

优选的，所述的L-赖氨酸单氧酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO：1，或者包含与SEQID NO：1具有80%以上同源性的氨基酸序列。

优选的，所述的5-氨基戊酰胺酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO：2，或者包含与SEQID NO：2具有80%以上同源性的氨基酸序列。

优选的，所述的乙醇脱氢酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO：3，或者包含与SEQ IDNO：3具有80%以上同源性的氨基酸序列。

优选的，所述的载体包含启动子，所述的启动子可以为组成型和/或诱导型。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的组成型启动子可以为组成型孔蛋白基因porin启动子或其突变体。所述的组成型启动子可以为低强度启动子、中等强度启动子或高强度启动子。例如

在本发明的一个具体实施方式中，所述的诱导型启动子可以为IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导型T7启动子，或者AHL（高丝氨酸内酯）诱导型启动子。

优选的，所述的诱导剂包括但不限于IPTG或者AHL。

优选的，所述的诱导型启动子包括但不限于P

优选的，所述的表达载体能够在宿主细胞中复制、转录及翻译。因此，其还包含常规的其他表达元件，例如核糖体结合位点、终止子、酶切位点等等。

优选的，所述的表达载体可以为原核表达载体或真核表达载体，优选为原核表达载体。

优选的，所述的表达载体为质粒。

本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体包括包含5-碳化合物单体的聚合物的合成基因，所述的合成基因包括PHA合成酶编码基因（

优选的，所述的PHA合成酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO：5，或者包含与SEQ IDNO：5具有80%以上同源性的氨基酸序列。

优选的，所述的5-羟基戊酸辅酶A转移酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO：4，或者包含与SEQ ID NO：4具有80%以上同源性的氨基酸序列。

优选的，所述的表达载体还包含L-赖氨酸单氧酶编码基因（

优选的，所述的L-赖氨酸单氧酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO：1，或者包含与SEQID NO：1具有80%以上同源性的氨基酸序列。

优选的，所述的5-氨基戊酰胺酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO：2，或者包含与SEQID NO：2具有80%以上同源性的氨基酸序列。

优选的，所述的乙醇脱氢酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO：3，或者包含与SEQ IDNO：3具有80%以上同源性的氨基酸序列。

优选的，所述的载体包含启动子，所述的启动子可以为组成型和/或诱导型。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的组成型启动子可以为组成型孔蛋白基因porin启动子或其突变体。所述的组成型启动子可以为低强度启动子、中等强度启动子或高强度启动子。例如

在本发明的一个具体实施方式中，所述的诱导型启动子可以为IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导型T7启动子，或者AHL（高丝氨酸内酯）诱导型启动子。

优选的，所述的诱导剂包括但不限于IPTG或者AHL。

优选的，所述的诱导型启动子包括但不限于P

优选的，所述的表达载体能够在宿主细胞中复制、转录及翻译。因此，其还包含常规的其他表达元件，例如核糖体结合位点、终止子、酶切位点等等。

优选的，所述的表达载体可以为原核表达载体或真核表达载体，优选为原核表达载体。

优选的，所述的表达载体为质粒。

本发明的第五方面，提供了一种包含上述表达载体的重组菌。

本发明的第六方面，提供了一种上述的重组菌的制备方法，所述的制备方法包括将5-碳化合物的合成基因和/或包含5-碳化合物单体的聚合物的合成基因导入重组菌。

优选的，所述的制备方法包括将上述的表达载体导入重组菌。

优选的，所述的合成基因可以整合至染色体基因组上也可以包含在所携带的重组质粒载体上游离在重组菌中。

所述的导入可以为将合成基因插入到重组菌的非功能区域。

所述的构建方法包括合成基因在重组菌中过表达。

优选的，采用质粒将合成基因导入重组菌，使得重组菌中过表达合成基因。

优选的，所述的质粒中包含5-碳化合物的合成基因和/或包含5-碳化合物单体的聚合物的合成基因。

优选的，所述的制备方法优选为基因编辑技术，例如CRISPR-Cas9或者Loxp-cre系统。在本发明的一个具体实施方式中，采用与大肠杆菌接合转化的方式将导入基因导入盐单胞菌。

优选的，所述的导入为将5-碳化合物的合成基因和/或包含5-碳化合物单体的聚合物的合成基因插入盐单胞菌的基因组中。

本发明的第七方面，提供了一种生产5-碳化合物或包含5-碳化合物单体的聚合物的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。

所述培养使用的培养基可以为液体、固体或半固体。

所述培养基可以为自然培养基、合成培养基和/或半合成培养基。优选的，所述的培养基可以采用现有技术常规的培养基，也可以采用含有营养成分的其他物质。所述的常规的培养基包含无机盐培养基（MMG）、Luria-Bertani培养基（LB）等等。

优选的，所述培养基中包含碳源和/或氮源等等。所述的氮源包含无机氮源和/或有机氮源。进一步优选的，所述的发酵的培养基中还包含维生素和/或生长因子。

优选的，所述的碳源包括但不限于葡萄糖或能够分解为葡萄糖的糖、脂肪或蛋白质；或者，L-赖氨酸或能够分解为L-赖氨酸的蛋白质；或者，5-氨基戊酸或5-羟基戊酸。

优选的，所述的碳源为葡萄糖和/或L-赖氨酸。

优选的，所述的无机氮源包括但不限于硫酸铵、硝酸盐、氨水或尿素；

所述的有机氮源包括但不限于黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母提取物或鱼粉。

优选的，所述培养基中包含无机盐，所述的无机盐包括但不限于可以提供Na

优选的，所述的培养基包括尿素（urea）和/或酵母提取物（yeast）。

优选的，培养基中尿素浓度为0.5 g/L-2 g/L，如0.5 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0g/L、1.2 g/L、1.5 g/L 、1.6 g/L或2 g/L等浓度。

优选的，培养基中酵母提取物浓度为0.5 g/L-2 g/L，如0.5 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.5 g/L 、1.6 g/L或2 g/L等浓度。

优选的，所述的培养基中盐浓度为10 g/L-50 g/L，如10 g/L、20 g/L、30 g/L、40g/L或50 g/L。

优选的碳源浓度为5 g/L-50 g/L，如5 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L或50g/L。

优选的，所述的发酵方法为开放式发酵。

优选的，所述的发酵方法为全细胞催化法。

优选的，全细胞催化法包括加入L-赖氨酸、Triton-X100和/或乙醇等改善细胞膜的通透性。

优选的，所述发酵的设备可以为摇瓶、小试发酵罐、中试发酵罐或者工业大量生产的大型发酵罐。

本发明的第八方面，提供了一种生产5-氨基戊酸的方法，所述的方法包括发酵培养重组菌。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组菌包含5-氨基戊酸的合成基因，所述的5-氨基戊酸的合成基因包含L-赖氨酸单氧酶编码基因和/或5-氨基戊酰胺酶编码基因。

优选的，所述的重组菌缺失

优选的，所述的发酵方法为开放式发酵。

优选的，所述的发酵方法为全细胞催化法。

优选的，全细胞催化法为不同时间点加入不同浓度的L-赖氨酸和Triton-X100和/或乙醇等改善细胞膜的通透性。

优选的，所述的发酵过程中的碳源包括但不限于葡萄糖或能够分解为葡萄糖的糖、脂肪或蛋白质；或者，L-赖氨酸或能够分解为L-赖氨酸的蛋白质。

优选的，所述发酵的产物还包含PHA。

优选的，所述发酵的培养基为常规培养基或者为了适应微生物的生存和产生产物适当的调整培养基的成分。

优选的，所述发酵的设备可以为摇瓶、小试发酵罐、中试发酵罐或者工业大量生产的大型发酵罐。

本发明的第九方面，提供了一种生产5-羟基戊酸的方法，所述的方法包括发酵培养重组菌。

优选的，发酵的培养基中包含葡萄糖或能够分解为葡萄糖的糖、脂肪或蛋白质；L-赖氨酸或能够分解为L-赖氨酸的蛋白质，或者，5-氨基戊酸。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组菌包含5-羟基戊酸的合成基因，所述的合成基因包含L-赖氨酸单氧酶编码基因、5-氨基戊酰胺酶编码基因或乙醇脱氢酶编码基因中的一种或两种以上的组合。

优选的，所述的重组菌缺失

优选的，所述的发酵在开放的条件下进行。

优选的，所述发酵的产物还包含PHA。

优选的，所述的生产方法为全细胞催化法

优选的，所述的发酵培养基中包含不同浓度的TritonX-100。

本发明的第十方面，提供了一种生产5-羟基戊酸相关PHA的方法，所述的方法包括发酵培养重组菌。

优选的，发酵的培养基中包含葡萄糖或能够分解为葡萄糖的糖、脂肪或蛋白质；或者，L-赖氨酸或能够分解为L-赖氨酸的蛋白质，或者，5-氨基戊酸或5-羟基戊酸。

优选的，所述的重组菌包含合成基因，所述的合成基因包含5-羟基戊酸辅酶A转移酶编码基因和/或PHA合成酶编码基因。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的合成基因还包含乙醇脱氢酶编码基因。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的合成基因还包含L-赖氨酸单氧酶编码基因、5-氨基戊酰胺酶编码基因和乙醇脱氢酶编码基因。

优选的，所述的重组菌缺失

优选的，所述发酵的产物还包含PHA。

优选的，所述的合成基因还包含β-酮硫解酶编码基因和/或NADPH/NADH依赖型乙酰乙酰基还原酶编码基因。

优选的，所述的发酵培养基中包含不同浓度的Triton-X100。

本发明的第十一方面，提供了一种上述的重组菌、上述的表达载体、上述的制备方法或上述的生产方法获得的5-碳化合物或包含5-碳化合物单体的聚合物在制备可降解的生物新材料或药物中的应用。优选在开发医用器械、医用微球、手术缝合线、补片、一次性包装材料或纺织纤维等中的应用。

本发明所述的“聚合物”包括5-羟基戊酸相关PHA，所述的PHA为均聚PHA和/或共聚PHA。优选的，所述的PHA选自3-羟基丁酸（3HB）均聚物PHB。3-羟基丁酸（3HB）和5-羟基戊酸（5HV）二元共聚物P3HB5HV。3-羟基丁酸（3HB）、5-羟基戊酸（5HV）和4-羟基丁酸（4HB），或3-羟基戊酸（3HV），或3-羟基己酸（3HHx）或3-羟基丙酸（3HP）构成的三元共聚物，简称为P(3HB-

本发明所述的“合成基因”可以通过一定的方式导入细胞中，其可以是细胞中原本含有的基因种类也可以是细胞中原本不含有的基因种类。当然，其根据实际需要可以调整其具体序列，例如如果是来源于其他种属或者分别来源于革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，则可以进行密码子优化，更适合盐单胞菌。例如，

本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤；当用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本问列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。

本发明所述的“过表达”为将基因上调表达，高于原本天然的表达量或使得原本不表达变为表达。

本申请简写与全称对照:

DavB: L-赖氨酸单氧酶，

DavA: 5-氨基戊酰胺酶，

GabD:戊二酸半醛脱氢酶,

GabT: 4-氨基丁酸转氨酶,

AbfT: 5-羟基戊酸辅酶A转移酶,

PhaA：β-酮硫解酶编码基因,

PhaB：NADPH/NADH依赖型乙酰乙酰基还原酶编码基因,

PhaC： PHA合成酶,

YqhD：乙醇脱氢酶。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：本申请的技术路线，重组盐单胞菌菌株，以 L-赖氨酸和葡萄糖为底物生产5-碳化合物或其聚合物模式图，其中生产3-羟基丁酸的通路为盐单胞菌的内源路径。

图2：模块1生产5-氨基戊酸的诱导型质粒示意图，pSEVA321-P

图3：5-氨基戊酸的代谢通路改造。

图4：5-羟基戊酸二级质谱结果图（a）标样质荷比（b）样品质荷比和5-氨基戊酸二级质谱结果（c）标样质荷比（d）样品质荷比。

图5：盐单胞菌

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中使用的培养基配方：

1）大肠杆菌生长在LB培养基中，培养基成分配置含有：5 g/L的酵母提取物，10 g/L的氯化钠，10 g/L的蛋白胨。

嗜盐菌如无特殊说明，均在60 LB和50 MM的培养基上培养。60 LB成分为5g/L的酵母提取物，60g/L的氯化钠，10g/L的蛋白胨。

大肠杆菌和嗜盐菌的培养条件为37℃，200 rpm。

2）摇瓶发酵5-氨基戊酸、5-羟基戊酸和5-羟基戊酸相关PHA培养基：

60LB发酵培养基：60g/L氯化钠，5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，0.1-50g/L相关碳源组合。

MM培养基：0.1-50g/L相关碳源组合，10-50 g/L氯化钠，1-10g/L酵母提取物，3-6g/L尿素，1.5-5.2g/L磷酸二氢钾，0.2-1 g/L硫酸镁，8.5-10g/L磷酸氢二钠，7-15ml/L的组分III，1-5ml/L组分IV。其中，50MM培养基指含盐量50g/L的MM培养基。

组分III：5 g/L柠檬酸铁铵，2 g/L二水氯化钙，浓盐酸（12 mol/L）41.7 ml，加水定容至1000 ml。

组分IV：100mg/L七水硫酸锌，30mg/L四水氯化锰，300mg/L硼酸，200mg/L六水氯化钴，10 mg/L无水硫酸铜，20 mg/L六水氯化镍，30 mg/L二水钼酸钠。

以上培养基均可以采用标准配制方法制得。

3）本专利中所使用的嗜盐菌基因编辑技术为CRISPR/Cas9和CRISPR/AID技术，包括内源DNA敲除和异源DNA整合技术，参见文献Qin et.al. CRISPR/Cas9 editing genomeof extremophile

4）细胞干重测定方法：

用离心管收集一定体积经摇瓶或发酵罐培养后的菌液，12000 rpm离心30 min后，弃上清收集菌体；用适量去离子水重悬菌体后以12000 rpm离心30 min，弃上清后再次收集菌体；将得到的菌体沉淀置于-80℃低温冰箱冷冻1h以上后，放入真空冷冻干燥机内至恒重；称量离心管和管内干燥菌体的总重；利用差量法计算细胞干重。

5）5-羟基戊酸相关PHA检测方法：

取30-40 mg干燥的菌体或10-30 mg左右标样（聚3-羟基丁酸酯或5-羟基戊酸酯）置于酯化管中，加入2mL酯化液（色谱纯甲醇溶液中添加3%（v/v）浓硫酸和0.5g/L苯甲酸）和2mL氯仿，加盖密封；100 ℃恒温反应4 h后冷却至室温；每管均加入1mL去离子水，振荡混匀后静置至液体完全分层；吸取适量的下层样品用于GC分析；GC分析程序为：柱温由室温升至80℃后停留90 s，0.5℃/s的速率升温至140℃后停留0s，0.7℃/s的速率升温至240℃后停留分析120 s，降至室温结束分析；采用内标归一法，根据峰面积值对PHA进行定量分析，并计算出PHA及3HB和5HV占细胞干重的摩尔比。

6）5-氨基戊酸、5-羟基戊酸的HPLC检测方法

（1）5-氨基戊酸的检测方法为：氨基酸及氨基酸衍生物经过乙氧基甲叉丙二酸二乙酯（DEEMM）衍生反应之后，采用 HPLC 进行分析（HPLC-20A，日本）。使用的分析柱为 C18柱（安捷伦，美国）。分析柱的特征是4.6×250 mm，5 μm粒径。

实验操作如下：配制流动相A和流动相 B。流动相A是纯乙腈，使用 0.22 µm 尼龙滤膜过滤；流动相 B 是 25 mM 的乙酸钠（pH 调至 4.8），使用 0.22 µm 纤维素膜过滤。流动相A和B都用超声排气30 min，保证流动相中无气泡。

HPLC 的具体程序是：流动相 A 的体积占 20-25%，持续 0-2 min；体积占比为25-60%，持续 2-20 min；体积占比为 60-20%，持续 20~30 min。紫外吸光度的波长是 284nm，温度 35℃，流速为 1 mL/min。

（2）HPLC 测定5-羟基戊酸的含量：发酵液同样12000 rpm 离心 10 min，取上清液200 μL,再加入 1mL 水，稀释反应液为 6 倍。使用 0.22 µm 纤维素膜过滤稀释液体，采用HPLC 检测 5-羟基戊酸的产量。采用的分析柱是 HPX-87H（安捷伦，美国）。流动相为5 mM的稀硫酸，流速为 0.5 mL/min,柱温达到60℃。5-羟基戊酸的标样浓度分别是 0.25 g/L、0.5g/L、1 g/L、2 g/L 和 4 g/L。

实施例中关于嗜盐单胞菌的位点例如G4和G7参照文章：

实施例中应用的野生菌种来源：

Halomonas bluephagenesis

Halomonas campaniensis

Halomonas aydingkolgenesis

本申请通过重组盐单胞菌株，以 L-赖氨酸和葡萄糖为底物生产 5-氨基戊酸、5-羟基戊酸和5-羟基戊酸相关PHA如 P（5HV-

本专利所述的实施方式是对生产5-氨基戊酸、5-羟基戊酸和5-羟基戊酸相关PHA的重组嗜盐菌构建方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

实施例1：质粒系统生产5-氨基戊酸的菌株的构建和优化（模块1：L-赖氨酸——5-氨基戊酸）

菌株

SEQ ID NO：1 DavB

MNKKNRHADGKKTGDADDWHAGGSARHGVAVGAGAGVAAYMKGKVVYASKGGRRSANGTDGVAGGMRVSSTAYHYVDKGTKNTASGSTVDGTYYAKTDHVADAWADASGAADARDRDVRKWNKVWDDRTYDVATSRSAKSHRVGVGGTGGWDSDNSMRVVMTNCDDHHVVGGVVGWRDVRCVHWGTSSTHGGARTGVKRARAADGRAVTDNWGDTRHYSAVATCTWTTDCSSKMWMADRTRYMSSKTVMVDRWKDKDTGRDSMTTDRTRGTYDNGNDKGVCSYSWMSDAKMHVKRVADAKKYKTDAGHGDTVSWADYGAKGAGHYRYNRMYAHMDMARGAGDDVSWTAWVGAVTSNAVWGMNHGGHTHDNGGDVNGAAD

SEQ ID NO：2 DavA

MRAYGAKDVGNRRHAAADRGAVCMSGYNGAVRAAADGAAMTVVAAHRAVYGYRGDDGAYNSVDAHGRSSNYRKTHGDRSMSGADHVVGWKVGCYDNARRADGAVTANMTYDTCVTVRARANCYVYANYCGADYCGSSGDGSAMAGRDCAHRVVGRRAYTDRHRKG

SEQ ID NO：6 GabD

MSFIEKWLHDAVPTLVGGEWRKGQQTFAVDNPATGETIARVADLGADDARDAVAAAYAAGPAWRATPVKQRSALLRRWFDLINEHADDLARLMTLEQGKPLAEAKGEVTYGASFIEFFAEEAKRMAGETLPSHGADKRLLVLREPVGVVAAITPWNFPLAMITRKCAPALAAGCTVVIKPAEATPLTALATAYLALEAGLPAGTINVITASKPAAVGEVLTTDSRVRKVSFTGSTPVGKHLLAQCASTVKKTAMELGGNAPFIVFDDADVDAAVEGAIASKFRNAGQTCVCTNRFLVQDGVYDAFVSKLTERVSALKVGDGLTEGSTIGPLINQAAVEKVQRHVDDAVNHGARLLCGGKPHAAGERFFTPTVLADVTTQMAVADEETFGPVAPVFRFHRDEEAIAMANDTPFGLAAYFYATGYRRIWHTMEQLEYGMVGVNEGLISTELAPFGGVKESGLGREGSHHGLDEFTELKYVCVGGL

SEQ ID NO：7 GabD

MSFIEKWLHDAVPTLVGGEWRKGQQTFAVDNPATGETIARVADLGADDARDAVAAAYAAGPAWRATPVKQRSALLRRWFDLINEHADDLARLMTLEQGKPLAEAKGEVTYGASFIEFFAEEAKRMAGETLPSHGADKRLLVLREPVGVVAAITPWNFPLAMITRKCAPALAAGCTVVIKPAEATPLTALATAYLALEAGLPAGTINVITASKPAAVGEVLTTDSRVRKVSFTGSTPVGKHLLAQCASTVKKTAMELGGNAPFIVFDDADVDAAVEGAIASKFRNAGQTCVCTNRFLVQDGVYDAFVSKLTERVSALKVGDGLTEGSTIGPLINQAAVEKVQRHVDDAVNHGARLLCGGKPHAAGERFFTPTVLADVTTQMAVADEETFGPVAPVFRFHRDEEAIAMANDTPFGLAAYFYATGYRRIWHTMEQLEYGMVGVNEGLISTELAPFGGVKESGLGREGSHHGLDEFTELKYVCVGGL

首先进行诱导水平的优化，获得生产5-氨基戊酸的AHL最优浓度，如表1所示，底物L-赖氨酸 5 g/L。其中AHL的最佳添加浓度为5X10

表1不同AHL浓度诱导pSEVA321-P

其次，进行培养基条件的优化。使用50 MM作为对照，进行摇瓶发酵，在摇瓶实验的过程中，优化其中酵母提取物和尿素的浓度并进行组合培养，进一步检测对5-氨基戊酸产量的影响。摇瓶实验的条件是初始添加 AHL 5X10

表2 培养基不同成分的优化对5-氨基戊酸产量的影响

此外，为了提高5-氨基戊酸的产量，需要敲除内源的

SEQ ID NO：8 GabT

MKMSNAQLNELKQKYVANGAASPATQFADRAENAIIWDADGNRIIDFAGGIGVLNIGHCHPKVVEAVREQLGRVMHTCQTVIPYEGYVKVAEKLSQLTPVRGHAKVMLVNSGAEALENAVKVARAATGKNNVICFDGGYHGRTFMTMAMNGKVAPYSADFGSMPGNVFRAPYPVPFHGVSEEDALRGLKMTLKTDANPKDTAAIVIEPVLGEGGFYPAPASFLKAVREICDEHGMLMIVDEVQSGFGRTGKLFAIEHSGVQPDIITMAKSMAGGMPISALVGTAEHMDASGPNSLGGTYSGSPVSCAAVLAVLEVLEEEKILEKSQALGEVLGQRFTQWQQRFACVENVRHLGSMAALDIVSAGQEPDAELAAAMCKRAREKGLILLSCGLYGNTIRFLMPVTIEDSILEEGLAIVEALLEELTA

SEQ ID NO：9 GabT

MSNAELNELKQKYVAAGAASPATAFADRAENAEIWDADGNRFIDFAGGIGVLNVGHRHPKVVAAVKAQLDKVMHTCQTVMPYEGYVKVAEKLSHIVPVRGHAKVMLANSGAEALENAVKIARAATGRSNVICFDGGYHGRTFYTMAMNGKVAPYQTDFGPMPGTVFRAPYPVPYHGVSEDEAIRGLKMTLKTDANPKDTAAIVLEPVLGEGGFYPASKSFLEKIREICDEHGILMIIDEVQSGFGRTGKMFAIEHSGVEPDIMTMAKSMADGMPISAIVGTDKVMDASGPNSLGGTYTGSPTACAAALAVLEVFEEENILEKSQALGEKLAARFGEWQNKFDCIDHVRNMGAMAAFELVSNKTDRTPNAELAAALCKKAREEGLILLSCGMYGNTIRFLMPVTIEDSVLNEGLDIIESCLESLV

表3

实施例2：基因组整合生产5-氨基戊酸的菌株的构建和优化（模块1：L-赖氨酸——5-氨基戊酸）

本文进一步构建工程化菌株

SEQ ID NO：14 G4上游

gtgcgcttgccacagcttcgcgctcgttctgtggctccggcagcatcgacgaatagtaggcgattcgctggaaacggtcggtcggcttgacgttccctggcagcggtgtatcgctgcttgggtttgaaaagtctaattcttccagcagtgccaattgctgatcgtaaggcggatcattggtcatgattctaaattctctaccgtggtgaatcatggattcaccatcgatatattcaatgatcgctgaatccccagtagcatcttcaattgccaaatgtacggttgccttactaccccgcgcctccgccatgacaatttgtacatcttcgagtatgtcgagtgcttcttcgacagtggctgcgttgtcgatcacatattgcccccacaaacctgcctgcattcctggtttgccagggtcacgcgggccaaagtcggtggccgtgagatagagcatgtggaacgccagccccttttcgttgaatccatcggcagcgccgatgccataaaccgtggtgaccatgctggcgtacttcgacgtccatgttgctgcgttctcctccacgacgacttccgcgcccagcatgcccccatttcgctccatgccacgggggaagacagtaataaccggatctgtcgattcgggccagtccattgtgcgggcaacataaatgccctgctcgttgtcattccataagtacctagaacacgcccatgctgcattggccattaccatcgcaccaatcacgatggcaacgccccctctgtaatacctacgcatgaattactcctttagagcgtgtaaatcgccagcacaacgcccttatgaaaagacgcttaaatcgagcgtctgattaaaggccgatagcccaaagcaggctcgagcaatcagccttccacccaagctattttcgttaattctttaccccagaaaaactccacaaatacaaaatatagttaacttttgaggcgatgcaaatccaccttccgagcacatcgatca

SEQ ID NO：15 G4下游

ctcaccttcatttccttatgctgaacacggtaagcttggcgataacaccgctactgatggctaaaaatcaacgatgacttcccattggatacttggccctggggccattggtcgcctgttggcgcattcgctttcacccattactgacatcaccttgattggccgacgtgcattgcctgaacagcaacgcctgaccacccctgaaggtgaagaacgaactcagcggctagcgagcgttacggttgcggagctagcctctcactcactgcctgtgcctgggtttgtgcatatcaccaccaaagccatggccgccgaggcggcgcttgccagcattgccgatgtggttgcgcccacgaccccgctggtgctgtggcagaacggttttttggcacagccacggctgactgataggtggccagggccagtgctgtgtgcgaccacgactcaaggcgcttacttaaccggcagtgatggcgtggttcacgccgggcgcgggccgacgtttattggtgatctcaacaatcaacgcgctgcgctagcaaaaacactggcgcagacgttaggtgaggcaggctttaccgccacgccggtagacgatattcgccaacgcctgtggcaaaagctggcggttaatgcggcgatcaacccattggtggcgctcaatggcgtgcgcaatggtgagctgcgcggtgatgcttatgcagtccgtttggcagcggtggtaaaggaagtcgcggcgattttaaagcaggaaaacattgcaccaccgaatggtggcgaaggtgaagacgcgtggttggcgcttgtgtggcaggtggtggagaacaccgctaacaataaggcctcgatgttgcaggatgttgaggccagacgcaccaccgagcgcggggcgattttagggccgttgattgatagcgccgagcgccatgggttgccgtgtgggttgttgaaggagcttgatagcgaattggctaaattggaggcgaagttttagggaaca

SEQ ID NO：16 G7上游

tatcaagctgcccgttgctgaccagatttctgtctgatactagatttttggccagattctggtgtaacgcctgattgaccgaagcgttgtattcacgcagcgaatagaggctgatgaaggtatatagcaggcccacggcgagcaataacagaaataagcctaaggctagccgagtatagagtgttttcagcataacttattcgcggaagcgatagcccacccccccaacggtttggataaacaccgggtcagcggggtccgcttcgatcttgcctcgtaagcgattgatatgagtattgacggtatgttcgtaaccttcgtggctgtagccccacacggtatcaagcagttgggcacggctaaatacccgccctggatgtgtggcaaagtgccatagcaggtcaaactcccgggcagtgagttcaacaggctggtcttttataaatacccgccgacgcagcgggtcaatgcgcagcccatcggtgattaatgcttgctggctggggtccgtgactgaggaagatgccatggcatctacgcgtcggaacaaggctttcacccttgctgatagttcagccacactgaaaggtttggtgaggtaatcatccgcccccatttccaggcccagcactcgatcaagctccgtacttttggcggttagcatcagtaccggaacgtaacctgggccggcgcggatttcgcggcaaattgacagcccgtccaggccgggcagcatcaggtcgagaaccacaaggtcgatgcccccttcacgaaaacgctcaagcccggaatcaccgcgctcgcaaagaatagggttcatgccaagctcggccacatgcatgcggacgagttcaccaatacccgggttatcctcaataatcagtacgtttcgtgtcataggtagtcgcattatcttcttttgtgctttcgccttatggctctaggcgcttggatgctcgtgatattttcctactcattggtcggaagattcgagactatc

SEQ ID NO：17 G7下游

ggtgatatagagtgtatcgcgcaaagttcacaaatgtgtcacggggactctaacgatagggcgatgtctgcattaacgcctcccctcatttcaataagtgtgtttcagcaaggagagcgcccatggcgactacacgccgtaaactcatgtcgttaatcgggcagggagtgatacctcctgagcaagtgccgttagcggttaaagtggcggggctgcacccgtcgccccacgcctgggcgctgttgattgaccggctgctactgtggctggggagcttggcgttggcttgcgcggtgctgttcttcgtggctttcaattggtcggacatgggccgcctgccgcgctttgcgttagtgcaggctgcgttggtgttggcggcaggcatcgcggtgtggggcagcgcgagcgtgatgctttttcgcgtgacgttaactgctgcgtctctattgataggagtactactggcgctggtgggtcagatttaccaaaccggtgctgacccatggcagctgtttttcacctgggcgctgctcaccttgccattggtatggatagcacgctttgatgcgctttggttggcgtggttagggcttttgaacctatccgtgtggctgtatagcagcacctggggcggtgtttttggcaatgtgttctctgccgataacgcgggcttatggggactggtgctgatcaacttagtggctcaagtcgtgtgggagtggggcgcgcagcgccgaggttggccggggcgttgggcgatttgcttactggcgctaggtagcggcgtgccactgacgctactgatgatggcgtgggtgagcggggaaacgcatgcgttgacaccgattgtggcggtttaccctgtgtggttggcagtgctgtatggcgtttatcgtcagtggcggcttgagctatttatgttggcagggggctgcgtctcggtgattgcggtggtcacattgctgcttgcacgctacatgctatgggaaagccaatggaa

构建生产5-氨基戊酸的重组菌的具体方法：基因组插入

将重组菌接种到20 mL的60 LB培养基中，培养12 h后按1%的体积比转接到新的20mL的60 LB培养基中，继续培养10 h。菌液培养12h后即为种子菌液，将1 mL的种子菌液接种到含有19 mL 50 MM-YU培养基的100 mL锥形瓶中，进行摇瓶实验。摇床温度为37℃，转速为200 rpm，发酵时间为48 h。发酵结束后离心取上清通过高效液相色谱分析5-氨基戊酸的含量，如图4所示，确认5-氨基戊酸生产成功。

进一步针对插入不同拷贝，不同强度的

表4 不同拷贝数插入

实施例3构建生产5-氨基戊酸的重组嗜盐菌

首先，按照文章Engineering of

具体操作如下：

使用接合转化的方法将带有氯霉素抗性的质粒PYF17各自转化到LSΔ

将接合了质粒PYF17的LSΔ

结果说明，经过优化的5-氨基戊酸合成基因簇能在

实施例4构建生产5-氨基戊酸的重组菌

首先，按照文章：Engineering of

具体操作如下：

使用接合转化的方法将带有氯霉素抗性的质粒PYF17各自转化到M1Δ

将接合了质粒PYF17的M1Δ

结果说明，经过优化的5-氨基戊酸合成基因簇能在

实施例5：5-羟基戊酸表达模块的构建（模块2：5-氨基戊酸——5-羟基戊酸）

构建pSEVA321 - P

SEQ ID NO：3 YqhD

MKAAVVTKDHHVDVTYKTRSKHGAKMCCGVCHTDHVKNGDGDKTGVGHGGVVAVGGVTSKGDRASVAWYGCGHCYCNSGNTCRSVKNAGYSVDGGMACVVADYAVKVDGDSAAASSTCAGVTTYKAVKSKRGWAYGGGGNAYAKNVNAKVADVNDKATMGADANSHTDAAKVKTGGAHAAVVTAVAKAANSAVDAVRAGGRVVAVGSMSDRVDGVVGSVGTRDTAAAGKVVKVARADNTTMGKRGRMVDRH

表5 利用5-氨基戊酸生产5-羟基戊酸的产量（模块2）

实施例6 5-羟基戊酸相关PHA表达体系的构建（模块3：5-羟基戊酸——相关PHA）

5-羟基戊酸也可以作为PHA的前体物质，参考（Yan X, Liu X, Yu L P, et al.Biosynthesis of diverse α, ω-diol-derived polyhydroxyalkanoates byengineered

SEQ ID NO：4 AbfT

MDWKKYDRTCTADAVKSKSGDRVAHCVAVVAMVANAAAYKNVTVSHMVTGKGYSKYKNTGWTSSTRGSAGHGVVHVSRKDHVDVMVMVSDHNGCCVGVSSDYTMAKSAKVAVNDVVVYGDTVHVSDKVTSHGKGVAAGKHCASDGSTGGADAVSKDKKHGHSMSDGVVDYAGVDCSKSDKGKMATMGTKRYDAANNKVKVDYNHSVVACSKMVCNACVDMGVSDSGTKSGVGGVDVRGASMSDGKGKAAMSVAKKKDGSMSKVDHGAAVTTSRNDADYVVTYGAMKGKSDRARANAHDKDKAKRNAA

SEQ ID NO：5 PhaC

MATGKGAAASTGKSKVTGDATWWSRWGTGNGHAAASGGDAAGVKAAGDRYMKDSAWAMAGKAATGHDRRAGDAWRTNYRAAAYNARATADAVADAKTRRRASWVDAMSANATNARSGGSRAGVRNMMDTRGKSTDSAVGRNVAVTGAVVNYYKTDKVHARMVCNKYYDSSVRHVVGHTVVSWRNDASMAGSTWDDYHAARAVARDSGDKNVGCVGGTVSTAAVAARGHAASVTTTDADTGDVVDGHVRATGGGAGACARGANTSRNDVWNYVVDNYKGNTVDWNGDATNGWYCWYRHTYNKVGKTVCGVVDASDVTYYGSRDHVWTAAYASTAANKRVGASGHAGVNAKNKRSHWTNDASWAGAHHGSWWDWTAWAGAGAKRAAANYGNARYRAAGRYVKAKA

具体实施过程如下：

（1）组成型

选取了两个不同强度的porin启动子表达，构建好的组成型表达质粒pSEVA341-P

通过外加5-羟基戊酸实现5-羟基戊酸相关PHA的生产。

通过

表6 包含组成型

实施例7：以L-赖氨酸为底物生产5-羟基戊酸（模块1+2：L-赖氨酸——5-羟基戊酸）

优选的构建生产5-羟基戊酸的重组菌：

将实施例5中的YF82中所用的质粒导入到菌株

构建的生产5-羟基戊酸的重组

表7工程化菌株YF117-2以L-赖氨酸为底物生产5-羟基戊酸的含量

实施例8 以5-氨基戊酸为底物生产5-羟基戊酸相关的PHA（模块2+3：5-氨基戊酸——相关PHA）

结合实施例5和6构建组成型质粒系统PYF278（pSEVA341-P

表8 以5-氨基戊酸为底物生产5-羟基戊酸相关PHA的情况（模块2+模块3）

实施例9以L-赖氨酸合成5-羟基戊酸相关的PHA（模块1+2+3：L-赖氨酸——相关PHA）

结合实施例8获得的结果，将质粒PYF278转入到

表9 以L-赖氨酸为底物合成P（5HV-

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。