靶向表达SYKR表面抗原的细胞的嵌合抗原受体

技术领域

本发明涉及细胞免疫治疗技术领域，特别涉及一种靶向表达SYKR表面抗原的细胞的嵌合抗原受体。

背景技术

神经退行性疾病通常是由于中枢神经系统中神经毒性物质的累积所导致的，包括β淀粉样蛋白(Aβ)和髓鞘碎片等，这些神经毒性物质的累积会促进神经元的损伤和死亡，从而导致认知衰退、运动缺陷、精神障碍等症状。小胶质细胞是中枢神经系统中的吞噬细胞，负责清除这些神经毒性物质，从而保护神经元，但是，人们对于调控小胶质细胞神经保护功能的关键分子仍然知之甚少。

小胶质细胞表面的酪氨酸激酶受体(SYKR)对于其清除Aβ至关重要，在小胶质细胞中敲除SYKR会加剧Aβ沉积、AD相关的神经病理以及认知缺陷，而激活SYKR可以抑制Aβ累积。SYK也调节小胶质细胞吞噬髓鞘碎片，影响多发性硬化症。总的来说，SYKR是小胶质细胞表面在神经退行性疾病中发挥神经保护功能的关键受体。

细胞免疫治疗是一种常见的免疫治疗方法，其构建嵌合受体(CAR)并将该表达载体导入到从人体分离的免疫细胞中，使免疫细胞表面能表达特异性的CAR，然后将其回输至人体。特异性的免疫细胞能够特异性识别靶细胞，并对其进行杀伤。嵌合抗原受体中单链抗体结构域将免疫细胞靶向目标细胞，胞内信号结构域释放胞内信号，启动免疫细胞的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向表达SYKR表面抗原的细胞的嵌合抗原受体，用于杀伤小胶质细胞，为小胶质细胞中高表达SYKR受体的阿尔兹海默症患者细胞治疗提供借鉴。

鉴于此，本发明的方案为：

靶向表达SYKR表面抗原的细胞的嵌合抗原受体，包括SKYR结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域；所述SKYR结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：3-4所示。

优选地，所述跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

优选地，所述细胞内信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

优选地，编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供一种重组表达载体，包括嵌合抗原受体表达框和复制系统；所述嵌合抗原受体表达框由可在T细胞中表达的启动子，和位于所述启动子下游的编码的核酸组成；所述核酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述重组表达载体通过将所述编码嵌合抗原受体的核酸插入慢病毒表达载体中的CMV启动子的3’下游得到。

本发明另外还提供转染有以上所述重组表达载体的慢病毒。

本发明还提供感染有以上所述慢病毒的T细胞，得到CAR-T细胞。

本发明还提供一种小胶质细胞抑制剂，包括以上CAR-T细胞，对于小胶质细胞具有特异性杀伤作用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提供的嵌合抗原受体可通过表达于T细胞中得到CAR-T细胞可对表达SYKR受体的小胶质细胞具有特异性杀伤作用，可为小胶质细胞中高表达SYKR受体的阿尔兹海默症患者细胞治疗提供借鉴和方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明嵌合了抗原受体的重组表达质粒示意图。

图2为本发明重组抗原受体功能域结构示意图。

图3为本发明重组抗原受体在T细胞中的表达结果示意图。

图4为本发明CAR-T细胞的对小胶质细胞的特异性杀伤活性结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合附图和具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。

实施例1SKYR重组表达质粒的构建

基因序列委托金唯智公司合成。通过分子生物学的方法构建到慢病毒载体pLVX-IRES，合成的序列置于启动子CMV的后方。得到嵌合了抗原受体的重组表达质粒，如图1所示。

合成序列如下(SEQ ID NO：1)：

atggggacctgtgacattgtgactgaagccaatatctcatctggccctgagagcaacaccacgggcatcacagccttctccatgcccagctggcaactggcactgtgggccacagcctacctggccctggtgctggtggccgtgacgggtaatgccatcgtcatctggatcatcctggcccatcggaggatgcgcacagtcaccaactacttcatcgtcaatctggcgctggctgacctctgcatggctgccttcaatgccgccttcaactttgtctatgccagccacaacatctggtactttggccgtgccttctgctacttccagaacctcttccccatcacagccatgtttgtcagcatctactccatgaccgccattgctgccgacaggtacatggccatcgtccaccccttccagcctcggctttcagctcccagcaccaaggcggttattgctggcatctggctggtggctctcgccctggcctcccctcagtgcttctactccaccgtcaccatggaccagggtgccaccaagtgcgtggtggcctggcccgaagacagcgggggcaagacgctcctcctgtaccacctcgtggtgatcgccctcatctacttcctgccgctcgcggtgatgtttgtagcctacagcgtcatcggcctcacgctctggaggcgcgcagtgcccggacatcaggcgcacggtgccaacctgcgccacctgcaggccaagaagaagtttgtgaagaccatggtgctggtggtgctgacgtttgccatctgctggccgccctaccacctctacttcatcctgggcagcttccaggaggacatctactgccacaagttcatccagcaagtctacctggcactcttctggttggccatgagctctaccatgtacaatcccatcatctactgctgtctcaaccacaggtttcgctctggattccggcttgccttccgctgctgcccatgggtcacacccaccaaggaagataagctcgagctgactcgcacgacctccctctccacgagagtcaacaggtgtcacactaaggagactttgttcatggctggggacacagccccctccgaggctaccagtggggaggcggggcgtccccaggatggatcagggctatggtttgggtatggtttgcttgcccccaccaaaactcatgttgaaatttga

表达的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO：2)：

MGTCDIVTEANISSGPESNTTGITAFSMPSWQLALWATAYLALVLVAVTGNAIVIWIILAHRRMRTVTNYFIVNLALADLCMAAFNAAFNFVYASHNIWYFGRAFCYFQNLFPITAMFVSIYSMTAIAADRYMAIVHPFQPRLSAPSTKAVIAGIWLVALALASPQCFYSTVTMDQGATKCVVAWPEDSGGKTLLLYHLVVIALIYFLPLAVMFVAYSVIGLTLWRRAVPGHQAHGANLRHLQAKKKFVKTMVLVVLTFAICWPPYHLYFILGSFQEDIYCHKFIQQVYLALFWLAMSSTMYNPIIYCCLNHRFRSGFRLAFRCCPWVTPTKEDKLELTRTTSLSTRVNRCHTKETLFMAGDTAPSEATSGEAGRPQDGSGLWFGYGLLAPTKTHVEI

其中，如图2所示，嵌合了抗原受体的1-28位氨基酸为SKY2(酪氨酸激酶2，SEQ IDNO：3)，29-43位氨基酸为SKY(酪氨酸激酶，SEQ ID NO：4)，44-322位氨基酸为跨膜结构域(Transmembrane Domains，SEQ ID NO：5)，323-398位氨基酸为胞内结构域(IntracellularDomains，SEQ ID NO：6)。

使用如下引物扩增目的片段(SEQ ID NO：7-8)：

F:5’-atggggacctgtgacattgtg-3’

R:5’-tcaaatttcaacatgagttttg-3’

使用无缝连接的方法将目的片段构建到pLVX-IRES载体的IRES和WPRE结构元件之间。

实施例2慢病毒包装

按照试剂说明书，将重组表达质粒和辅助质粒psPAX2、pMD2.G以4:3:1的比例用lipo2000试剂转染细胞。48小时后，将含有病毒的上清吸入EP管中，4℃2000g离心10min，转移上清至新EP管中，0.45μm滤器过滤后-80℃保存。

实施例3T细胞制备

按照试剂说明书，取30ml新鲜血液，用淋巴细胞分离试剂分离单核细胞。用含有300U/ml的IL-2、50ng/ml的OKT-3和5％人AB血清的AIM-V培养基诱导培养48h，制备T细胞。

实施例4慢病毒感染T细胞

将储存的病毒液加入终浓度为8ug/ml的聚凝胺，加入重悬的T细胞(约10

感染后72小时，观察感染效率，效率最低不应低于40％。

从感染72小时后开始于6孔板中筛选，每隔2天重新换液。筛选需至少持续7天，直至显微镜下观察荧光细胞比例为100％。

实施例5CAR-T细胞的对小胶质细胞的特异性杀伤活性

分别取1×10

本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和修改，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的设备和这里示出与描述的图示示例。