番茄基因SlCPK12或其编码的蛋白质在调控番茄脐腐病中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术和遗传育种领域，特别是番茄基因SlCPK12或其编码的蛋白质在调控番茄脐腐病中的应用。

背景技术

番茄具有特殊风味和很高的经济和营养价值，是世界上重要的蔬菜作物之一。通过控水提高番茄糖分的同时发现在亏缺灌溉下脐腐病发病率显著提升。脐腐病(Blossom-end rot，BER)是影响茄科蔬菜和瓜类生产中的具有严重破坏性的生理性病害，每年全球15％的番茄生产受到影响，在病害高发地区，产量影响高达50％，造成严重的经济损失。

目前，农业防治如下：

抗病品种的选用：首选樱桃型番茄，果实较圆的品种，这类通常脐腐病发生率较低，在易发地区推荐选用。

科学施肥：补充钙素、施足基肥、合理配合。土壤缺钙时，每亩用消石灰或碳酸钙50千克均匀撒于地面并翻入耕层中。施足腐熟的农家肥人粪尿或鸡粪，增加追肥中的氮肥，并降低基肥氮的使用率。在番茄施氮时，若纯氮施用超过30千克/亩，就会导致脐腐病发病严重，所以控制氮肥用量成为了番茄增产的关键。另外，钙磷与钙钾合理配合，可显著提高番茄吸收总钙量和实吸钙量，改善番茄果实的品质。

采用根外追施钙肥技术：番茄结果后1个月，是吸收钙的黄金时期。这时可喷洒1％的过磷酸钙，或者选用0.5％氯化钙加5毫克/千克萘乙酸、0.1％硝酸钙及爱多收6000倍液。每次间隔15天，连续喷洒2-3次。值得注意的是使用氯化钙及硝酸钙时，不可与含硫的农药及磷酸盐(如磷酸二氢钾)混合使用，以免产生沉淀。

控制温、湿度：应防止土壤干湿不定，切忌土壤过分干旱。定植时浇1次缓苗水，以后在花序开花坐果时灌溉，水量不能过大。以后根据土壤墒情酌情浇水，以保持土壤湿润。

田间管理：中耕时松土，且施草木灰200千克/亩，应施于7-8厘米土层内，以促进土壤透气、透水，增强植株抗病性，这些简易的方法可大大杜绝脐腐病的发生。

但是，上述方法并不能从根本上解决问题，因此，亟待开发抑制番茄脐腐病发生的基因，并利用该基因培育应用抑制番茄脐腐病发生番茄品种。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了番茄基因SlCPK12或其编码的蛋白质在调控番茄脐腐病中的应用。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

番茄基因SlCPK12或其编码的蛋白质在调控番茄脐腐病中的应用。

进一步地，所述番茄基因SlCPK12的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述番茄基因SlCPK12编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

与现有技术相比，本发明通过获得了SlCPK12过表达植株和敲除SlCPK12的纯合突变体，经过一系列实验证明：与野生型相比，SlCPK12基因敲除突变体植株的脐腐病发生率显著升高，而SlCPK12过表达植株并无脐腐病发生。本发明建立的方法可用于番茄以及其他园艺作物的生长调控，可应用于提高植物生物学产量与创制新品种。

附图说明

图1为番茄SlCPK12突变体的遗传转化后的番茄培养过程。

图2为SlCPK12基因的一种纯合突变体slcpk12-1的碱基突变片段。

图3为SlCPK12基因突变及过表达材料的性状。

图4为SlCPK12基因突变材料在亏缺灌溉下的发病率结果。

图5为过表达SlCPK12转基因番茄植株果实中SlCPK12表达量的分析结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。

实施例1：SlCPK12过表达植株的获取

1.SlCPK12基因过表达载体的构建

从(http://solgenomics.net)获取番茄基因SlCPK12的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

合成引物：Primer(+):aacacgggggactttgcaacatgggcaatacatgccgtggatctattg

Primer(-):ccgtcgtggtctttgtaatcctgagctcctgatgcatctctcatgctcaaa

提取番茄果实RNA，并反转录成cDNA，以cDNA为模板扩增目的片段SlCPK12基因。

PCR体系：做1个50uL体系并按照以下程序进行扩增反应:

PCR体系和程序：

PCR程序

94℃ for 5min 1

94℃ for 30sec 30

50℃ for 45sec 30

72℃ for 37sec 30

72℃ for 10min 1

16℃ for 30min 1

用1.5％琼脂糖凝胶电泳，5v/cm电压，20分钟，将的电泳片段在紫外灯下切取出来，放在一个体系中进行溶胶回收,回收程序见具体厂家的试剂盒说明书,用总体积40uL的水溶解回收DNA(回收产物标记为：rDNAG1)，检测无误后与载体进行重组。

载体酶切

酶切链接体系和反应条件

转化：

将10uL连接产物转化大肠杆菌感受态(见大肠杆菌感受态转化标准方法)

转化涂Kana抗性平板，37℃培养12小时，进行菌斑pcr鉴定。

菌斑PCR鉴定：

挑取10个菌斑同时进行1.5ml EP管接菌和PCR鉴定。取1-3个阳性条带对应的菌液，取500uL送样测序，其余400uL菌液接种到含有5-10ml Kan抗性LB中，试管摇菌。重组载体测序结果正确的载体提质粒。

2.重组农杆菌的构建

将阳性质粒转化农杆菌感受态(见农杆菌感受态转化标准方法)，转化涂Kana+Rif抗性平板，37℃培养2d，进行菌斑PCR鉴定。取1-3个阳性条带对应的菌液保存。

3.番茄植株的遗传转化

取饱满的番茄种子适量，置于三角瓶中，加入100mL水，55℃水浴15min，倒出水，加入50m LNaClO溶液(84：水＝1:2)，在28℃，150rpm培养箱中振荡20min，在超净工作台中，将消毒过的种子用灭菌水冲洗三次，然后摆放于番茄种子培养基中，28℃避光培养7天。待子叶展开后，切取子叶中间1/3处为外植体，放于预培养基中，28℃避光培养48h。取50μL制备的农杆菌，加入到50mLYEP液体培养基(含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(50mg/L))中，在28℃，150rpm振荡培养箱中培养24h，然后在4℃下4000rpm离心10min，在超净工作台中用悬浮液悬浮菌体。加入外植体，轻轻摇动4min，用滤纸将外植体表面的菌液擦拭干净，转移到预培养基中共培养2d，之后转移到筛选培养基中。每隔15d，将外植体转移至新的筛选培养基中，待长出不定芽后，切下不定芽，放于生根培养基中，20d后，待长根后洗净幼苗根部的培养基，用营养液培养，待长出2-3片新叶后，移栽至温室中，正常的栽培管理。

实施例2、SlCPK12基因突变材料的获取

1、SlCPK12基因编辑载体和重组农杆菌的构建

根据(http://solgenomics.net)SlCPK12基因的CDS序列Solyc10g074570(1674bp)确定敲除位点，利用CRISPR-P网站，在SlCPK12基因外显子上设计2个靶序列，2个所述靶序列的核苷酸序列为：

靶点1：GCTCCACCAATCATAACCCT

靶点2：GTGCTGAGTATGCCTGTAAA

然后利用根据靶点合成的引物进行PCR反应扩增

Target-Sense：5’-TTG-gRNA靶点-3，(正向序列)；

Target-Anti：5’-AAC-gRNA靶点-3，(反向互补序列)；

之后胶回收PCR反应产物，之后连到酶切好的CRISPR/Cas9载体上。之后进行测序鉴定，将鉴定结果正确的载体提质粒、保存菌种，进行后续实验。此时得到SlCPK12基因编辑载体。将阳性质粒转化农杆菌感受态，保存阳性条带对应的菌液。(上述步骤可见实例1)

2.番茄植株的遗传转化(同实例1)

3.转基因番茄植株的鉴定

提取番茄叶片DNA，对转基因植株阳性植株的靶点编辑方式进行测序鉴定。

F:5’-ATGGGCAATACATGCCGTGG-3’，

R:5’-GATCCTCATAAGCCCCTTTAATCGT-3’

以转基因植物DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系按照产品说明书操作。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃后延伸10min。将PCR产物送测序。

借助DNAMAN软件读取序列，将序列与番茄基因组进行比对分析。鉴定出了SlCPK12基因的一种纯合突变体slcpk12-1。突变体分别缺失了5个碱基，导致SlCPK12基因发生移码突变，从而造成该基因功能缺失。

实例3、SlCPK12基因突变材料和过表达材料的性状观察

在上述制备的番茄SlCPK12突变材料(即易发生脐腐病的番茄植株)、SlCPK12过表达材料野生型材料观察其表型。每个处理由十个单株重复组成：在每株上标记6-8朵花，每个重复产生6-8个标记的果实。未标记的花或果实不进行疏花疏果处理。

首先是slcpk12突变体绿熟期与完熟期底部外形图，WT从绿熟期到红熟期是没有发病的，slcpk12突变体在绿熟期开始发病，在完熟期时可以达35％。而过表达材料没有脐腐病的发生。

实施例4、过表达SlCPK12转基因番茄植株果实中SlCPK12表达量的分析

根据过表达株系叶片表达量的分析结果，我们选取了1、4、7号株系的果实，以正常Ailsa Craig番茄为对照，提取RNA并反转录为cDNA，使用SlCPK12的实时定量引物：

F:5’-GGGTGAGTTGTTTGATCGGAT-3’

R:5’-CAGCTTCAGGACCATAATGCTT-3’

以Actin基因为内参，进行qRT-PCR来分析过表达转基因番茄果实不同发育时期表达量的变化。从图5可以看出，与对照CK相比，三个株系的表达量均极显著升高，分别上调了14倍、7.3倍、22.6倍；转基因株系与对照相比均极显著升高，其中7号株系升高倍数最高。并且在表型观察时三个株系均无脐腐病发生。

实施例4、SlCPK12基因突变材料在亏缺灌溉下的发病率测定

(1)植物材料的准备：

挑选大小正常一致的野生型番茄Ailsa Craig种子和转基因番茄种子，28℃培养箱中催芽；将露白种子播种于穴盘，长出第一片真叶时进行阳性植株筛选，待长出3-4片真叶时，转移至口径为20cm的营养钵中；正常肥水管理约45d之后，开始准备进行干旱胁迫处理。

(2)干旱胁迫处理及样品收取：

选取CRISPR/Cas 9成功敲除的株系进行干旱处理，处理分为实验组与对照组，在盛开时，标记一个簇中完全开放的花朵并手动授粉。从授粉后第1天开始，开始进行如下处理：每个处理由十个单株重复组成：授粉后根据植物的失水量每天早上浇营养液，用于诱导植物水合，然后以24小时为周期进行植物脱水(在早上浇水之前在对照植株中观察到枯萎，但植株在灌溉后恢复膨胀。)水分胁迫条件用于提高果实对脐腐病的敏感性。在每株上标记6-8朵花，每个重复产生6-8个标记的果实。未标记的花或果实不进行疏花疏果处理。对照组正常浇水，干旱后观察不同时期番茄果实表型。

结果表明敲除SlCPK12后，植物经水分亏缺处理后脐腐病发病率高于野生型，进一步证明SlCPK12突变体株系更易发生脐腐病。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。