一种以铁蛋白为载体的抗肺纤维化纳米制剂及制备和应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种以铁蛋白为载体的抗肺纤维化纳米制剂及制备和应用。

背景技术

肺纤维化是一种致死率极高的肺间质病变疾病，几乎没有治疗手段，生存期仅为2至5年(Richeldi L,Collard HR,Jones MG.Lancet 2017,389(10082):1941-1952)。由于SARS-CoV-2感染引起的炎症性肺损伤和触发肺纤维化的激活通路的交叉，致使COVID-19愈后患者也易发肺纤维化。同时由于环境污染物和气候变化导致慢性肺病流行，致使肺纤维化的医疗负担可能会增加。目前，FDA已批准两种抗肺纤维化的口服药物，分别为吡非尼酮与尼达尼布。他们的主要治疗机制在于抑制肌成纤维细胞活化，从而降低胶原蓄积，而对于纤维化发生起始阶段无法起到抑制作用，因此这两种上市药物仅能延缓病情发展，却不能从根本上治疗肺纤维化。肺移植则是另一种治疗选择，然而器官捐赠者的稀缺以及高昂的治疗成本严重限制了它的普遍使用(Singh A,Chakraborty S,Wong SW et al.PNAS2022,119(15):e2121098119)。

肺纤维化的发病机制涉及先天性和适应性免疫通路的过度激活，这些通路会释放炎性细胞因子和生长因子，例如转化生长因子(TGFβ1)，并诱导异常的细胞外基质蛋白产生。在肺纤维化的发生过程中，驻留的肺泡巨噬细胞被一群新到达的单核细胞衍生的间质巨噬细胞所取代，这些巨噬细胞随后转变为肺泡巨噬细胞。这些转化细胞通过释放促纤维化细胞因子和重塑基质来启动纤维化。从研究中可以看出，特定的肺泡巨噬细胞参与纤维化的诱导，肺成纤维细胞、肺泡上皮细胞和内皮细胞发挥互补作用(Cheng P,Li S,ChenH.Cells 2021,10(2))。因而，在肺纤维化的治疗中，通过药物调节特定肺泡巨噬细胞的功能是治疗肺纤维化的关键策略。

功能失调的巨噬细胞对癌症、炎症性疾病(类风湿性关节炎和炎症性肠病)、代谢性疾病(动脉粥样硬化、糖尿病和肥胖症)和人类免疫缺陷病毒等重大感染等疾病具有显着的病理生理学影响。靶向该类巨噬细胞的纳米制剂载体已得到广泛研究，包括聚合物纳米球、脂质载体(脂质体和乳液)、聚合物胶束、树枝状聚合物和无机纳米颗粒(例如二氧化硅纳米颗粒、金纳米颗粒、量子点和碳纳米管)等，但是此类纳米颗粒普遍存在尺寸不均一、稳定性差、载药困难、制备复杂昂贵且具有生物毒性等问题(Chen W,Schilperoort M,Cao Yet al.Nature reviews Cardiology 2022,19(4):228-249.Zang X,Cheng M,Zhang X etal.Journal of materials chemistry B 2021,9(15):3284-3294)。

蛋白纳米颗粒由于其良好的生物相容性、粒径均一、生物可降解性等优点在药物递送方面具有显著优势。常见的蛋白纳米颗粒有铁蛋白、热休克蛋白以及由病毒衣壳蛋白组装而成的类病毒颗粒等。其中铁蛋白自身球形结构稳定，表面易修饰，并且具有中空结构(8nm内腔)和易于进行可逆解聚与组装的特性。以铁蛋白为载体递送药物不仅可以改善药代动力学特征，还可以降低药物细胞毒性，减少杀伤正常细胞，另外铁蛋白生物相容性强，可以降低体内使用时的免疫原性(Song N,Zhang J,Zhai J et al.Acc Chem Res 2021,54(17):3313-3325)。

但是铁蛋白纳米颗粒在抗肺纤维化的靶向治疗中缺乏有效的研究，而且为了增强对特定肺泡巨噬细胞的特异性，需要采用主动靶向方法，使用对肺泡巨噬细胞表面受体具有高亲和力的物质修饰铁蛋白。研究发现在肺纤维化模型的急性期和纤维化期，CD206在肺泡巨噬细胞中的表达升高，而且CD206

因此，需要开发一种安全高效且能够通过靶向递送药物至诱导肺纤维化的特定肺泡巨噬细胞并抑制该类细胞的相关功能，同时保持其他细胞的宿主防御和组织稳态功能完好无损的抗纤维化策略。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的一个目的是提供一种以铁蛋白为载体的抗肺纤维化纳米制剂，所述纳米制剂包括重组表达得到的具有穹顶结构的铁蛋白纳米颗粒，装载的抗肺纤维化小分子药物以及偶联在铁蛋白外表面的靶向配体共三部分。本发明纳米制剂为铁蛋白纳米颗粒装载抗肺纤维化小分子药物并在外表面偶联靶向配体。

所述铁蛋白纳米颗粒的蛋白亚基可以是天然的序列或者在天然序列基础上改造的序列，其特征为蛋白亚基可自发或在一定条件下组装为铁蛋白颗粒结构。

所述抗纤维化小分子药物包括生物活性多肽、化学药、天然化合物以及特定细胞因子干扰RNA，选自Ac2-26、吡非尼酮、千金藤素、TGFβ1-siRNA中的一种或几种。

所述靶向配体可以靶向肺泡巨噬细胞表面受体，选自甘露糖、Dectin-1、磷脂酰丝氨酸中的一种或几种。

进一步优选，所述纳米制剂中铁蛋白纳米颗粒为重组人重链铁蛋白，抗肺纤维化小分子药物为Ac2-26，靶向配体为甘露糖。

本发明的另一个目的是提供了一种以铁蛋白为载体的抗肺纤维化纳米制剂的制备方法。具体步骤为：

(1)铁蛋白装载抗纤维化小分子药物：将铁蛋白与抗肺纤维化小分子药物按照一定比例混合，对混合体系引入变性因素，促使铁蛋白纳米颗粒解聚为单体亚基，然后作用一段时间后去除上述变性因素，促使铁蛋白纳米颗粒结构恢复纳米颗粒状态，并将小分子药物封闭于颗粒内部；具体步骤包括：

①按一定比例，将小分子药物逐滴缓慢加入重组人重链铁蛋白纳米载体溶液中，边加边搅；

②避光环境中，将混合液置于固定pH条件、或者在一定的静水压力下、或者在适当变性剂存在下实现载药；

③将步骤②混合溶液的变性因素去除后，使铁蛋白恢复纳米球形颗粒状态。

所述抗纤维化小分子药物选自Ac2-26、吡非尼酮、千金藤素、TGFβ1-siRNA等，优选为Ac2-26。

所述小分子药物与重组纳米载体铁蛋白的摩尔浓度比为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8以及1:10，优选为1:8。

所述变性因素指能够改变蛋白质结构的物理或化学因素，包括加热处理、极端pH处理、变性剂、表面活性剂、有机溶剂或静水压力处理。

所述pH条件为2、3、4、5、6，处理时间为10min、20min、0.5h、1h、2h。

所述静水压力为50-800MPa，维持时间为1-50h，压力去除时间为0.1-20h。

所述变性剂为1M、2M、4M、6M、8M和10M脲，维持时间为1-50h，变性剂去除时间为0.1-20h。

优选铁蛋白装载抗纤维化小分子药物的条件为将Ac2-26与HFn按照1:8的摩尔浓度比混合，调节混合体系pH值至2.0使得HFn解聚为单体亚基，作用30min，然后调节混合体系pH值至8.0，放置3h，促使HFn恢复纳米颗粒结构并将Ac2-26封闭于颗粒内部。

(2)巨噬细胞靶向配体与铁蛋白偶联反应：所述巨噬细胞靶向配体，选自甘露糖、Dectin-1、磷脂酰丝氨酸中的一种或几种，优选为甘露糖；巨噬细胞靶向配体偶联铁蛋白外表面氨基酸位点包括N末端氨基、链上氨基，羧基以及巯基等，优选为链上氨基。

所述靶向配体与铁蛋白偶联反应，优选甘露醇，包括甘露糖在60℃下加热1h开环暴露醛基，然后与铁蛋白链上氨基反应。所述甘露糖与铁蛋白偶联反应的摩尔浓度比为1:1、2:1、5:1、10:1或20:1；所述甘露糖与铁蛋白偶联反应时间为30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h或32h。

优选甘露糖与铁蛋白偶联反应摩尔浓度比为5:1；优选甘露糖与铁蛋白偶联反应时间为12h；氨基酸位点优选为链上氨基。将甘露糖加热开环处理后与铁蛋白通过链上氨基偶联。

(3)通过凝胶过滤层析色谱去除未装载小分子药物以及剩余靶向配体，纯化抗肺纤维化纳米制剂。所述的凝胶过滤层析色谱为Sephadex G25、Superdex 75或Superdex200；洗脱缓冲液为PBS。优选为Sephadex G25脱盐层析。

所述步骤(3)优选通过Sephedax G25脱盐柱去除未装载Ac2-26以及剩余甘露糖，纯化得到以铁蛋白为载体的抗肺纤维化纳米制剂Mannosylated HFn-Ac2-26(MAFNP)。

本发明的再一个目的是提供所述抗肺纤维化纳米制剂在制备治疗肺纤维化疾病药物中的应用。

本发明描述了一种利用PF患者肺泡巨噬细胞甘露糖受体CD206的上调来治疗肺纤维化的策略。为了靶向肺泡巨噬细胞，我们将甘露糖偶联至铁蛋白纳米颗粒外表面，并且在铁蛋白内腔装载小分子抗肺纤维化药物用于抑制由特定肺泡巨噬细胞介导的纤维化。

本发明构建的是一种以铁蛋白为载体的抗肺纤维化纳米制剂，兼具靶向及长效功能，一方面可实现抗肺纤维化药物靶向输送至特定肺泡巨噬细胞；另一方面，该纳米制剂能进一步提高药物的体内血液代谢半衰期。

本发明具有以下有益效果：

1)本发明是基于天然的纳米载体蛋白设计开发的新型载体，具有特定肺泡巨噬细胞靶向性、体内长效性、生物相容性高、低免疫原性、原核表达快捷方便廉价等优势；

2)本发明中一种以铁蛋白为载体的抗肺纤维化纳米制剂的制备方法较简单、易于操作、耗时短。此外，通过包埋载药的方式能够解决药物不稳定，代谢快的问题，并且避免了药物可能带来的副作用。

附图说明

图1为经过发酵以及一系列蛋白纯化后得到的高纯度的重组纳米载体蛋白HFn的检测分析图。图1A为SDS-PAGE电泳图谱；图1B为圆二色光谱检测图谱；图1C为Superdex 200凝胶检测图谱；图1D为动态光散射(DLS)检测图；图1E为TEM电镜检测图。

图2为本发明的一种以铁蛋白为载体的抗肺纤维化纳米制剂(MAFNP)的药物装载以及偶联靶向配体的效率。图2A为不同Ac2-26浓度条件下铁蛋白装载Ac2-26的效率；图2B为不同甘露糖浓度条件下装载有Ac2-26的铁蛋白与甘露糖偶联反应效率。

图3为本发明的一种以铁蛋白为载体的抗肺纤维化纳米制剂(MAFNP)的SephadexG25脱盐层析图谱。

图4为本发明的一种以铁蛋白为载体的抗肺纤维化纳米制剂(MAFNP)的检测分析图，图4A为RP-HPLC检测图；图4B为Superdex 200检测图；图4C为荧光光谱图；图4D为TEM电镜检测图。

图5为本发明的一种以铁蛋白为载体的抗肺纤维化纳米制剂(MAFNP)在不同pH以及温度条件下的体外稳定性分析。

图6为本发明的一种以铁蛋白为载体的抗肺纤维化纳米制剂(MAFNP)、HFn-Ac2-26以及空白载体HFn对体外RAW264.7细胞的毒性情况。

图7为本发明的一种以铁蛋白为载体的抗肺纤维化纳米制剂(MAFNP)对RAW264.7细胞表达促纤维化因子TGFβ1的抑制效果。

图8为本发明的一种以铁蛋白为载体的抗肺纤维化纳米制剂(MAFNP)对小鼠的肺纤维化进程的抑制效果。

图9为本发明的一种以铁蛋白为载体的抗肺纤维化纳米制剂(MAFNP)在肺纤维化模型小鼠体内的长效性以及肺部组织靶向性。

图10为本发明的一种以铁蛋白为载体的抗肺纤维化纳米制剂及其制备方法的流程示意图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：重组人重链铁蛋白(HFn)的制备方法

在本实施例中，通过以下方法制备重组人重链铁蛋白，具体包括以下步骤：

(1)将HFn序列构建进pET-28a质粒，宿主菌为E.coli BL21株；

(2)发酵：使用LB培养基培养，待OD

(3)破菌：超声破菌使蛋白从菌体中释放；

(4)HFn蛋白纯化：首先利用热处理方法(75℃，10min)进行沉淀，离心除去沉淀；得到的上清进行Superdex 200凝胶过滤层析。收集到的洗脱峰则为纯度较高的目的蛋白。如图1A至1E所示，纯化得到的HFn进行SDS-PAGE、CD、SEC、DLS以及TEM电镜检测。如图1A中SDS-PAGE所示，所获得的HFn在还原型以及非还原型条件下纯度皆大于95％。如图1B所示，HFn二级结构含有大量α螺旋结构。如图1C所示，HFn为中空球体结构。如图1-4所示，HFn通过Superdex 200呈现为均一对称峰。如图1E所示，HFn在电镜下为中空球体结构，外径12nm，内径8nm，与天然态铁蛋白结构一致。

实施例2：HFn装载Ac2-26同时并且偶联甘露糖的制备方法

在本实施例中，通过以下方法在HFn中装载Ac2-26，并在HFn外表面偶联甘露糖，从而制备Mannosylated HFn-Ac2-26(MAFNP)，具体包括以下步骤：

为了便于后续检测分析，将Ac2-26使用Cy5染料进行标记，将标记后的Ac2-26-Cy5母液逐滴缓慢加入浓度为1mg/ml的HFn蛋白溶液中并混合均匀，设置Ac2-26终浓度分别为0、10、62.5、125、250、500以及1000ng/mL。避光环境中，调节混合体系pH值到2.0，混匀20min。然后将溶液pH值调回8.0，置于常温避光环境下2h，使蛋白恢复结构。然后在10000rpm转速下离心30min，除去沉淀。得到的载药蛋白上清，通过脱盐柱层析除去未装载的游离药物。最后可通过荧光分光光度计检测Cy5荧光强度来计算装载Ac2-26的蛋白浓度及装载比例，通过考马斯亮蓝染色法检测总蛋白浓度，计算铁蛋白回收率。如图2A所示，随着Ac2-26初始浓度的提升，药物装载量逐渐增加，但是总比例逐渐降低，而且HFn的蛋白回收率也随着Ac2-26的增加而逐渐降低，优选Ac2-26初始浓度为125ng/mL的条件，HFn回收率接近100％，具体药物装载比例达到83％，药物装载量为0.11μg/mg(Ac2-26/HFn)。

进一步在装载有Ac2-26的HFn外表面偶联甘露糖，首先将甘露糖在60℃，pH 4.0条件下处理1h，从而打开甘露糖环并暴露醛基，用于下一步与HFn外表面游离氨基的偶联反应。将开环后的甘露糖母液逐滴缓慢加入浓度为1mg/ml的HFn-Ac2-26蛋白溶液中并混合均匀，设置甘露糖初始浓度分别为0、2、4、8以及12mM，通过ELISA方法检测甘露糖的偶联比例。如图2B所示，随着甘露糖初始浓度增加，最终的偶联率也逐步增加，并且在8mM甘露糖条件下，最终偶联效率接近50％，之后进一步提升甘露糖浓度对于偶联效率提升不大。

实施例3：Sephadex G25脱盐层析分离纯化MAFNP

在本实施例中，通过Sephadex G25脱盐柱去除未被装载的小分子药物Ac2-26以及剩余甘露糖。如图3所示MAFNP的脱盐层析图，在Cy5的特征吸收波长650nm有明显吸收，说明Ac2-26成功装载至蛋白，而且装载率较高。将获得的MAFNP分别进行检测分析，如图4A所示，RP-HPLC检测分析MAFNP的出峰位置要早于HFn，这是因为HFn表面偶联了大量甘露糖，亲水性明显增强。图4B显示MAFNP与HFn的出峰位置接近，推测是由于两者的水力学半径大小比较接近，故而通过Superdex 200不能将其很好的区分。图4C显示MAFNP在650nm激发波长条件下产生荧光，这是因为Ac2-26偶联了Cy5荧光素，证明最后得到的MAFNP中装载有Ac2-26。图4D的TEM电镜结果显示MAFNP依然呈现纳米球形结构，中间空腔因为装载有Ac2-26，所以逐渐变得“实心”化。

实施例4：MAFNP体外存储过程稳定性

在本实施例中，通过以下方法观察MAFNP体外存储的稳定性，分别观察储存在4℃和37℃条件下不同pH值条件(2.5，5.5，7.4)时MAFNP纳米颗粒样品中Ac2-26药物的泄露情况，连续观察一周。检测样品时使用脱盐柱去除泄露的Ac2-26，收集剩余样品后测算载药量，然后计算不同条件下的Ac2-26药物随时间的泄露比例。从图5中可以看到在4℃存放2周之后，pH 2.5条件下的MAFNP药物泄露比例接近70％，pH 5.5条件下的药物泄露比例也有40％，而在pH 7.4条件下存放的药物泄露比例低于10％。进一步考察发现温度对于MAFNP样品稳定性也有很大影响，在37℃，pH 7.4条件下存放的MAFNP药物泄露比例接近20％，而且存放一周之后可以明显看到聚集沉淀。

实施例5：CCK8法测定MAFNP对RAW264.7的细胞毒性

在本实施例中，通过以下方法测定MAFNP对RAW264.7的细胞毒性，具体包括以下步骤：

将处于对数生长期的RAW264.7细胞吹打脱落，1000rpm离心5min获取细胞；然后加入培养基稀释，调整细胞浓度约1×10

细胞活力(％)＝[A(加药组)-A(空白组)]/[A(0药组)-A(空白组)]×100％

A(空白组)：完全培养基，既无细胞也无药物；

A(0药组)：仅含有细胞的完全培养基；

A(加药组)：含有细胞、药物的完全培养基。

通过CCK8法检测细胞毒性情况，实验结果如图6所示。如图6A所示，当Ac2-26浓度达到250ng/mL以上时，RAW264.7细胞存活率明显下降。而当Ac2-26被装载进HFn纳米颗粒后可以看到，不同浓度条件下的MAFNP、HFn-Ac2-26以及HFn对于RAW264.7细胞无明显毒性(图6B)。

实施例6：MAFNP在体外细胞中抑制相关促纤维化因子表达的情况

本实施例中，通过以下方法考察MAFNP在体外细胞中抑制相关促纤维化因子表达的情况，具体包括以下步骤：

将处于对数生长期的RAW264.7细胞吹打脱落，1000rpm离心5min获取细胞；然后加入培养基稀释，调整细胞浓度约1×10

实施例7：MAFNP抑制小鼠的肺纤维化进程

在本实施例中，通过以下方法测定MAFNP对小鼠肺纤维化进程的抑制作用，具体包括以下步骤：

取6-8周C57BL/6雄性小鼠，体重在20g左右，随机分成(1)生理盐水(PBs)对照组、(2)博来霉素(BLM)+PBs组、(3)博来霉素(BLM)+Ac2-26组、(4)博来霉素(BLM)+MAFNP组，进行称重，编号，并做好记录。将小鼠麻醉后在气管注射25μL的BLM(40mg/kg)构建肺纤维化模型小鼠，对照组注射等体积PBs。每日观察小鼠伤口复原情况，毛色以及生活状况，并进行每日监测体重。待饲养一周后，通过尾静脉注射给药，其中(1)组和(2)组给予PBs，(3)组给予Ac2-26药物进行治疗，(4)组给予MAFNP药物进行治疗，注射药物体积为100μL。给药一周后进行第二次给药，然后继续饲养一周后处死小鼠。分别在第一次以及第二次给药后每组各取3只小鼠，分别处死取肺组织，称重，肺组织用福尔马林液固定制备石蜡切片做HE和Masson染色。结果如图8所示，从HE以及Masson染色结果可以看到，对照组(1)的小鼠肺部组织结构完整，无炎性细胞浸润且无明显胶原纤维增生。BLM处理组小鼠小鼠肺组织结构损害明显，肺泡结构紊乱，炎性细胞大量浸润，大量蓝染胶原纤维沉积。BLM处理后使用Ac2-26治疗组的小鼠在肺部组织结构上有一定改善，但是依然存在大量蓝染胶原纤维。与之相对的是，使用MAFNP药物治疗组小鼠肺组织病变结构明显改善，炎性细胞浸润减少，蓝染胶原纤维沉积减少，而且二次给药的效果要优于一次给药。

实施例8：MAFNP在肺纤维化模型小鼠体内的靶向及长效性

在本实施例中，通过以下方法测定MAFNP在肺纤维化模型小鼠体内的靶向及长效性，具体包括以下步骤：

按照实施例7相同的方法构建肺纤维化模型小鼠，(1)博来霉素(BLM)+PBs组、(2)博来霉素(BLM)+Ac2-26组以及(3)博来霉素(BLM)+MAFNP组。为了实现小鼠体内荧光成像，我们分别在治疗药物Ac2-26以及MAFNP上偶联Cy5.5荧光素。在肺纤维化模型小鼠造模一周后分别对各组小鼠尾静脉注射治疗药物，其中(1)组注射PBs，(2)和(3)分别注射偶联荧光素Cy5.5的治疗药物。注射药物后分别在0.5h、4h以及24h后对小鼠进行荧光活体成像。在注射药物24h后分别解剖小鼠并取出心脏、肝脏、脾脏、肺以及肾脏进一步进行荧光成像分析。从图9可以看出对照组(1)的小鼠体内以及相应脏器中未见荧光。注射Ac2-26和MAFNP的小鼠体内都具有明显荧光吸收，而且在药物注射24h后，(3)组的小鼠体内荧光强度明显高于(2)组，表明MAFNP在小鼠体内的长效性远高于Ac2-26。而且从解剖后小鼠组织器官的荧光成像上可以看到，使用MAFNP的小鼠在肺部组织有较强荧光吸收，而使用Ac2-26的情况下，小鼠肺部组织没有明显荧光吸收，表明MAFNP可以靶向肺部组织。

本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法(图10)，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。