一种靶向Aβ的肉桂酸黑磷纳米组合物及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，特别涉及了一种靶向Aβ的肉桂酸黑磷纳米组合物及其制备方法、应用。

背景技术

研究认为阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease，AD）的发病与脑内β淀粉样蛋白（Aβ）异常沉积有关。Aβ由其前体蛋白（APP）经分泌酶水解后产生，转运至大脑，异常聚集产生Aβ寡聚体，引起炎症、ROS氧化应激、钙超载等神经毒性反应，破坏突触膜，最终引起神经细胞死亡。因此减少Aβ产生、促进Aβ清除、调节Aβ转运、抑制Aβ聚集及对抗其神经毒性，临床则能有效治疗AD。

黑磷（Black Phosphorus，BP）是一种由单一磷元素构成的新型纳米材料，黑磷纳米材料具有以下优势：在近红外光照射下产生单线态氧，可作为光动力治疗的光敏剂；能够在较长的波长区域有广泛的光吸收，这种近红外光的热特性可应用于光热治疗；黑磷纳米片具有较高的比表面积及独特的褶皱结构，这使其具有极高的载药量，且生物活性和生物可降解特性都比较高。

姜黄素是一种提取自姜黄科、天南星科等植物中的疏水性多酚类成分，已经被证明具有抗炎、抗氧化、抗病毒等作用。研究表明姜黄素可以通过保护多巴胺能神经元、抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡、抗线粒体损伤、调节自噬等多种途径在帕金森病中发挥神经保护作用。与化学药物相比，中药具有良好的耐受性和安全性，并且不良反应小，适用性人群广，但是由于姜黄素的水溶性低造成的其在体内的吸收率低，生物利用率低，极大限制了姜黄素在医药领域的使用。

目前改善姜黄素的生物相容性的多将姜黄素与肽形成组合物，如中国专利CN105358179B（授权公布日期：2018.12.07）提出的姜黄素-肽复合体。姜黄素与肽复合体虽然提高了姜黄素的可溶性，但其主要限制是容易被蛋白酶切割和降解，以及缺乏特异性，导致可能还没有上到脑部，就已经被降解了一部分，从而大大降低了药物的利用率。另外一个问题是利用肽来包载药物，装载量较低，无法实现大容量的药物运送。而且单纯的药物输送而没有靶向目标物质会使药物在脑内弥漫性分布，非特异性的结合其他部位从而导致药物利用度下降。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种靶向Aβ的肉桂酸黑磷纳米组合物及其制备方法、应用。

本发明第一方面提出，一种用于靶向Aβ的肉桂酸黑磷纳米组合物，由载药主体黑磷纳米片、修饰性材料氨基聚乙二醇硬脂酸、靶向材料4-（二甲氨基）肉桂酸)以及治疗性材料Cur(姜黄素)组成。

本发明所述的一种靶向Aβ的肉桂酸黑磷纳米组合物，以4-（二甲氨基）肉桂酸作为靶向Aβ的基团。

本发明的第二方面提出一种靶向Aβ的肉桂酸黑磷纳米组合物的制备方法，包括如下步骤：

将4-（二甲氨基）肉桂酸与N-羟基丁二酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以一定比例混合，并加入溶剂进行溶解反应，然后加入氨基聚乙二醇硬脂酸继续反应。

在步骤（1）所得溶液中加入姜黄素反应后，滴入快速搅拌的水中，并加热至气味完全挥发，离心后取上层溶液。

将步骤（2）所得上层溶液与黑磷纳米片反应生成最终产物靶向Aβ的肉桂酸黑磷纳米组合物。

本发明中，步骤(1)所述4-（二甲氨基）肉桂酸、氨基聚乙二醇硬脂酸、N-羟基丁二酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺四种材料摩尔比为（1~2）：1：（1~2）：（1~2）。

更优的，步骤(1)所述4-（二甲氨基）肉桂酸，氨基聚乙二醇硬脂酸，N-羟基丁二酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺四种材料摩尔比为2：1：2：2。

本发明中，步骤(1)所述溶剂为四氢呋喃，加入溶剂后反应4~6个小时。

本发明中，步骤(1)所述加入氨基聚乙二醇硬脂酸后进行疏水反应20~25小时。

本发明中，步骤（2）具体包括在步骤（1）所得溶液中加入姜黄素反应10~15小时后，所得产物滴入快速搅拌的水中，水浴加热至气味完全挥发，离心后取上层溶液。

本发明中，所述步骤（3）具体包括将步骤（2）所得溶液与黑磷纳米片通过磷氧键反应10~15小时后，重复离心两次，得到最终产物靶向Aβ的肉桂酸黑磷纳米组合物颗粒。

本发明第三方面提出，一种靶向Aβ的肉桂酸黑磷纳米组合物在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用，所述组合物由上述任一方法制备所得。

与现有技术相比，本发明有以下有益效果：

1.本发明通过加入肉桂酸作为靶向物质，能够比较精准的靶向Aβ，避免药物在脑内弥漫性分布，极大提高了药物利用率，结合新型的纳米材料黑磷的众多优点，无毒，有着良好的生物降解性和生物相容性，较高的表面体积比，使得黑磷纳米片对姜黄素的载药量显著提高，克服了用肽来包载药物在体内运输过程中易被降解，且装载率低的问题。这种肉桂酸黑磷复合纳米组合物同时具备NIR照射下光热打开血脑屏障且能够靶向Aβ的双重功能，在治疗阿兹海默症的药物领域有着广阔前景。

2.本发明无需利用复杂的合成程序，仅通过加入BP作为载体，以肉桂酸作为靶标物质，便可大大提高Cur的药物载药率和靶向能力，合成过程简单，可重复性高，易于产业规模化应用。

附图说明

为了更清楚地说明本申请或现有技术中的方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一个简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1紫外光谱图结果显示Cur与BP并没有结合；

图2为实施例2紫外光谱图结果；

图3为实施例3紫外光谱图结果；

图4A为BP显微镜形貌图；

图4B为BP-PEG-Tar@Cur显微镜形貌图；

图4C为各种材料电位图；

图4D为各种材料粒径分布密度图；

图4E为各材料的傅里叶红外光谱；

图4F为各个材料溶液的分光光度值；

图4G为各材料的拉曼光谱值；

图4H为各种材料在PBS中的尺寸稳定性图；

图4I为各种材料在DMEM中的尺寸稳定性图；

图4J为姜黄素的体外药物释放模型图；

图5A为细胞活力测试结果示意图；

图5B为Aβ解聚荧光实验图；

图5C为BCA蛋白定量实验结果示意图；

图5D为ThT荧光测试结果示意图；

图6为细胞靶向摄取实验结果示意图；

图7为线粒体ROS清除实验结果示意图；

图8为Transwell实验结果示意图。

实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

本实施例示出了一种黑磷纳米复合材料的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤1：称取2mg Cur溶于1ml无水乙醇中，用超声进行辅助溶解，后续缓慢加入8ml无水乙醇进行溶解。

步骤2：将以上溶液平均分开两管置于5ml EP管中，于其中一个管内加入0.5ml浓度为1mg/ml BP，混合均匀，置于摇床上摇晃过夜。

步骤3：取出EP管置于高速离心机中离心，转速7830r/min，离心20分钟后进行过滤。

步骤4：通过检测紫外光谱判断材料合成结果，如图1所示，加入BP的溶液与未加入BP的溶液的紫外光谱差异不大，证明Cur与BP并没有结合。

实施例2

本实施例示出了一种肉桂酸黑磷纳米组合物的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤1:首先在烧瓶中加入4-（二甲氨基）肉桂酸与N-羟基丁二酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，并加入2ml四氢呋喃进行溶解，活化4-（二甲氨基）肉桂酸中的羟基。

步骤2：反应5个小时后加入氨基聚乙二醇硬脂酸，以形成疏水链包裹Cur，反应24小时。4-（二甲氨基）肉桂酸、氨基聚乙二醇硬脂酸、N-羟基丁二酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺四种材料摩尔比为1：1：1：1。

步骤3：往烧瓶中加入10mg Cur反应，反应12小时后将反应液缓慢滴入快速搅拌的12ml水中，40℃水浴加热，直至气味完全挥发。

步骤4：气味挥发完全后，将溶液置于高速离心机中离心，采用转速6000r/min，离心5分钟，结束后抽出上清液并定容至14ml。

步骤5：抽出一半PEG-Tar@Cur上清液测定紫外分光光度值，另一半上清液于烧瓶中，将4ml浓度为1mg/ml BP离心后用1ml水重悬并加入到烧瓶中反应。

步骤6：反应12小时后，抽出烧瓶中反应液置于高速离心机中离心，采用转速7000r/min，离心5分钟，离心结束后抽出上清液测定紫外分光光度值，然后加入5ml水重悬，重复以上离心步骤，洗去未结合的PEG-Tar@Cur，得到最终产品的混悬液5.3ml，用紫外分光光度计测定吸光度值，将最终混悬液用紫外光谱测定Cur含量后按照实施例4步骤测得姜黄素的载药量，最后烘干得BP-PEG-Tar@Cur纳米颗粒总量1mg。

步骤7：通过检测不同产物的紫外光谱判断材料的合成以及通过检测上清液的Cur的含量计算包封率和装载率如表1所示，包封率与载药率分别为11.72%与45.84%，两个效率都相对较低。

表1 实例2的包封率与载药率结果

实施例3

本实施例示出了一种肉桂酸黑磷纳米组合物的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤1：首先在烧瓶中加入4-（二甲氨基）肉桂酸与N-羟基丁二酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，并加入2ml四氢呋喃进行溶解，活化4-（二甲氨基）肉桂酸中的羟基。

步骤2：反应5个小时后加入氨基聚乙二醇硬脂酸，以形成疏水链包裹Cur，反应24小时。 4-（二甲氨基）肉桂酸、氨基聚乙二醇硬脂酸、N-羟基丁二酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺四种材料摩尔比为2：1：2：2。

步骤3：往烧瓶中加入10mgCur反应，反应12小时后将反应液缓慢滴入快速搅拌的12ml水中，40℃水浴加热，直至气味完全挥发。

步骤4：气味挥发完全后，将溶液置于高速离心机中离心，采用转速6000r/min，离心5分钟，结束后抽出上清液并定容至14ml。

步骤5：抽出一半PEG-Tar@Cur反应液上清液于烧瓶中，将5ml浓度为1mg/ml BP离心后用1ml水重悬并加入到烧瓶中反应。

步骤6：反应12小时后，抽出烧瓶中反应液置于高速离心机中离心，采用转速7000r/min，离心5分钟，离心结束后抽出上清液测定紫外分光光度值，加入5ml水重悬，重复以上离心步骤，洗去未结合的PEG-Tar@Cur，得到最终产品的混悬液5.3ml，将最终混悬液用紫外光谱测定Cur含量后按照实施例4步骤测得姜黄素的载药量，最后烘干得BP-PEG-Tar@Cur纳米颗粒总量1.36mg。

步骤7：通过检测不同产物的紫外光谱判断材料的合成以及通过检测上清液的Cur的含量计算包封率和装载率如表3所示，调整了材料之间的比例之后，包封率和载药率都得到了提高，分别为22.75%和68.51%。

表2 实例3的包封率与载药率计算结果

BP、PEG-Tar、PEG-Tar@Cur和BP-PEG-Tar@Cur的表征分析

1.BP与BP-PEG-Tar@Cur显微镜形貌拍摄，取部分BP跟BP-PEG-Tar@Cur样品分散到乙醇溶液中进行超声，然后取几滴分散好的液体逐滴滴加在铜网上，经过晾干后，用型号为美国FEI Talos F200X G2的TEM透射电子显微镜，加速电压200kV，能谱型号EDS super-X，拍摄形貌（高分辨），结果如图4A、4B所示。

2.各材料的粒径及电位通过激光粒度分析仪（型号：Vern Nanosizer Nano ZS）来进行测定，结果如图4C、4D、4H、4I所示。

3.各材料的傅里叶红外光谱通过傅里叶红外光谱仪（型号：Thermo ScienceNicolet iS20）进行测定。在干燥的环境中，将ATR附件置于光谱仪的光路中，扫描空气背景，用滴管滴1滴液体于 ATR附件的晶体面上，然后采集样品的红外光谱，分辨率4cm-1，扫描次数为32次，测试波数范围为400-4000cm-1，结果如图4E所示。

4.各材料的分光光度值通过紫外分光光度计（型号：UV-2450）来测定，结果如图4F所示。

5.各材料的拉曼光谱值通过使用高分辨率共聚焦显微激光拉曼仪器（型号：德国WITec alpha300R，激光器：532nm）来测定。单光谱测试条件：激光能量36mW, 1800g/mm光栅，奥林巴斯20倍物镜（Olympus20x/0.25），积分时间30s，累积次数10次，结果如图4G所示。

实施例4

本实施例提出了用紫外分光光度计测定实施例2和3中BP-PEG-Tar@Cur纳米颗粒中姜黄素的载药量的方法，首先绘制姜黄素的标准曲线，将1mg姜黄素溶解在无水乙醇中并稀释至不同浓度（0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/ml），根据紫外分光光度计测量所得各浓度溶液在425nm处的吸光值，绘制得到姜黄素的浓度-吸光度标准曲线。为了计算合成材料的姜黄素的负载量，将BP-PEG-Tar@Cur溶剂离心后用1ml无水乙醇重悬，并在425nm处测量吸光度值，用纳米粒子中的姜黄素的量除以总纳米粒子的量乘以百分比得出载药百分比。测试所得实施例2产物BP-PEG-Tar@Cur的无水乙醇溶剂中姜黄素浓度为458.45μg/ml，实施例3产物BP-PEG-Tar@Cur的无水乙醇溶剂中姜黄素浓度为931.74μg/ml。

实施例5

本实施例提出了BP-PEG-Tar@Cur纳米颗粒中姜黄素的体外累积释放量测定的方法，将0.5ml装载435mg/ml姜黄素的材料溶液加入到截留分子量为500的透析袋中，用夹子密封。将透析袋放入50ml无水乙醇（0.01M，PH=7.4）的释放介质中，置于恒温37℃的摇床上，在预定的时间间隔（0、2、4、6、8、10、12、24小时），取出3ml释放液，同时补充同等体积的无水乙醇。用紫外分光光度计在425nm处测定每次提取的释放液的吸光度值，根据各结果计算姜黄素的累积释放曲线，如图4J所示在2个小时内从BP-PEG-Tar@Cur纳米颗粒中初始释放约20％Cur，然后持续在24小时内释放至约50％。

实施例6

本实施例提出了一种Aβ单体及原纤维制备的方法，将1mg冷冻的Aβ

实施例7

本实施例提出一种用BCA蛋白定量法测定Cur、PEG-Tar@Cur、BP-PEG-Tar@Cur在抑制Aβ原纤维聚集的效果的方法，取体积100μl浓度为25μM 的Aβ

实施例8

本实施例提出了一种ThT荧光法测试方法，取出等份试样Aβ

实施例9

本实施例提出了一种细胞靶向摄取实验的方法，将N2a细胞以每孔2×10

实施例10

本实施例提出了一种细胞毒性测试方法，在96孔板中接种细胞悬液（100μl），约5000个细胞/孔，细胞培养12小时后加入Aβ

实施例11

本实施例提出了一种清除线粒体ROS的方法，选择对数生长期的N2a细胞，用每50ml添加了 100 U/ml双抗细胞培养基(500μl)、10% FBS的DMEM(23ml)、opti-MEM(23ml)的培养液制成单细胞悬液，按照2×10

实施例12

本实施例提出了一种Transwell体外侵袭实验方法，在细胞水平上用永生化小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd.3细胞）模拟BBB的体外环境，研究光热效应下BP-PEG-Tar@Cur的BBB穿透能力。将bEnd.3（1×10

缩略语和关键术语定义

BP：黑磷，一种黑色有金属光泽的半导体晶体，它的密度为2 .70g/cm

PEG：C18-PEG-NH

Cur：Curcumin，姜黄素，是一种源自植物的多酚化合物，天然存在于姜黄中，姜黄是一种在印度和中国广泛使用的食品和药物。

Tar：4-（二甲氨基）肉桂酸，作为靶向材料，用于靶向Aβ。

PEG-Tar：聚乙二醇硬脂酸肉桂酸组合物。

PEG-Tar@Cur：聚乙二醇硬脂酸肉桂酸姜黄素组合物。

BP-PEG-Tar@Cur：靶向Aβ的肉桂酸黑磷纳米组合物。

NHS：N-羟基丁二酰亚胺，白色至类白色结晶，用于合成氨基酸保护剂、半合成卡那霉素及医药中间体。

EDC：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，是一种有机化合物，化学式为C8H17N3。

AD：Alzheimer ’s disease，阿尔茨海默症，是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。

Aβ(amyloidβ-protein)：β-淀粉样蛋白，分子量约4kDa，由β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)水解而来，由细胞分泌，在细胞基质沉淀聚积后具有很强的神经毒性作用。

FTIR：傅立叶变换红外仪。

DLS：动态光散射仪。

TEM：透射电子显微镜。

HFIP：六氟异丙醇。

SpeedVac：真空浓缩仪。

DMSO：二甲基亚砜。

CLSM：激光共聚焦扫描显微镜。

PBS：磷酸盐缓冲溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na

N2a细胞：N2a细胞全称mouse neuroblastoma N2a cells，是小鼠来源神经瘤母细胞。

DAPI：4，6-二脒基-2-苯基吲哚，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。

NIR：近红外光谱仪。

CCK-8：Cell Counting Kit-8 细胞计数试剂。

ROS：活性氧，是含氧的化学反应性化学物质，包括过氧化物，超氧化物，羟基自由基，单线态氧，和α-氧。

FBS： 胎牛血清。

DMEM：是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基。

Opti-MEM：用于培养造血细胞。

MitoSOX：超氧化物指示剂是一种新型荧光染料,专门靶向活细胞中的线粒体。

BBB：血脑屏障，指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，这些屏障能够阻止某些物质(多半是有害的)由血液进入脑组织。

Calcein-AM/PI染色：Calcein AM具有疏水性，能够轻易进入活细胞细胞膜，Calcein AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶切成膜非渗透性的极性分子Calcein并发射绿色荧光，而死细胞缺乏酯酶无法进行剪切从而不发光；PI不能穿过活细胞细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而达到细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光，两种染料同时染色能够区分活死细胞。

显然，以上所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，附图中给出了本申请的较佳实施例，但并不限制本申请的专利范围。本申请可以以许多不同的形式来实现，相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来而言，其依然可以对前述各具体实施方式所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等效替换。凡是利用本申请说明书及附图内容所做的等效结构，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理在本申请专利保护范围之内。