LncRNA NEAT1在糖尿病中的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及LncRNA NEAT1在糖尿病中的用途。

背景技术

随着基因组测序计划的完成以及新一代深度测序技术的应用，人们发现哺乳动物细胞中多于95％的转录序列为非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)。非编码RNA包括短非编码RNA(包括siRNA、miRNA、piRNA)和长非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)。长链非编码RNA是一种长度大于200bp的非编码RNA，广泛存在于哺乳动物中，通过调节各种基因的表达，进而调节各种生理进程，细胞功能，以及信号通路。主要是通过对转录产物进行抑制进而抑制翻译过程，或者是引起目标mRNA的降解而达到基因沉默的目的，因为lncRNA具有和mRNA类似的polyA尾端，较为稳定，可以在组织、血清和尿液中检测出来。

糖尿病的发病率及患病率正在全世界范围内逐年升高，已成为威胁人民健康的重大疾病。糖尿病是一类以高血糖为特征的代谢性疾病，临床上主要分为I型(胰岛素依赖性)和II型(非胰岛素依赖性)糖尿病，不论是I型还是II型糖尿病，其最主要的症状便是高血糖。高血糖是引发糖尿病并发症的主要原因。我国糖尿病人群的构成以II型糖尿病为主，占糖尿病人群的90％以上，因此，寻找有效的药物靶点，并且针对性地开发预防、治疗糖尿病的药物，一直是糖尿病防治领域的研究重点。

糖尿病重要的病理原因之一是由于脂代谢紊乱产生的大量自由脂肪酸削弱了其它周边脏器对胰岛素的敏感性(胰岛素抵抗)，在肝脏中则明显表现为对肝糖异生抑制作用的减弱，使肝脏的糖异生功能亢进，糖异生过程在肝脏中持续激活，肝糖输出过多是糖尿病患者空腹高血糖和餐后高血糖的重要原因。

有报道研究，肺结核患者PBMC中lncRNA NEAT1表达水平均高于正常对照，差异有统计学意义；lncRNA NEAT1基因上的单核苷酸多态性(SNP)已被证明与肺癌等疾病发病风险明显相关。lncRNA NEAT1有两个转录本：NEAT1_1和NEAT1_2，两个转录本的5’末端完全重合，仅包含一个外显子，且均留在核内。NEAT1_1多聚腺苷化，类似于mRNA；而NEAT1_2对paraspeckles(核旁斑)至关重要，构成其“architectural backbone”，参与许多生物学过程，包括基因表达调控、细胞周期调控、细胞凋亡等，也有研究表明NEAT1参与糖代谢的调控，如NEAT1直接结合并形成用于组装PGK1/PGAM1/ENO1复合物的支架桥以实现高效糖酵解，提示了NEAT1在糖代谢发生发展中的作用。

目前尚未有研究对lncRNA NEAT1基因与糖尿病之间的关系。

发明内容

为了解决上述问题，本发明LncRNA NEAT1在糖尿病中的用途，以解决现有技术中的问题。

本发明的第一方面保护lncRNA NEAT1作为靶标在制备糖尿病预防、治疗或诊断产品中的用途。

优选的，所述产品以lncRNA NEAT1作为药物的靶点。

本发明的第二方面保护lncRNA NEAT1或其促进剂在制备糖尿病预防、治疗或诊断产品中的用途。

优选的，所述lncRNA NEAT1或其促进剂是指能提高lncRNA NEAT1基因表达量的物质。

优选的，所述lncRNA NEAT1或其促进剂为所述糖尿病预防、治疗或诊断产品的唯一有效成分或有效成分之一。

优选的，所述lncRNA NEAT1促进剂选自表达lncRNA NEAT1的表达系统、促进lncRNA NEAT1表达的活性肽、促进lncRNA NEAT1表达的蛋白、促进lncRNA NEAT1表达的寡核苷酸、促进lncRNA NEAT1表达的小分子化合物中的一种或多种。

进一步优选的，所述促进lncRNA NEAT1表达的寡核苷酸的序列包括如SEQ IDNo.7或SEQ ID No.8所示序列。

CACCGGAGGGAGTGGCGGTTGACGG(SEQ ID No.7)

AAACCCGTCAACCGCCACTCCCTCC(SEQ ID No.8)

更优选的，所述表达系统选自表达质粒、宿主细胞或病毒。

进一步优选的，所述表达系统选自表达质粒，所述表达质粒包含SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.8所示的sgRNA。所述表达质粒的出发质粒为lentiSAMv2。

进一步优选的，所述病毒选自腺病毒、腺相关病毒、慢病毒。在某些具体实施方式中，为腺病毒。

进一步优选的，所述腺病毒包含所述表达质粒。

所述腺病毒，由所述表达系统在腺病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。所述腺病毒包装质粒为pAV-CMV-GFP-FLAG。

优选的，所述糖尿病预防、治疗产品通过以下任一种或多种方式预防、治疗糖尿病：

1)降低血糖水平；

2)抑制糖异生能力；

3)抑制糖异生基因表达。

更优选的，所述降低血糖水平是指降低空腹血糖或餐后血糖。

更优选的，所述抑制糖异生表现为肝脏葡萄糖生成降低或血糖降低。所述抑制糖异生也可以表现为丙酮酸耐量提高。

更优选的，所述糖异生基因选自G6pc(葡萄糖-6-磷酸酶)和Pck1(胞质磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶)。本申请发现过表达lncRNA NEAT1能显著抑制肝脏糖异生基因G6pc和Pck1的表达，从而影响糖代谢途径。

本发明的第三方面保护一种预防和/或治疗糖尿病的药物，所述药物包括lncRNANEAT1或其促进剂，以及药学上可接受的辅料。

优选的，所述lncRNA NEAT1或其促进剂是指对lncRNA NEAT1具有促进效果的分子。

优选的，所述lncRNA NEAT1或其促进剂是指可提高lncRNA NEAT1基因表达量的物质。

优选的，所述lncRNA NEAT1或其促进剂为所述糖尿病预防、治疗或诊断产品的唯一有效成分或有效成分之一。

优选的，所述lncRNA NEAT1促进剂选自过表达lncRNA NEAT1的表达系统、促进lncRNA NEAT1表达的活性肽、促进lncRNA NEAT1表达的蛋白、促进lncRNA NEAT1表达的寡核苷酸、促进lncRNA NEAT1表达的小分子化合物中的一种或多种。

进一步优选的，所述促进lncRNA NEAT1表达的寡核苷酸的序列包括如SEQ IDNo.7或SEQ ID No.8所示序列。

CACCGGAGGGAGTGGCGGTTGACGG(SEQ ID No.7)

AAACCCGTCAACCGCCACTCCCTCC(SEQ ID No.8)

更优选的，所述表达系统选自表达质粒、宿主细胞或病毒。

进一步优选的，所述表达系统选自表达质粒，所述表达质粒包含包括SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.8所示的sgRNA。所述表达质粒的出发质粒为lentiSAMv2。所述sgRNA能够提高CRISPRa系统的激活转录的能力，从而使目的基因lncRNA Neat1过表达。

表达lncRNA Neat1的表达质粒的构建方法，包括：

sgRNA退火形成双链；质粒酶切成线性质粒；将sgRNA与质粒连接，得到含有sgRNA质粒。

进一步优选的，所述病毒选自腺病毒、腺相关病毒、慢病毒。在某些具体实施方式中，为腺病毒。所述腺病毒，由所述表达系统在腺病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。所述腺病毒包装质粒为pAV-CMV-GFP-FLAG。

进一步优选的，所述腺病毒包含所述表达质粒。

优选地，表达lncRNA Neat1的腺病毒的构建方法，包括：

腺病毒包装质粒经MluI-HF和XbaI酶切后；

与含有sgRNA质粒连接，感染HEK293细胞；

取细胞上清液，离心、过滤；弃上清，向沉淀中加入病毒保存缓冲液即得表达lncRNA Neat1的腺病毒。

优选的，所述药学上可接受的辅料是指当药物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。所述药学上可接受的辅料应当与所述促进剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低促进剂的效果。所述药学上可接受的辅料选自载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂和润湿剂中的一种或多种。可作为药学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂和润湿剂的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

优选的，所述药物为溶液剂、注射剂、喷雾剂、滴鼻剂、气雾剂、粉雾剂、片剂、胶囊剂和颗粒剂中的一种或多种。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。优选为注射剂。

优选的，所述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。优选地，通过注射给药。所述药物还可与其他治疗手段结合使用，所述其他手段包括手术、放疗、化疗、靶向治疗。

本发明的第四方面保护一种筛选预防和/或治疗糖尿病药物的方法，所述方法包括：以lncRNA NEAT1为药物靶点，寻找能够促进lncRNA NEAT1的表达和/或功能的物质作为候选药物。

优选的，所述方法包括：在体外向细胞中施加待选药物，共培养后检测细胞中lncRNA NEAT1的含量。所述细胞可以来自哺乳动物。

试验者可以通过检测共培养后lncRNA NEAT1的含量判定药物是否是具有治疗意义的药物。通常来说，与对照组相比，可以使得lncRNA NEAT1的含量分别提高50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或者100％的药物，可以判定为具有治疗意义的药物。

优选的，所述药物能够促进细胞中lncRNA NEAT1至少50％，则判定为具有治疗意义的药物。

本申请中所述糖尿病选自I型糖尿病、II型糖尿病。

本发明进一步提供了一种治疗或预防糖尿病的方法，它包括给予有需要的对象(如哺乳动物)施用有效量的lncRNA NEAT1或其促进剂。所述方法也可以是体外的或非治疗性的。

进行治疗性或预防性治疗的对象或个体优选哺乳动物，例如但不限于人、灵长类、牲畜(如绵羊、牛、马、驴、猪)、宠物(如狗、猫)、实验室试验动物(如小鼠、家兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)或被捕获的野生动物(如狐狸、鹿)。所述对象优选灵长类。所述对象最优选人。

所述对象可以是糖尿病的患者或者期待预防糖尿病的个体。所述lncRNA NEAT1或其促进剂或药物可以在接受抗糖尿病治疗前、中、后向对象施用。

本发明的有益效果是：

1)本申请发现与正常小鼠相比较，糖尿病模型小鼠的肝脏组织中的lncRNA Neat1的表达水平明显减少，因此本lncRNA NEAT1可作为糖尿病的药物靶点。

2)本申请在野生型小鼠中通过尾静脉注射过表达lncRNA Neat1的腺病毒(AdNeat1实验组)，发现过表达lncRNA Neat1抑制空腹血浆中葡萄糖水平、抑制肝脏糖异生能力、抑制糖异生相关基因的表达。

3)本申请进一步在ob/ob(II糖尿病模型)小鼠中通过尾静脉注射过表达lncRNANeat1的腺病毒(AdNeat1实验组)，发现过表达lncRNA Neat1能显著抑制空腹血浆中葡萄糖水平、抑制肝脏糖异生能力、抑制糖异生相关基因的表达，从而改善小鼠高血糖表型。

以上说明lncRNA NEAT1具有调控血糖的作用，可作为靶点，对今后糖尿病的药物开发和预防治疗具有重要意义。

附图说明

图1A显示为本发明实施例1中野生型(WT)与糖尿病模型(ob/ob)小鼠的肝脏组织中Neat1表达水平的检测结果图，*代表P<0.05；

图1B显示为本发明实施例1中野生型(WT)与糖尿病模型(db/db)小鼠的肝脏组织中Neat1表达水平的检测结果图，*代表P<0.05；

图2显示为本发明实施例2中野生型对照组(WT)与实验组(AdNeat1)小鼠的肝脏组织中Neat1表达水平的检测结果图，*代表P<0.05；

图3显示为本发明实施例2中野生型对照组(WT)与实验组(AdNeat1)小鼠的空腹血糖变化水平对比示意图，*代表P<0.05；

图4A显示为本发明实施例2中野生型对照组(WT)与实验组(AdNeat1)小鼠经GTT试验得到的糖异生能力对比图，*代表P<0.05；***代表P<0.001；

图4B显示为本发明实施例2中野生型对照组(WT)与实验组(AdNeat1)小鼠经GTT试验的GTT曲线下面积统计结果对比图，*代表P<0.05；***代表P<0.001；

图5A显示为本发明实施例2中野生型对照组(WT)与实验组(AdNeat1)小鼠的肝脏组织中参与糖异生的G6pc基因表达水平检测结果图，*代表P<0.05；

图5B显示为本发明实施例2中野生型对照组(WT)与实验组(AdNeat1)小鼠的肝脏组织中参与糖异生的Pck1基因表达水平检测结果图，*代表P<0.05；

图6显示为本发明实施例3中糖尿病模型照组(AdScr)与实验组(AdNeat1)小鼠的肝脏组织中Neat1表达水平的检测结果图，*代表P<0.05；

图7显示为本发明实施例3中糖尿病模型对照组(AdScr)与实验组(AdNeat1)小鼠的空腹血糖变化水平对比示意图，**代表P<0.01；

图8A显示为本发明实施例3中糖尿病模型对照组(AdScr)与实验组(AdNeat1)小鼠经GTT试验得到的糖异生能力对比图，*代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001；

图8B显示为本发明实施例3中糖尿病模型对照组(AdScr)与实验组(AdNeat1)小鼠GTT曲线下面积统计结果对比图，*代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001；

图9A显示为本发明实施例3中糖尿病模型对照组(AdScr)与实验组(AdNeat1)小鼠的肝脏组织中参与糖异生的G6pc基因表达水平检测结果图，*代表P<0.05；

图9B显示为本发明实施例3中糖尿病模型对照组(AdScr)与实验组(AdNeat1)小鼠的肝脏组织中参与糖异生的Pck1基因表达水平检测结果图，*代表P<0.05。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1

本实施例1中，以野生型小鼠和II型糖尿病雄鼠模型为研究对象，分析其肝脏组织中lncRNA Neat1表达水平，包括如下：

1.1、小鼠饲养

6-8周龄SPF级C57/BL6(也即WT野生型，n＝22只)、II型糖尿病雄鼠模型，购买自北京华阜康。其中，II型糖尿病雄鼠模型包含2种模型，1种是ob/ob小鼠模型(n＝17只)，1种是db/db小鼠模型(n＝13只)。

根据体重平均值分成笼饲养，饲养条件为：温度20-25℃，相对湿度40％-70％，昼夜明暗交替12h/12h，自由饮水，适应1周后开始试验。

瘦素是一种调节食欲的激素，瘦素(Lep)或瘦素受体(Lepr)的突变会导致饮食失调(食欲过盛)，诱发肥胖(obese)和糖尿病(diabetes)。

纯合的Lep

1.2、小鼠肝脏组织RNA提取

1.2.1、Trizol提取RNA

麻醉小鼠，酒精消毒，暴露腹腔，带线缝合针从下腔静脉下穿过，打一假结，从假结下方的静脉插入静脉留置针，将假结系紧。通过留置针注入PBS，同时剪开肝门静脉，灌注时间3-5min。

肝脏血液冲洗干净后，翻开肝脏取出胆囊，摘下肝脏放入置于冰上的平皿中，剪去小块组织约50mg左右。其余肝脏组织放置液氮冷冻后，转移到-80℃长期保存。

将小块组织放置1.5mL EP管内，放入研磨珠子，加入1mL Trizol裂解液，在预冷的组织研磨仪中震荡破碎，室温静置2-3min；在EP管中加入200μL氯仿，盖好盖子，涡旋震荡15s，室温静置2-3min，4℃，12,000rpm离心15min，轻轻拿出来，将上层水相用移液枪轻轻吸出，转移到新的1.5mL RNase Free EP管中。加入500μL异丙醇，室温静置10min，4℃，12,000rpm离心10min，移去上清，留下沉淀。在EP管中先加入1mL 75％的乙醇溶液，涡旋震荡混匀，4℃，7500rpm离心10min，弃去酒精，4℃，7500rpm离心2min，空甩后吸干酒精，在通风橱在干燥5-10min。加入50μL无RNase水溶解RNA，取1μL RNA用nano核酸测定仪器检测RNA浓度和OD值。

取1μg总RNA进行反转录，将其余的RNA放置-80℃冰箱保存。

1.2.2、反转录

取1μg总RNA，加入反转录试剂，混匀后放置PCR仪中进行反转录，反应体系见表1，发转录条件见表2，得到反转录产物。

表1

反转录条件见表2。

表2

1.2.3、荧光定量PCR

将步骤1.2.2的反转录产物稀释10倍，取2μL cDNA，加入荧光定量反应试剂，混匀后放置荧光定量PCR仪中，反应体系见表3：

表3

引物序列为：

鼠源Neat1 F上游引物：GCTCTGGGACCTTCGTGACTCT(SEQ ID No.1)

鼠源Neat1 R下游引物：CTGCCTTGGCTTGGAAATGTAA(SEQ ID No.2)

鼠源Actin上游引物：CAGCTTCTTTGCAGCTCCTT(SEQ ID No.3)

鼠源Actin下游引物：GCAGCGATATCGTCATCCA(SEQ ID No.4)

反应体系见表4。

表4

使用2

1.3、糖尿病小鼠与野生型小鼠中lncRNA Neat1的mRNA表达水平的研究

从图1可知，与野生型对照组(WT)小鼠相比，糖尿病模型(ob/ob)小鼠肝脏组织中lncRNA Neat1的mRNA表达水平下调约40％；糖尿病模型(db/db)小鼠肝脏组织中lncRNANeat1的mRNA表达水平下调约60％。说明糖尿病模型小鼠中lncRNA Neat1的mRNA表达水平较低，lncRNA Neat1可能是制备糖尿病预防、治疗或诊断产品的靶标。

实施例2

本实施例2中，构建重组腺病毒(AdScr)和表达lncRNA Neat1的重组腺病毒(表达lncRNA Neat1的重组腺病毒标记为AdNeat1)，并在野生型小鼠体内分别注射重组腺病毒AdScr和重组腺病毒AdNeat1)，考察过表达lncRNA Neat1对血糖、糖异生能力、糖异生基因表达的影响。包括如下步骤：

2.1、构建重组腺病毒(AdScr)和表达lncRNA Neat1的重组腺病毒

sgRNA(http://chopchop.cbu.uib.no/)设计序列如下：

AdScr F：CACCGGCACTACCAGAGCTAACTAGCA(SEQ ID No.5)

AdScr R：AAACTGCTAGTTAGCTCTGGTAGTGCC(SEQ ID No.6)

AdNeat1 F：CACCGGAGGGAGTGGCGGTTGACGG(SEQ ID No.7)

AdNeat1 R：AAACCCGTCAACCGCCACTCCCTCC(SEQ ID No.8)

(1)重组穿梭质粒lentiSAMv2-Scr和lentiSAMv2-Neat1的构建及鉴定

将lentiSAMv2(Addgene，75112)质粒用限制性内切酶BsmBI(NEB，R0580S)进行单酶切，回收目的片段后用T4连接酶分别与AdScr的sgRNA或AdNeat1的sgRNA进行连接，转化到Stbl3(Thermo，C739601)感受态细胞后挑取lentiSAMv2-Scr(由lentiSAMv2质粒与AdScr的sgRNA连接获得)和lentiSAMv2-Neat1(由lentiSAMv2质粒与AdNeat1的sgRNA连接获得)阳性克隆扩繁获取菌液，提取质粒后测序鉴定。

(2)重组腺病毒质粒AdScr和AdNeat1的构建及鉴定

将腺病毒工具载体pAV-CMV-GFP-FLAG(Heyuan，H201)用MluI-HF限制性内切酶(NEB，R3198V)和XbaI限制性内切酶(NEB，R0145V)进行双酶切线性化后，用无缝克隆试剂盒(Sunbio，SCNP-50)将lentiSAMv2-Scr和lentiSAMv2-Neat1中的包含促进Scr和Neat1过表达的序列分别克隆到pAV-CMV-GFP-FLAG上，转化到DH5α(Sangon，B528413)感受态细胞后挑取AdScr和AdNeat1阳性克隆扩繁获取菌液，提取质粒后测序鉴定。

(3)腺病毒AdScr和AdNeat1的获取

按照上海生博腺病毒包装操作说明书进行病毒的包装，纯化及滴度测定。

2.2、实验分组

以22只野生型小鼠为对象，随机分为2组，一组为野生型对照组(WT)，另外一组为实验组(AdNeat1)。

实验组(AdNeat1)为，野生型小鼠C57/BL6适应一周后，按照每只小鼠1×10

野生型对照组(WT)为，野生型小鼠C57/BL6适应一周后，按照每只小鼠1×10

2.3、空腹血糖的研究

病毒注射感染7d后，各组小鼠禁食不禁水16h，然后用罗氏全活力型血糖仪测量各组小鼠空腹血糖，每次测量由相同人员操作，其他条件保持一致；同时剪尾采血。

剪尾采血方法：首先用酒精棉球擦拭小鼠尾端，然后用消毒剪刀剪去尾尖1-2mm左右，将血直接滴在已准备好的血糖试纸上测量。采血结束后对小鼠尾端伤口行碘伏消毒。

2.4、丙酮酸耐受的研究(PTT)

病毒注射感染7d后，各组小鼠禁食不禁水16h后，根据小鼠的体重注射适量丙酮酸钠溶液，分别在注射丙酮酸钠溶液后的15min、30min、60min、90min和120min检测小鼠的血糖值。

2.5、lncRNA Neat1的mRNA表达水平以及糖异生G6pc和Pck1基因的表达水平的研究

mRNA表达水平与同实施例1中步骤1.2的相同。

以Actin为内参基因，利用如下引物采用荧光定量PCR，获得G6pc和Pck1基因的表达水平。

鼠源G6pc F上游引物：ACACCGACTACTACAGCAACAG(SEQ ID No.9)

鼠源G6pc R下游引物：CCTCGAAAGATAGCAAGAGTAG(SEQ ID No.10)

鼠源Pck1 F上游引物：CATATGCTGATCCTGGGCATAAC(SEQ ID No.11)

鼠源Pck1 R下游引物：CAAACTTCATCCAGGCAATGTC(SEQ ID No.12)

2.6、实验结果分析

2.6.1、过表达lncRNA Neat1对野生型小鼠的体内lncRNA Neat1表达水平的研究

从图2可知，与野生型对照组(WT)小鼠相比，实验组(AdNeat1)小鼠的肝脏组织中lncRNA Neat1的mRNA表达水平上调约0.75倍，说明尾静脉注射过表达lncRNA Neat1的重组腺病毒后成功过表达了lncRNA Neat1。

2.6.2、过表达lncRNA Neat1对野生型小鼠的肝脏参与糖异生基因表达的研究

肝糖异生失调会导致1型和2型糖尿病的高血糖，肝脏胰岛素抵抗是这类疾病发病机制的主要环节，其最明显的病理生理特点就是糖异生和糖原分解功能发生紊乱导致肝糖输出增多，其中糖异生的作用尤为显著。因此有效抑制肝脏过度糖异生减少内源性葡萄糖生成将是治疗这些疾病的重要靶标之一。G6pc(葡萄糖-6-磷酸酶)和Pck1(胞质磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶)是糖异生的两个主要靶基因。

从图5可知，与野生型对照组(WT)小鼠相比，实验组(AdNeat1)小鼠的肝脏组织中参与肝糖异生相关基因G6pc和Pck1的表达有明显的下调，能抑制肝脏糖异生基因表达，说明过表达lncRNA Neat1影响了糖代谢途径。

2.6.3、过表达lncRNA Neat1对野生型小鼠的空腹血糖的研究

取野生型对照组(WT)小鼠、实验组(AdNeat1)小鼠，禁食16h后，测定小鼠的血糖水平。结果见图3。

从图3可知，相比于野生型对照组(WT)小鼠，实验组(AdNeat1)小鼠的血糖水平显著减少，说明过表达lncRNA Neat1抑制空腹血糖的含量。

2.6.4、过表达lncRNA Neat1对野生型小鼠的糖异生能力的研究

丙酮酸是糖异生的原料。当机体处于饥饿状态下，给予相同剂量丙酮酸，血糖越高，说明糖异生功能越强。丙酮酸耐量实验是目前研究糖异生的金标准。

各取11只野生型对照组(WT)小鼠、11只实验组(AdNeat1)小鼠，禁食16h后，腹腔注射2g/kg丙酮酸钠溶液，在注射后0、15、30、60、90、120min测定小鼠的血糖水平。结果见图4A、图4B。

从图4A和4B可知，相比于野生型对照组(WT)小鼠，注射丙酮酸钠溶液后，实验组(AdNeat1)小鼠的血糖水平显著减少，说明过表达lncRNA Neat1抑制肝糖异生能力。

实施例3

本实施例3中，在糖尿病模型小鼠中体内分别注射重组腺病毒(AdScr)和过表达lncRNA Neat1的重组腺病毒(AdNeat1)，考察过表达lncRNA Neat1对血糖、糖异生能力或糖异生基因表达的影响。包括如下步骤：

3.1、实验分组

以17只ob/ob小鼠模型为对象，随机分为2组，一组为糖尿病模型对照组(AdScr)，另外一组为实验组(AdNeat1)。

实验组(AdNeat1)为，ob/ob小鼠模型适应一周后，按照每只小鼠1×10

糖尿病模型对照组(AdScr)为，ob/ob小鼠模型适应一周后，按照每只小鼠1×10

同实施例2一样，检测注射过表达lncRNA Neat1的重组腺病毒后的lncRNA Neat1表达水平、空腹血糖、糖异生能力、糖异生基因表达。

3.2、实验结果

3.2.1、过表达lncRNA Neat1对糖尿病模型小鼠体内lncRNA Neat1的表达水平的研究

从图6可知，与糖尿病模型对照组(AdScr)小鼠相比，实验组(AdNeat1)小鼠的肝脏组织中lncRNA Neat1的mRNA表达水平上调约0.6倍，说明尾静脉注射腺病毒后成功过表达了lncRNA Neat1的水平。

3.2.2、过表达lncRNA Neat1对糖尿病模型小鼠的肝脏参与糖异生基因表达的研究

从图9可知，与糖尿病模型小鼠对照组(AdScr)相比，实验组(AdNeat1)的肝脏组织中参与肝糖异生相关基因G6pc和Pck1的表达有明显的下调。说明过表达lncRNA Neat1影响了糖代谢途径。

3.2.3、过表达lncRNA Neat1对糖尿病模型小鼠的空腹血糖的研究

取糖尿病模型对照组(AdScr)小鼠、实验组(AdNeat1)小鼠，禁食16h后，测定小鼠的血糖水平。结果见图7。

从图7可知，相比于糖尿病模型对照组(AdScr)，实验组(AdNeat1)小鼠的空腹血糖水平显著减少，说明过表达lncRNA Neat1抑制空腹血糖的含量。

3.2.4、过表达lncRNA Neat1对糖尿病模型小鼠的糖异生能力的研究

分别取9只糖尿病模型对照组(AdScr)小鼠、8只实验组(AdNeat1)小鼠，禁食16h后，每只小鼠通过腹腔注射2g/kg丙酮酸钠溶液，在注射后0、15、30、60、90、120min测定小鼠的血糖水平。结果如图8A、图8B。

从图8A、8B可知，相比于糖尿病模型对照组(AdScr)，注射丙酮酸钠溶液后，实验组(AdNeat1)小鼠的血糖水平显著减少，说明过表达lncRNA Neat1抑制肝糖异生能力，改善了小鼠高血糖表型。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。