一种抗衰抗炎组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种抗衰抗炎组合物及其制备方法和应用。

背景技术

间充质干细胞是人体内一种具有多向分化能力的细胞，广泛存在于骨髓、脂肪等组织中，虽然在人体总细胞中所占据的比例很低，但是却对人体健康以及某些疾病的发生有着重要的作用，近年来逐渐成为生物医学和生命健康等科学领域研究的热点，随着科学家对间充质干细胞的研究逐步深化，人类未来有希望以此为治疗工具去攻克那些当下的医学技术还难以治疗的重大疾病。间充质干细胞的体外培养技术已经相对成熟，从原代细胞的获取到实验室的人工培养，都有一套较为完整的技术方案。

皮肤是人体最大的器官，位于人体结构的最外面。其主要功能是发挥免疫屏障作用，保护人体免受外界有害物质、病原体等入侵，还具有调节机体新陈代谢、感触觉等功能。然而，皮肤经常因各种内在病理及外界机械因素而受损，这些急、慢性的皮肤缺损给患者及社会带来了沉重的负担，皮肤炎症和皮肤屏障破坏是大多数皮肤问题的特点。抗衰抗炎和修复皮肤屏障已成为当前皮肤护理的重中之重。

已有将间充质干细胞用于皮肤修复的报道，但存在稳定性和修复效果不够理想的问题。因此，提供一种稳定性好、修复效果好的间充质干细胞组合物具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗衰抗炎组合物及其制备方法和应用，在细胞层面表现出较好的抗衰抗炎活性，可应用于护肤，促进胶原蛋白合成、减缓炎症反应。

为了实现上述目的，本申请采用了如下技术方案：

一种抗衰抗炎组合物，包括姜黄素预处理的间充质干细胞培养上清液。

在以上技术方案中，还包括具有抗炎抗氧化功效的提取物，所述提取物为植物提取物、动物提取物或微生物提取物。

在以上技术方案中，所述姜黄素预处理的间充质干细胞培养上清液为采用姜黄素刺激间充质干细胞后培养一段时间，然后收集上清液制备而成。

在以上技术方案中，刺激所述间充质干细胞的所述姜黄素的终浓度为100μM，培养的时间为48h。

在以上技术方案中，所述姜黄素预处理的间充质干细胞培养上清液经过离心或者过0.8μm滤膜处理。

上述抗衰抗炎组合物的制备方法，包括以下步骤：

S1：间充质干细胞进行传代培养；

S2：姜黄素刺激S1的培养物继续培养，收集培养的上清液；

S3：S2收集的上清液进行离心或者过0.8μm滤膜处理；

S4：将S3处理好的上清液与具有抗炎抗氧化功效的提取物混合，即得所述抗衰抗炎组合物。

在以上技术方案中，S2的具体方法为：在S1细胞一次传代贴壁后，在培养基中添加终浓度为100μM的姜黄素，继续培养48h后，收集培养上清液。

上述抗衰抗炎组合物或上述制备方法在抗衰抗炎上的应用，可应用于护肤，促进胶原蛋白合成、减缓炎症反应。

本发明的有益效果在于：本发明以间充质干细胞的体外培养技术为基础，配合使用姜黄素的刺激，使间充质干细胞在体外培养中分泌出具有显著抗衰抗炎作用的生物活性成分，通过配合具有抗炎抗氧化功效的提取物制备成一种抗衰抗炎组合物，在细胞层面表现出较好的抗衰抗炎活性，可应用于护肤，促进胶原蛋白合成、减缓炎症反应。

附图说明

为了更清楚地说明本公开实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为实施例1HDF的COL1A1、COL1A2基因表达情况；

图2为实施例2HDF的COL1A1、COL1A2基因表达情况；

图3为实施例3HDF的COL1A1、COL1A2基因表达情况。

图4为实施例1RAW264.7的IL-10基因表达情况；

图5为实施例1RAW264.7的TNFα、iNOS基因表达情况；

图6为实施例2RAW264.7的IL-10基因表达情况；

图7为实施例2RAW264.7的TNFα、iNOS基因表达情况；

图8为实施例3RAW264.7的IL-10基因表达情况；

图9为实施例3RAW264.7的TNFα、iNOS基因表达情况；

图10为实施例4HDF PoEx的COL1A1、COL1A2基因表达情况；

图11为实施例5HDF ERGO的COL1A1、COL1A2基因表达情况；

图12为实施例6HDF GSEx的COL1A1、COL1A2基因表达情况；

图13为实施例4RAW264.7 PoEx的IL-10基因表达情况；

图14为实施例4RAW264.7 PoEx的TNFα、iNOS基因表达情况；

图15为实施例5RAW264.7 ERGO的IL-10基因表达情况；

图16为实施例5RAW264.7 ERGO的TNFα、iNOS基因表达情况；

图17为实施例6RAW264.7 GSEx的IL-10基因表达情况；

图18为实施例6RAW264.7 GSEx的TNFα、iNOS基因表达情况。

具体实施方式

下面结合附图对本公开实施例进行详细描述。

以下通过特定的具体实例说明本公开的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本公开的其他优点与功效。显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。本公开还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本公开的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。基于本公开中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。

需要说明的是，下文描述在所附权利要求书的范围内的实施例的各种方面。应显而易见，本文中所描述的方面可体现于广泛多种形式中，且本文中所描述的任何特定结构及/或功能仅为说明性的。基于本公开，所属领域的技术人员应了解，本文中所描述的一个方面可与任何其它方面独立地实施，且可以各种方式组合这些方面中的两者或两者以上。举例来说，可使用本文中所阐述的任何数目个方面来实施设备及/或实践方法。另外，可使用除了本文中所阐述的方面中的一或多者之外的其它结构及/或功能性实施此设备及/或实践此方法。

还需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本公开的基本构想，图式中仅显示与本公开中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。

另外，在以下描述中，提供具体细节是为了便于透彻理解实例。然而，所属领域的技术人员将理解，可在没有这些特定细节的情况下实践所述方面。

本发明提供了一种抗衰抗炎组合物及其制备方法和应用。本发明主要包括干细胞的培养、姜黄素的刺激、培养上清的收集处理、培养上清与活性分子的组合等部分，最终获得的组合物，分别与特定细胞进行共孵育培养，检测细胞中某些相关基因的表达变化情况，从而评估该组合物的抗衰抗炎效果。

一、抗衰抗炎组合物的制备方法

1、干细胞传代培养

采用无血清培养基对间充质干细胞进行培养，遵循细胞培养的一般技术，使干细胞不断扩增达到一定的数量，为后续姜黄素的刺激培养储备足够的细胞量。

2、姜黄素刺激培养

在细胞一次传代贴壁后，在培养基中添加终浓度为100μM的姜黄素，继续培养48h后，收集培养上清液。

3、培养上清液处理

将收集得到的上清液采用离心或过0.8μm的滤膜的方法，去除死细胞及细胞碎片，暂存于4℃冰箱中。

4、上清液组合物

将处理好的上清液与具有抗炎抗氧化功效的提取物混合后，得到组合物，通过添加植物提取物一方面可以在一定程度上增加外泌体的稳定性，另一方面与植物性活性分子发挥协同作用，增强活性。提取物的浓度可在0.01％至5％之间浮动，根据提取物性质决定，提取物可以为植物提取物、动物提取物或微生物提取物。

二、抗衰抗炎效果评估

促进胶原蛋白合成

本实验以HDF(人真皮成纤维细胞)为研究载体，以胶原蛋白合成相关基因作为检测指标，将不同组别待测物与HDF进行共孵育培养，培养结束后，裂解细胞，提取细胞RNA，采用qPCR技术检测COL1A1、COL1A2基因在不同组别中的相对表达水平，检测组合物对HDF细胞中胶原蛋白合成的影响，从而表征其抗衰老作用。

减缓炎症反应

本实验以RAW264.7(小鼠巨噬细胞)为研究载体，以炎症相关基因为检测指标，将不同组别待测物与HDF进行共孵育培养，培养结束后，裂解细胞，提取细胞RNA，采用qPCR技术检测IL-10、TNFα、iNOS基因在不同组别中的相对表达水平，从而表征其抗炎作用。

三、实验验证过程

实施例1

1、将融合度达到80％以上的间充质干细胞进行传代培养，按照15000/㎝

2、过夜贴壁后，将姜黄素刺激组换成含姜黄素100μM的无血清培养基，进行刺激培养，37℃，5％的二氧化碳。

3、继续培养48h，并观察细胞生长情况，可适当延长培养时间，当融合度达到80％～90％时，收集2组的培养上清液，并离心(3000g，30min)，去除死细胞和细胞碎片，放置于4℃冰箱(同时留取一部分未离心处理的上清液)。

4、将2组培养上清液分别与马齿苋提取物按照1ml：500μg比例混合，得到未刺激组合物1、刺激组合物1，同时将未离心的上清液按此比例混合后得到未刺激组合物1(未离心)、刺激组合物1(未离心)。

实施例2

1、将融合度达到80％以上的间充质干细胞进行传代培养，按照20000/㎝2的接种密度进行接种，接种2组，1组为未刺激培养组，1组为姜黄素刺激培养组，采用无血清培养基进行培养。

2、过夜贴壁后，将姜黄素刺激组换成含姜黄素150μM的无血清培养基，进行刺激培养，37℃，5％的二氧化碳。

3、继续培养48h，并观察细胞生长情况，可适当延长培养时间，当融合度达到80％～90％时，收集2组的培养上清液，并离心(3000g，30min)，去除死细胞和细胞碎片，放置于4℃冰箱(同时留取一部分未离心处理的上清液)。

4、将2组培养上清液分别与麦角硫因按照1ml：500μg比例混合，得到未刺激组合物2、刺激组合物2，同时将未离心的上清液按此比例混合后得到未刺激组合物2(未离心)、刺激组合物2(未离心)。

实施例3

1、将融合度达到80％以上的间充质干细胞进行传代培养，按照20000/㎝2的接种密度进行接种，接种2组，1组为未刺激培养组，1组为姜黄素刺激培养组，采用无血清培养基进行培养。

2、过夜贴壁后，将姜黄素刺激组换成含姜黄素150μM的无血清培养基，进行刺激培养，37℃，5％的二氧化碳。

3、继续培养48h，并观察细胞生长情况，可适当延长培养时间，当融合度达到80％～90％时，收集2组的培养上清液，并离心(3000g，30min)，去除死细胞和细胞碎片，放置于4℃冰箱同时留取一部分未离心处理的上清液)。

4、将2组培养上清液分别与葡萄籽提取物按照1ml：500μg比例混合，得到未刺激组合物3、刺激组合物3，同时将未离心的上清液按此比例混合后得到未刺激组合物3(未离心)、刺激组合物3(未离心)。

组合物效果评估

细胞接种：

将HDF、RAW264.7进行传代培养，待细胞融合度达到90％左右时，接种细胞至6孔板中，HDF按照15000/㎝2、RAW264.7按照30000/㎝2接种，培养基采用含10％FBS(胎牛血清)的DMEM(高糖培养基)。

组别设置：

对照组(control)、未刺激组合物1(未离心)(NCur-NCf-1)、未刺激组合物1(NCur-Cf-1)、刺激组合物1(未离心)(Cur-NCf-1)、刺激组合物1(Cur-Cf-1)。

对照组(control)、未刺激组合物2(未离心)(NCur-NCf-2)、未刺激组合物2(NCur-Cf-2)、刺激组合物2(未离心)(Cur-NCf-2)、刺激组合物2(Cur-Cf-2)。

对照组(control)、未刺激组合物3(未离心)(NCur-NCf-3)、未刺激组合物3(NCur-Cf-3)、刺激组合物3(未离心)(Cur-NCf-3)、刺激组合物3(Cur-Cf-3)。

待测物添加：

过夜贴壁后，弃去原培养基，按照下表的设计，分别将待测物添加至各组对应的孔中，2种细胞的添加方案一致。继续培养48h。

细胞收获和裂解

加入待测物48h后，弃去原培养基，用DPBS清洗1遍，将细胞消化下来后，再用DPBS清洗一遍，每孔各加入500μl提取RNA专用的裂解液，吹打至看不见细胞，液体基本澄清，表明细胞已经充分裂解，将裂解后的细胞放置于-80℃冰箱暂存。

RNA抽提和浓度测定

按照RNA抽提试剂盒的操作，进行各组孔的RNA抽提，抽提得到的RNA用无酶水溶解后，采用微量分光光度计测定浓度值，溶解后的RNA溶液必须置于冰上。

反转录和qPCR(定量PCR)

按照试剂盒方法进行反转录，采用1000ng的RNA，进行反转录和qPCR。

HDF检测基因为COL1A1、COL1A2，其与胶原合成相关，相对表达水平升高可表征胶原合成水平的提高。

RAW264.7检测基因为IL-10、TNFα、iNOS，其与炎症反应相关，IL-10相对表达水平的升高、TNFα和iNOS相对表达水平降低，可表征炎症的缓解。

数据处理和结果

采用2^(-ΔΔCT)法进行数据处理，并制成柱状图，如图1-9所示。

从数据结果来看，HDF检测基因为COL1A1、COL1A2相对表达水平升高，RAW264.7检测基因为IL-10、TNFα、iNOS，IL-10相对表达水平的升高、TNFα和iNOS相对表达水平降低，可表征炎症的缓解。未用姜黄素预处理刺激的细胞上清的活性低于经过刺激的，对于姜黄素预处理刺激的细胞上清组合物，离心后的组合物与未离心的相比效果更好，而且离心处理后去除细胞代谢杂质，观感会更好，所以细胞上清应经过离心处理后再进行应用更佳。

为了进一步验证组合物对HDF、RAW264.7的作用，对比组合物与纯提取物的效果，细胞培养和基因检测过程参照上述方法，按照下述表格进行不同组别的样品添加，Curcumin组溶液是姜黄素浓度为300μM的溶液，DPBS作为溶剂，按照下述方案添加后，作用于细胞的终浓度约为100μM。PoEx组、ERGO组、GSEx组是分别将组合物1、组合物2、组合物3中的上清液更换为DPBS。

数据处理方式与前述方法一致，制作柱状图，如附图10-18所示。各组合物组COL1A1、COL1A2相对表达水平升高，IL-10相对表达水平升高、TNFα和iNOS相对表达水平降低，可表征组合物组的抗衰老和抗炎活性强于单纯的提取物。

本发明制备的含有姜黄素预处理的间充质干细胞培养上清抗衰抗炎组合物在细胞层面表现出较好的抗炎抗衰活性，在护肤品领域有很好的应用潜力。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。