一种荧光各项异性探测方法及其探测系统

技术领域

本发明涉及结构光显微成像技术领域，特别是涉及一种荧光各项异性探测方法及其探测系统。

背景技术

为了使药物在临床上取得成功，它必须在无毒性或毒性极小且可接受的情况下产生所需的治疗效果。为了更好地了解体内药物效应，需要直接测量单细胞以及组成组织和器官的细胞群中的靶向药的作用效果。荧光标记显微技术广泛应用于生物样本亚细胞结构的观测。荧光分子的偶极子取向可以反应靶蛋白的空间朝向，进而研究活细胞体内的靶蛋白结构和动力学问题。荧光分子优先吸收电矢量平行的偶极子。当偏振光投射到分子时，偏振方向的分子会优先吸收荧光，选择性激发偶极排列的荧光分子。荧光吸收和发射偏振之间形成的相对角度就是荧光各向异性(Fluorescence Anisotropy，FA)。

荧光各向异性基于荧光的技术在药物研究领域中凸显出重要的作用。荧光各向异性的原理是在恒定温度和溶液粘度下，荧光团的各向异性程度与其分子旋转成反比。当荧光分子结合或在高粘度介质中扩散旋转更慢，表现出的荧光各向异性更高。当荧光分子旋转扩散或共振导致能量转移，由此减少极化，即表现出的荧光各向异性偏低。通过读取小分子的荧光各向异性值，可以测量靶标与荧光标记药物之间的结合和解离常数。

为了实现FA的测量，在先技术一给出了一种基于荧光成像的FA测量成像方法。这一技术通过偏振方向荧光激发并探测正交偏振方向荧光成像，构建荧光各向异性参数模型，实现了荧光各向异性的探测。然而，它无法实现高速、动态的结构光照明成像。为了实现结构光成像，在先技术二提出了结构光层析成像的技术。这一技术通过结构光照明到样品后，离焦信息变得模糊，而在焦平面的信息清晰的特点，通过高频信号提取，实现了对荧光样品的层析成像。在先技术三通过多种模式的结构光调制，实现了对样品的超分辨成像。利用变间距空间滤波器，在一套系统中实现多种显微成像模态，在此基础上融合增添了荧光偏振显微成像模态。然而，上述技术只能实现结构光照明层析成像或者结构光照明超分辨成像，无法同时实现对荧光各向异性的探测。

发明内容

本发明的目的是提供一种荧光各项异性探测方法及其探测系统，以解决上述现有技术存在的问题，能够实现对荧光各向异性的探测。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种荧光各项异性探测方法，包括如下步骤：

步骤一，偏振激光入射条纹调制器，经条纹调制器后反射不同衍射级次的光线，不同衍射级次的光线经变间距空间滤波器过滤并调整偏振方向，完成结构光的偏振调制；

步骤二，调制后的不同衍射级次的光线经过二向色镜透射激发光至物镜，进而共轭到物镜后的样本表面发生干涉，由此形成结构光照明光场，同时结构光照明光场照射样本表面发射的荧光信号被物镜获取，荧光信号通过二向色镜反射并经渥拉斯顿偏振棱镜后产生方向正交的两束偏振荧光信号；两束正交的偏振荧光信号调整到相机成像感光单元上；

步骤三，首先利用条纹调制器调制第一图案，经步骤一偏振调制垂直方向结构光，经步骤二使用垂直偏振激发样本表面产生荧光信号，采集并观察荧光信号的垂直荧光强度和水平荧光强度；再利用条纹调制器调制第二图案，重复步骤一偏振调制水平方向结构光，重复步骤二使用水平偏振激发样本表面产生荧光信号，采集并观察荧光信号的垂直荧光强度和水平荧光强度；结合第一图案和第二图案测得的荧光强度数据，得到样本荧光各向异性参数。

可选的，步骤一中，偏振激光由偏振激光发射器发出，其中经过扩束透镜组的第一聚焦透镜对光束进行聚焦，出射后经第二聚焦透镜对光线进行准直扩束，准直扩束后的偏振激光再经过偏振分束器、半波片后入射所述条纹调制器。

可选的，步骤一中，经条纹调制器反射三组不同级次的衍射光线；三组衍射光线再次经过半波片至偏振分束器，增加衍射光线中±1级光与零级光的光强占比；衍射光线经偏振分束器后，经透镜将聚焦在变间距空间滤波器上；变间距空间滤波器过滤后保留±1级光，利用分区半波片调整±1级衍射光的偏振方向，使一对±1级光的偏振方向正交于±1级光的衍射光点的连线方向，进而完成结构光的偏振调制。

可选的，步骤二中，荧光信号通过二向色镜反射后通过发射滤光片过滤，过滤后的荧光信号通过管透镜后经过渥拉斯顿偏振棱镜，经过渥拉斯顿偏振棱镜后产生方向正交的两束偏振荧光信号；再利用光束调节面镜组将分为两束正交的偏振荧光信号调整到相机成像感光单元上，同时采集两个正交方向的偏振荧光信号。

可选的，步骤三中，调制第一图案I

荧光偏振参数表示为：

荧光辐射有一个垂直偏振激发和两个相同的水平分量，因此总的荧光强度表示为：

I

荧光各向异性表示如下：

引入一个参数Λ

调制第二图案I

所计算的参数r即探测所得的样本荧光各向异性结果。

本发明还提供一种荧光各项异性探测系统，包括偏振激光发射器，其用于发射偏振激光，所述偏振激光发射器一端同轴布置有准直扩束透镜组，所述准直扩束透镜组末端设有偏振分束器，偏振分束器是为了将扩束光线导通至条纹调制器，并将条纹调制器反射的不同衍射级次的光线导通至变间距空间滤波器；所述偏振分束器一端设有同轴布置的第一半波片和条纹调制器，另一端设置有透镜，所述透镜末端设有同轴布置的变间距空间滤波器、分区半波片和中继透镜，偏振激光由偏振激光发射器发出，其中经过扩束透镜组的第一聚焦透镜对光束进行聚焦，出射后至第二聚焦透镜，第二聚焦透镜对光线进行准直扩束。扩束激光再经过偏振分束器、第一半波片到条纹调制器，激光经过条纹调制器反射后，光束中包含了三组不同级次的衍射光线。三组衍射光线将再次经过第一半波片至偏振分束器，第一半波片用于调整光束的偏振方向，条纹调制器反射的光束两次通过第一半波片调整偏振方向。此外，经过变间距空间滤波器后的±1级光利用分区半波片调整偏振方向。通过调节第一半波片快轴方向，来调节偏振方向，从而增加衍射光中±1级光与零级光的光强占比，光束经偏振分束器后，利用透镜可以将光束聚焦在变间距空间滤波器上。变间距空间滤波器只保留±1级衍射光，将其余级次的衍射光滤掉。利用分区半波片调整±1级衍射光的偏振方向，使一对±1级光的偏振方向正交于±1级光的衍射光点的连线方向，进而完成结构光的偏振调制；所述中继透镜末端依次设有二向色镜、物镜和样本；所述二向色镜一侧设有发射滤光片，所述发射滤光片的轴线与所述物镜的轴线垂直，所述发射滤光片末端同轴布置有第二半波片、管透镜、渥拉斯顿偏振棱镜；渥拉斯顿偏振棱镜末端设有光束调节面镜组，光束调节面镜组末端设有相机；经过结构光偏振调制模块调制的±1级衍射光经过中继透镜，由二向色镜透射激发光至物镜，进而将变间距空间滤波器上的±1级衍射光点可以共轭到物镜的后焦面上。±1级衍射光经过物镜后变为平行光，因此照射到样本表面发生干涉，由此形成结构光照明光场。同时结构光照明光场照射样品面发射的荧光信号被物镜获取，荧光信号通过二向色镜反射后通过发射滤光片，可以过滤掉散光以及其他波段的发射光。过滤后的荧光信号通过管透镜后经过渥拉斯顿偏振棱镜，经过渥拉斯顿偏振棱镜后将产生方向正交的两束偏振荧光信号。再利用光束调节面镜组将分为两束正交的偏振荧光信号调整到相机成像感光单元上，即相机可以同时采集两个正交方向的荧光偏振信号。

可选的，所述条纹调制器上加载有等间距的黑白条纹，能够对光的振幅产生空间调制，并生成不同衍射级次光束；条纹调制器可以是液晶空间光调制器，也可以说是数字微镜阵列或者是机械光栅。作为一种波前调制器件，条纹调制器在本系统中作为衍射光栅使用。通过在条纹调制器上加载等间距的黑白条纹，对光的振幅产生空间调制。当偏振光投射至条纹调制器后，在黑白条纹产生的光栅作用下，生成不同衍射级次光束。

可选的，所述变间距空间滤波器包括不透明的基板，所述基板上开设有两个通光孔；所述通光孔位于结构光照明共聚焦显微成像的±1级光的位置；中继透镜由两个透镜组成，中继透镜放置在分区半波片后端。利用两个透镜将衍射光线共轭到物镜后的聚焦平面上，平行的两束衍射光线，在经过物镜后仍为平行光。

可选的，二向色镜在本系统中位于中继透镜后端，平行光束通过二向色镜透射至物镜，在聚焦面形成干涉，之后激发荧光经过二向色镜反射至发射滤光片。二向色镜有短波通和长波通两种类型，其中短波通二向色镜能够反射设定的短波长范围的光线，透射设定的长波长范围的光线。长波通二向色镜能够反射设定的长波长范围的光线，透射设定的短波长范围的光线；所述渥拉斯顿偏振棱镜能够将入射的荧光信号产生两束彼此分开且振动方向互相垂直的线偏振光，本发明中激发荧光经过发射滤光片、管透镜到达渥拉斯顿偏振棱镜，之后分解为偏振方向相互正交的两束偏振光；所述光束调节面镜组包括四个平面镜；能够将两束线偏振光以任意角度反射到相机的感光单元。

本发明相对于现有技术取得了以下技术效果：

本发明的荧光各项异性探测方法，利用条纹调制器生成多级次衍射光束，利用变间距空间滤波器获取可发生干涉的±1级衍射光。设计荧光探测模块，利用偏振分光器件进行分光，在相机靶面上同时探测两个正交方向的偏振荧光图像，本发明相机不做具体限制，优选为CCD相机，也可以采用其他由像素构成的二维探测器，例如CMOS相机等。由于照明条纹的偏振方向与条纹方向一致，在偏振分光后的相机上，能够同时探测垂直荧光强度I

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明荧光各项异性探测系统布置示意图；

图2为本发明的垂直方向的条纹调制器产生的偏振荧光激发图案示意图；

图3为本发明的垂直方向的条纹调制器产生的偏振荧光CCD相机采集图案示意图；

图4为本发明水平方向的条纹调制器产生的偏振荧光激发图案示意图；

图5为本发明水平方向的条纹调制器产生的偏振荧光CCD相机采集图案示意图；

附图标记说明：1-偏振激光发射器，2-准直扩束透镜组，3-偏振分束器，4-第一半波片，5-条纹调制器，6-透镜，7-变间距空间滤波器，8-分区半波片，9-中继透镜，10-物镜，11-二向色镜，12-发射滤光片，13-第二半波片，14-管透镜，15-渥拉斯顿偏振棱镜，16-光束调节面镜组，17-CCD相机，18-样本，19-反射镜。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的目的是提供一种荧光各项异性探测方法及其探测系统，以解决上述现有技术存在的问题，能够实现对荧光各向异性的探测。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

如图1所示，本发明提供一种荧光各项异性探测系统，包括偏振激光发射器1，其用于发射偏振激光，偏振激光发射器1一端同轴布置有准直扩束透镜组2，准直扩束透镜组2末端设有反射镜19，反射镜19的出射端设有偏振分束器3；偏振分束器3一端设有同轴布置的第一半波片4和条纹调制器5，另一端设置有透镜6，透镜6末端设有两个对称布置的反射镜19，对称布置的反射镜19末端设有同轴布置的变间距空间滤波器7、分区半波片8和中继透镜9；中继透镜9末端依次设有二向色镜11、物镜10和样本18；二向色镜11一侧设有发射滤光片12，发射滤光片12的轴线与物镜10的轴线垂直，发射滤光片12末端同轴布置有第二半波片13、管透镜14、渥拉斯顿偏振棱镜15；渥拉斯顿偏振棱镜15末端设有光束调节面镜组16，光束调节面镜组16末端设有CCD相机17，光束调节面镜组16包括四个平面镜；能够将两束线偏振光以任意角度反射到CCD相机17的感光单元；本发明所说的CCD相机17指的是由二维像素组成的成像探测器件，也可以是CMOS、sCMOS等其他类型，不改变本发明的实质内容。

如图2、图3、图4和图5所示，为垂直方向与水平方向的条纹调制器产生的偏振荧光激发图案与相应的CCD相机17采集图案。

其中垂直方向的条纹调制器5调制图案为I

本发明提出基于结构光照明的荧光各项异性探测方法，该方法包括以下步骤：

步骤一，结构光偏振调制

偏振激光由偏振激光发射器1发出，通过准直扩束透镜组2，其中经过准直扩束透镜组2的第一聚焦透镜对光束进行聚焦，出射后至第二聚焦透镜，第二聚焦透镜对光线进行准直扩束。扩束激光再经过偏振分束器3、第一半波片4到条纹调制器5。通过在条纹调制器5上加载等间距的黑白条纹，以及改变黑白条纹的位置，将条纹调制器5作为衍射光栅。扩束激光经过条纹调制器5可以得到相位不同的结构光光场衍射条纹。本系统中，条纹调制器5反射后的光束包含不同衍射级次的光线，再次经过第一半波片4至偏振分束器3，通过调节第一半波片4快轴方向，来调节偏振方向，从而增加衍射光中±1级光与零级光的光强占比。光束经偏振分束器3后，利用透镜6可以将光束聚焦在变间距空间滤波器7上。变间距空间滤波器7只保留±1级衍射光，将其余级次的衍射光滤掉。利用分区半波片8调整±1级衍射光的偏振方向，使一对±1级光的偏振方向正交于±1级光的衍射光点的连线方向，进而完成结构光的偏振调制。

步骤二，偏振荧光信号感知

调制的±1级衍射光经过中继透镜9，±1级衍射光经过二向色镜11透射激发光至物镜10，进而将变间距空间滤波器7上的±1级衍射光点可以共轭到物镜10的后焦面上。±1级衍射光经过物镜10后变为平行光，因此照射到样本18表面发生干涉，由此形成结构光照明光场。同时结构光照明光场照射样本18面发射的荧光信号被物镜获取，荧光信号通过二向色镜11反射后通过发射滤光片12，可以过滤掉散光以及其他波段的发射光。过滤后的荧光信号通过管透镜14后经过渥拉斯顿偏振棱镜15，经过渥拉斯顿偏振棱镜15后将产生方向正交的两束偏振荧光信号。再利用光束调节面镜组16将分为两束正交的偏振荧光信号调整到CCD相机17成像感光单元上，即CCD相机17可以同时采集两个正交方向的偏振荧光信号。

步骤三，荧光各向异性探测

首先利用条纹调制器5调制图案I

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“顶”、“底”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“笫二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

本发明中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。