一种载抗菌肽多功能凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种载抗菌肽多功能凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

皮肤是人体最大的器官及最重要的天然屏障，其完整性遭到破坏形成创面后会导致体液丢失、电解质紊乱及内脏损害等并发症，严重者甚至危及生命。正常情况下，皮肤创面经过止血期、炎症期、增生期及重塑期四个阶段后会趋于愈合。然而，由于过去几十年来抗生素的不当使用，皮肤创面多重耐药(MDR)细菌的感染日益增加，导致创面不愈合发生率呈显著上升趋势。世界卫生组织（WHO）指出多重耐药菌感染已成为21世纪人类健康的主要威胁之一，而且当前的抗菌疗法不足以应对这一挑战，因此迫切需要研发新型抗生素的替代品。

除了耐药菌本身直接造成的组织和细胞损坏外，感染创面微环境还会出现过度的炎症反应和氧化应激，严重损害创面的再上皮化和血管生成。另一方面，高水平的炎症反应和氧化应激会导致细胞外基质(ECM)的降解，为细菌生长提供了温床，加重创面感染，从而形成恶性循环，使创面难以愈合。作为创面核心免疫细胞的巨噬细胞可表现为M1促炎和M2抗炎两种表型，前者主要表达炎性因子TNF-α和IL-6，后者表达促愈合因子IL-10、VEGF和TGF-β。越来越多的研究证明，巨噬细胞从M1型到M2型的表型调节可以通过降低炎症水平、促进肉芽组织的再生和血管化来有效促进创面愈合。然而，感染创面微环境由于过度的炎症反应和氧化应激，抑制了巨噬细胞从M1型向M2型极化。因此，除了抗菌之外，创面微环境的调控和改善也应该引起重视。

目前，新型抗菌材料的研发主要集中于金属纳米材料和抗菌肽(AMPs)两类。金属纳米材料依靠释放离子或产生光热来有效杀死细菌。然而，金属离子对组织的潜在毒性和光热治疗(>50℃)对正常组织不可避免的损伤引起了公众越来越多的警惕。相比之下，作为一种天然免疫防御物质，抗菌肽受到了越来越广泛的关注。它具有强效的广谱抗菌活性，对真核生物的毒性较低，且几乎不诱导耐药菌的形成，但抗菌肽在病理生理条件下极易降解而失去活性，大大限制了其临床应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种载抗菌肽多功能凝胶及其制备方法和应用，以解决现有抗菌肽在病理生理条件下极易降解而失去活性的问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种载抗菌肽多功能凝胶，采用透明质酸（HA）、单宁酸（TA）、抗菌肽和聚乙二醇缩水甘油醚制成。

根据上述技术手段，通过采用透明质酸（HA）、单宁酸（TA）、抗菌肽和聚乙二醇缩水甘油醚制成载抗菌肽多功能凝胶，使得抗菌肽负载到基于透明质酸骨架的冻干凝胶中，不仅有效保证了抗菌肽的稳定性，而且可以在细菌感染微环境中响应性释放抗菌肽快速杀菌，有效解决了现有抗菌肽在病理生理条件下极易降解而失去活性，使其临床应用受限的问题，同时结合单宁酸，使得单宁酸丰富的活性基团与透明质酸及抗菌肽形成网络交联，不但有效提升了冻干凝胶的机械性能，还使之具备了抗炎、抗氧化、免疫调节、渗液吸收、止血等多种生物学功能；本发明制得的载抗菌肽多功能凝胶具有良好的形状记忆功能以及响应性释放抗菌肽的特性，不受携带运输中的物理损毁变形影响，适应创面形状并有效贴合保护，能有效杀灭耐药菌，抑制炎症和氧化应激，并且促进巨噬细胞向M2型转化，从而改善感染创面微环境，促进组织再生和创面愈合，在耐药菌感染创面的治疗方面，具有潜在的应用价值。

其中，经研究发现，冻干凝胶作为一种多孔材料，通常具有良好的柔韧性、吸水性和透气性，是一种优良的载药平台，已广泛应用于创面修复领域。透明质酸(HA)是一种分布在水合组织细胞外基质中的天然线性多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性和强大的保湿能力，并含有丰富的活性基团。此外，透明质酸是一种反应性降解物质，可以被细菌产生的透明质酸酶分解。因此，将抗菌肽负载到基于透明质酸骨架的冻干凝胶中，不但可以保持抗菌肽的稳定性，而且可以在细菌感染微环境中响应性释放抗菌肽快速杀菌。但是，透明质酸冻干凝胶的机械性能较差，难以满足创面治疗的临床需求。天然多酚单宁酸(TA)是抗氧化活性物质的理想候选者，而且它还在一定程度上可以起到抗菌和抗炎的作用。

由于耐药菌感染创面微环境复杂，愈合困难，细菌侵袭生长，炎症反应过度，氧化应激过度，巨噬细胞无法向M2极化，因此单纯的抗菌是不够的。本发明通过智能化设计和联合治疗策略，可以响应性释放抗菌肽，快速高效杀菌，同时凝胶的各核心成分协同发挥作用，除了抗感染还能抗炎、抗氧化、免疫调节，吸收渗液、止血等，多种功能一起有效地促进了耐药菌感染创面愈合。

优选的，所述透明质酸、单宁酸、抗菌肽和聚乙二醇缩水甘油醚按g：g：g：mL计为2：0.2：0.2：0.5。

优选的，所述抗菌肽选自抗菌肽KR-12。

通过采用抗菌肽KR-12作为抗菌肽，有效实现了对包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在内的多种细菌的杀灭，从而有效减轻创面炎症并且促进创面再上皮化。

其中，抗菌肽KR-12的氨基酸序列为CKRIVKRIKKWLR，该序列是一种缘于人源抗菌肽LL-37的生物活性片段。该抗菌肽KR-12具有较广谱的抗菌能力，毒性小。

优选的，所述单宁酸为天然多酚单宁酸。

本发明还提供一种如本发明所述的载抗菌肽多功能凝胶的制备方法，包括以下步骤：

S1、将聚乙二醇缩水甘油醚加入透明质酸溶液中，室温下搅拌6~24h，获得混合溶液；

S2、向混合溶液中依次加入单宁酸和抗菌肽，室温下搅拌6~24h，获得反应溶液；

S3、将反应溶液冷冻干燥，获得载抗菌肽多功能冻干凝胶。

优选的，所述透明质酸溶液中透明质酸的质量浓度为0.5~4%。

优选的，所述透明质酸溶液中透明质酸的质量浓度为2%。

优选的，所述混合溶液中聚乙二醇缩水甘油醚的体积浓度为0.1~1%。

优选的，所述混合溶液中聚乙二醇缩水甘油醚的体积浓度为0.5%。

优选的，所述反应溶液中单宁酸的质量浓度为0.1~1%。

优选的，所述反应溶液中单宁酸的质量浓度为0.2%。

优选的，所述反应溶液中抗菌肽的浓度为1~4mg/mL。

优选的，所述反应溶液中抗菌肽的浓度为2mg/mL。

优选的，所述S1和S2中，室温下搅拌均为12h。

优选的，所述冷冻干燥的温度为-80℃，冷冻干燥的时间为12~24h。

优选的，所述冷冻干燥的时间为24h。

本发明还提供一种如本发明所述的载抗菌肽多功能凝胶的应用，所述载抗菌肽多功能凝胶应用于杀灭耐药菌的药物中。

其中，耐药菌包括耐药铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等。

本发明的有益效果：

本发明的载抗菌肽多功能凝胶，通过采用透明质酸（HA）、单宁酸（TA）、抗菌肽和聚乙二醇缩水甘油醚制成载抗菌肽多功能凝胶，使得抗菌肽负载到基于透明质酸骨架的冻干凝胶中，不仅有效保证了抗菌肽的稳定性，而且可以在细菌感染微环境中响应性释放抗菌肽快速杀菌，有效解决了现有抗菌肽在病理生理条件下极易降解而失去活性，使其临床应用受限的问题；同时结合单宁酸，使得单宁酸丰富的活性基团与透明质酸及抗菌肽形成网络交联，不但有效提升了冻干凝胶的机械性能，还使之具备了抗炎、抗氧化、免疫调节、渗液吸收、止血等多种生物学功能；本发明中的核心成分透明质酸、单宁酸及抗菌肽均为天然生物成分，生物相容性较好，适用于临床实际应用。本发明制得的载抗菌肽多功能凝胶具有良好的形状记忆功能以及响应性释放抗菌肽的特性，不受携带运输中的物理损毁变形影响，适应创面形状并有效贴合保护，能有效杀灭耐药菌，抑制炎症和氧化应激，并且促进巨噬细胞向M2型转化，从而改善感染创面微环境，促进组织再生和创面愈合，在耐药菌感染创面的治疗方面，相比于既往单一功能敷料，具有更佳的临床应用价值；

本发明的载抗菌肽多功能凝胶的制备方法，通过采用将聚乙二醇缩水甘油醚加入透明质酸中，然后加入单宁酸和抗菌肽，室温下搅拌反应后冷冻干燥即可，无需严苛的条件限制，具有制备工艺简单、可操作性强和适合规模化大批量生产的优点，在医药技术领域具有推广应用价值。

附图说明

图1为本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）的扫描电镜图；

图2为本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）的机械性能及形状记忆功能的测试结果图；

图3为细菌菌落数目的实物图；

图4为细菌存活率的结果对比图；

图5为抗菌肽KR-12响应性释放测试的结果图；

图6为细胞活性的测试结果图；

图7为自由基清除率的测试结果图；

图8为ROS阳性细胞比例的测试结果图；

图9为扫描显微镜下的实物结果图（9A）和巨噬细胞M1型分子标志和M2型分子标志的比例结果图（9B）；

图10为抗炎测试结果图；

图11为止血测试结果图；

图12为未愈合创面面积的结果图；

图13为耐药菌感染创面再上皮化、肉芽组织形成及炎症细胞浸润的试验结果图；

图14为耐药菌感染创面细胞增殖、血管化及炎症因子的试验结果图。

具体实施方式

以下将参照附图和优选实施例来说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书中所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。

需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。

实施例1

一种载抗菌肽多功能凝胶的制备方法，包括以下步骤：

S1、将透明质酸（HA）加入去离子水中，在60℃的条件下，用磁力搅拌器搅拌使其充分溶解，使得透明质酸溶液中透明质酸的质量浓度为2% (w/v)，将聚乙二醇缩水甘油醚加入透明质酸溶液中，然后在室温下搅拌12h，获得混合溶液，混合溶液中聚乙二醇缩水甘油醚浓度为0.5% (v/v)；

S2、向混合溶液中依次加入天然多酚单宁酸（TA）和抗菌肽KR-12（KR），然后在室温下搅拌12h，获得反应溶液，反应溶液中单宁酸的质量浓度为0.2% (w/v)，抗菌肽KR-12的浓度为2mg/mL；

S3、将反应溶液加入到模具中（100μL/孔），在-80℃的条件下冷冻干燥24h，获得载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）。

实施例2

S1、将透明质酸（HA）加入去离子水中，在60℃的条件下，用磁力搅拌器搅拌使其充分溶解，使得透明质酸溶液中透明质酸的质量浓度为2% (w/v)，将聚乙二醇缩水甘油醚加入透明质酸溶液中，然后在室温下搅拌12h，获得混合溶液，混合溶液中聚乙二醇缩水甘油醚浓度为0.25% (v/v)；

S2、向混合溶液中依次加入天然多酚单宁酸（TA）和抗菌肽KR-12（KR），然后在室温下搅拌12h，获得反应溶液，反应溶液中单宁酸的质量浓度为0.1% (w/v)，抗菌肽KR-12的浓度为1mg/mL；

S3、将反应溶液加入到模具中（100μL/孔），在-80℃的条件下冷冻干燥24h，获得载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）。

实施例3

S1、将透明质酸（HA）加入去离子水中，在60℃的条件下，用磁力搅拌器搅拌使其充分溶解，使得透明质酸溶液中透明质酸的质量浓度为2% (w/v)，将聚乙二醇缩水甘油醚加入透明质酸溶液中，然后在室温下搅拌12h，获得混合溶液，混合溶液中聚乙二醇缩水甘油醚浓度为0.75% (v/v)；

S2、向混合溶液中依次加入天然多酚单宁酸（TA）和抗菌肽KR-12（KR），然后在室温下搅拌12h，获得反应溶液，反应溶液中单宁酸的质量浓度为0.5% (w/v)，抗菌肽KR-12的浓度为4mg/mL；

S3、将反应溶液加入到模具中（100μL/孔），在-80℃的条件下冷冻干燥24h，获得载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）。

检测分析

1）扫描电镜分析

将实施例1中制得的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）进行扫描电镜分析，观察其微观结构，结果如图1所示。

从图1中观察可知，载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）呈现淡黄色海绵状，微观下呈多孔结构。

2）孔径测试

采用Image J软件对实施例1中制得的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）进行测试，测得载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）的孔径为32.0±7.5μm，平均孔径为32.0μm，孔隙率为69.4±0.8%，平均孔隙率为69.4%。孔径测试结果和扫描电镜分析结果进证明了本发明制得的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）具备良好的透气透水性能，可适用于创面治疗。

3）机械性能及形状记忆功能测试

将实施例1中制得的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）裁减为不同形状，经过折叠按压后，将其置于去离子水中，15秒后取出，并拍照处理，结果如图2所示。

从图2中观察分析可知，载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）折叠按压后，未出现破裂和粉碎，从而证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）具备良好的柔韧性；将其吸水后再次观察，可以看到冻干凝胶恢复了原来的形状，从而证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）具备良好的形状记忆功能。上述结果证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）可便于携带运输，且能维持良好的机械性能，有效覆盖保护创面。

4）溶胀性能测试

将实施例1中制得的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）分成多块，将每块冻干凝胶称重并记录为M0，分别置于磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）溶液中，常温下反应30分钟；取出冻干凝胶，轻轻置于滤纸片表面去除多余水分，称重并记录为M1，实验重复3组样品。溶胀率按以下公式进行计算：溶胀率%=(M1-M0)/M0×100%。计算结果为：载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）的溶胀率为1929.8±124.1%，平均溶胀率为1929.8%，从而证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）的表面具备强大的吸收渗液能力，有助于创面止血及渗液管控。

5）抗菌性能测试

具有包括以下步骤：将对数期的大肠埃希菌（E.coli）、耐药铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌液用PBS溶液稀释至浓度为5ⅹ10

图3为各平板表面生长细菌菌落数目的实物图，图4为细菌存活率的对比图，从图3和图4综合分析可知，HA/TA/KR组的细菌数量显著少于对照组，且细菌存活率均在10%以下，从而证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）对三种细菌均有良好的杀灭作用，具备优良的抗菌性能。

6）响应性释放测试

具有包括以下步骤：将对数期的耐药铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌液用PBS溶液稀释至浓度为5ⅹ10

从图5中分析可知，实验组（细菌+HA/TA/KR），即与细菌共反应的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）中抗菌肽KR-12的释放量明显高于对照组（HA/TA/KR），从而证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）可以在细菌感染处响应性释放抗菌肽KR-12，快速杀灭细菌，而当细菌清除后则可以减少释放，以有效减轻抗菌肽KR-12潜在的副作用。

7）细胞活性测试

将HaCaT细胞以含10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养，调至密度为20000个/孔并接种至24孔板，实验组（HA/TA/KR）：将实施例1中制得的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）放置于tranwell小室中，与细胞在37℃条件下共培养，对照组：transwell小室中不加任何材料，与细胞在37℃条件下共培养，空白组：不含细胞的纯培养液。在培养后第1天、第3天、第5天，弃去原培养基，加入含10%CCK-8试剂的新鲜培养基，在温度为37℃的条件下孵育2h后，取100μL反应后溶液加入96孔板中，用酶标仪检测溶液在450nm波长处的吸光度，计算HA/TA/KR组的细胞活性，计算公式为：（HA/TA/KR组吸光度—空白组吸光度）/ （对照组吸光度—空白组吸光度）ⅹ100%，根据计算结果绘制柱状图，结果如图6所示（“*”代表P<0.05，“**” 代表P<0.01）。

从图6中分析可知，在接种后的第1天、第3天和第5天，实验组（HA/TA/KR）的细胞活性均显著高于对照组，从而证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）不但具备良好的细胞相容性，而且能促进HaCaT细胞增殖，进而证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）用于处理创面有利于创面再上皮化及快速愈合。

8）抗氧化活性测试

8.1游离自由基清除试验

将1块实施例1中制得的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）研磨粉碎后，实验组：凝胶分别与400μL的1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH自由基）和2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-3-氧代-1-氧（PTIO自由基）在室温下共培养60分钟。对照组：加入等体积的PBS溶液；然后将反应溶液在3000rpm条件下离心5分钟，取100μL上清液加入96孔板中，用酶标仪检测溶液在517nm（DPPH自由基）和557nm（PTIO自由基）波长处的吸光度。自由基清除率计算公式为：（对照组吸光度—HA/TA/KR吸光度）/ 对照组吸光度，结果如图7所示。

从图7中可知，载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）对DPPH自由基和PTIO自由基的清除率均在在70%以上，从而证明本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）具备良好的自由基清除作用。

8.2细胞活性氧自由基清除试验

从小鼠股骨中提取原代骨髓来源巨噬细胞，用含10%胎牛血清和20ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的RPMI1640培养基培养。实验组（HA/TA/KR）：将细胞调至密度为5×10

从图8中分析可知，与对照组相比，实验组（HA/TA/KR）中ROS阳性细胞比例显著降低，从而证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）可以有效清除细胞ROS，具备优良的抗氧化作用。

9）巨噬细胞表型调控及抗炎作用测试

9.1巨噬细胞表型调控试验

从小鼠股骨中提取原代骨髓来源巨噬细胞，将骨髓来源巨噬细胞接种至6孔板爬片表面，加入终浓度为200 ng/mL 的脂多糖和 20 ng/mL 的IFN-γ共刺激24小时。实验组（HA/TA/KR）：在每孔transwell小室中放入4块实施例1中制得的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）与刺激后细胞在37℃孵箱共培养24小时，对照组：transwell小室中不加任何材料。收集反应后细胞，加入4%多聚甲醛固定30分钟后，PBS清洗3遍；然后加入兔来源CD206抗体（终浓度1:500）和小鼠来源CD86抗体（终浓度1:500），4℃反应过夜；弃去抗体溶液，PBS清洗3遍，加入Cy3标记山羊抗兔IgG二抗（终浓度1:800）和FITC标记山羊抗小鼠IgG二抗（终浓度1:800），37℃孵育1小时；弃去二抗溶液，PBS清洗3遍，加入含荧光淬灭剂细胞核染液DAPI染色15分钟；最后将细胞置于共聚焦激光扫描显微镜下观察，绿色荧光代表CD86，红色荧光代表CD206，蓝色荧光代表细胞核；采用Image J软件测量各组荧光强度，结果如图9所示（“*”代表P<0.05，“**” 代表P<0.01）。

图9A为共聚焦激光扫描显微镜下的结果图，图9B为巨噬细胞M1型分子和M2型分子的比例结果图，从图9A和图9B综合分析可知，与对照组相比，实验组（HA/TA/KR）细胞中巨噬细胞M2型分子标志CD206表达量显著升高，而M1型分子标志CD86则显著降低，从而证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）可以促进巨噬细胞向M2型转化，进而抑制炎症，促进增殖及血管化。

9.2抗炎作用测试

从小鼠股骨中提取原代骨髓来源巨噬细胞，将骨髓来源巨噬细胞接种至6孔板爬片表面，加入终浓度为200 ng/mL 的脂多糖和 20 ng/mL 的IFN-γ共刺激24小时。实验组（HA/TA/KR）：在每孔transwell小室中放入4块实施例1中制得的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）与刺激后细胞在37℃孵箱共培养24小时，对照组：transwell小室中不加任何材料。收集反应后细胞的上清液，采用酶联免疫吸附试验（Elisa）检测炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素6（IL-6）及抑炎因子白介素10（IL-10）表达量，结果如图10所示（“*”代表P<0.05，“**” 代表P<0.01）。

从图10中分析可知，与对照组相比，实验组（HA/TA/KR）的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素6（IL-6）的表达水平显著降低，而抑炎因子白介素10（IL-10）的表达水平显著增高，从而证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）可以有效抑制炎症因子表达而促进抑炎因子表达，从而发挥抗炎作用。

10）止血性能测试

采用大鼠肝脏及鼠尾出血模型进行检测。将SD大鼠随机分为对照组和实验组，对照组采用纱布止血，实验组采用实施例1中制得的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）止血。

肝脏止血实验：取一圆形滤纸片，称重并记录其重量M0。将大鼠用1%戊巴比妥钠麻醉后固定于动物实验手术台上，小心切开腹部皮肤及皮下组织等，将肝脏显露并于其下方垫上前述已称重滤纸片，用针头于肝脏表面做一线性切口，先让其自然出血3秒后，迅速分别将纱布和实施例1中制得的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）覆盖于切口，记录至出血完全停止时间t。将滤纸片小心抽出并再次称重M1。失血量计算公式为M= M1- M0，结果如图11A所示（“*”代表P<0.05，“**” 代表P<0.01）。

鼠尾止血实验：如上所述，准备滤纸片并将大鼠麻醉后固定于手术台，将前述已称重滤纸片垫于大鼠鼠尾下方，于距鼠尾末端3cm处切断，自然出血10秒后，迅速分别将纱布和实施例1中制得的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）覆盖于切口，记录至出血完全停止时间t。将滤纸片小心抽出并再次称重。失血量计算公式为M= M1- M0，结果如图11B所示（“*”代表P<0.05，“**” 代表P<0.01）。

图11中，图11A为肝脏止血试验图片、失血量和止血时间结果图，图11B为鼠尾止血试验图片、失血量和止血时间结果图，从图11A和图11B综合分析可知，与对照组纱布止血相比，实验组采用本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）止血后无论是肝脏出血量还是鼠尾出血量均显著减少，同时，止血时间显著缩短，从而证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）具备良好的止血性能。

11）耐药菌感染创面愈合测试

11.1耐药菌感染创面愈合速度试验

具体步骤为：

（1）BALB/C小鼠耐药菌感染创面模型的制备：将小鼠用1%戊巴比妥钠腹腔注射(100mg/kg，0.01ml/g)麻醉，然后予以背部皮肤脱毛备皮处理。背部术区予以75%乙醇棉球消毒后，用打孔器于背部两侧各造一直径为6mm的全层皮肤缺损创面，立即对创面进行拍照记录，该创面面积记录为初始创面面积A0，日期为第0天。将10μL对数期耐药P. aeruginosa菌液（1ⅹ10

（2）术后于第2天、第4天、第6天打开创面拍照记录，观察创面愈合情况，并更换敷料；小鼠于第8天拍照后采用断颈法处死，并且取创面组织进行石蜡包埋切片及H&E染色；

（3）采用Image J软件对第2天、第4天、第6天和第8天各组创面照片进行分析，测量每个时间点剩余创面面积An，即创缘所包围的面积，并按下式计算未愈合创面面积%：未愈合创面面积%=An/A0ⅹ100%；

（4）采用非配对t检验分别对第2天、第4天、第6天和第8天两组未愈合创面面积进行统计学分析，结果如图12所示（“*”代表P<0.05，“**” 代表P<0.01）。

从图12中分析可知，实验组（HA/TA/KR）采用载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）处理后创面未出现明显红肿、脓性渗出等感染征象，且统计学分析结果显示实验组（HA/TA/KR）在第4天、第6天和第8天的未愈合创面面积均显著低于对照组，从而证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）可以有效清除小鼠创面耐药P. aeruginosa细菌，防治创面感染，促进创面愈合。

11.2耐药菌感染创面再上皮化、肉芽组织形成及炎症细胞浸润的试验

如上所述，将第8天H&E染色切片进行组织学分析，采用Image J软件测量新生上皮长度、肉芽组织厚度及创缘炎性细胞数目。采用非配对t检验进行统计学分析，结果如图13所示（“*”代表P<0.05，“**” 代表P<0.01）。

从图13中分析可知，与对照组相比，实验组（HA/TA/KR）新生上皮长度及肉芽组织厚度均显著增高，从而证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）可以促进小鼠感染创面的再上皮化和肉芽组织生成。同时，实验组（HA/TA/KR）创面的炎性细胞数目也显著低于对照组，从而证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）有效抑制了创面过度炎症反应，防止了对组织的损伤。上述结果有效证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）能在体内防治细菌感染，维持良好的创面微环境以利于组织再生。

11.3耐药菌感染创面细胞增殖、血管化及炎症因子的试验

如上所述，将第8天创面组织切片进行免疫组织化学染色，并进行拍照和组织学分析，结果如图14所示。

从图14中分析可知，与对照组相比，实验组（HA/TA/KR）创面细胞增殖分子标志增殖细胞核抗原（PCNA）和血管化分子标志血小板内皮细胞黏附分子（CD31）阳性表达量（红色箭头指示）明显多于对照组，从而证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）可以促进小鼠感染创面细胞的增殖以及血管化，进而促进新生上皮及肉芽组织生长，最终加速创面愈合。同时，实验组（HA/TA/KR）创面中炎症因子TNF-α和IL-6阳性表达量均明显少于对照组，而抑炎因子IL-10的阳性表达量则多于对照组，与上述11.2中的结果一致，从而进一步证明了本发明的载抗菌肽多功能冻干凝胶（HA/TA/KR）可以抑制感染创面过度的炎症反应，维持创面良好的微环境并促进组织再生。

综上所述，本发明的载抗菌肽多功能凝胶，通过采用透明质酸（HA）、单宁酸（TA）、抗菌肽和聚乙二醇缩水甘油醚制成载抗菌肽多功能凝胶，使得抗菌肽负载到基于透明质酸骨架的冻干凝胶中，不仅有效保证了抗菌肽的稳定性，而且可以在细菌感染微环境中响应性释放抗菌肽快速杀菌，有效解决了现有抗菌肽在病理生理条件下极易降解而失去活性，使其临床应用受限的问题，同时结合单宁酸，使得单宁酸丰富的活性基团与透明质酸及抗菌肽形成网络交联，不但有效提升了冻干凝胶的机械性能，还使之具备了抗炎、抗氧化、免疫调节、渗液吸收、止血等多种生物学功能；本发明制得的载抗菌肽多功能凝胶具有良好的形状记忆功能以及响应性释放抗菌肽的特性，不受携带运输中的物理损毁变形影响，适应创面形状并有效贴合保护，能有效杀灭耐药菌，抑制炎症和氧化应激，并且促进巨噬细胞向M2型转化，从而改善感染创面微环境，促进组织再生和创面愈合，在耐药菌感染创面的治疗方面，具有潜在的应用价值。

本发明的载抗菌肽多功能凝胶的制备方法，通过采用将聚乙二醇缩水甘油醚加入透明质酸中，然后加入单宁酸和抗菌肽，室温下搅拌反应后冷冻干燥即可，无需严苛的条件限制，具有制备工艺简单、可操作性强和适合规模化大批量生产的优点，在医药技术领域具有推广应用价值。

以上实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。