一种高浓度页岩气油基钻屑高效降解菌株的筛选及其应用

技术领域

本发明涉及含油固体废弃物微生物降解处理技术领域，具体涉及一种高浓度页岩气油基钻屑高效降解菌株的筛选及其应用。

背景技术

近年来，我国页岩气勘探开发行业蓬勃发展，中国页岩气可采资源量达36万亿m3。页岩气因地质储层复杂、开发难度大，钻井过程中需使用具有抗高温、抗盐钙侵蚀、润滑性好的油基钻井液，由此产生大量的油基岩屑。油基钻屑含有大量烷烃、多环芳烃、苯系物和烯烃等石油烃类污染物，被列为H08类危险废物。油基钻屑对生态环境的毒害形式主要分为三类：一是因其粘稠性直接覆盖动植物；二是直接毒害生物体；三是因微生物的好氧降解而导致缺氧环境，因此在其产生、堆放、运输和处理过程中均有可能对当地生态环境和人类健康造成危害。对油基钻屑石油烃污染物的有效处理已成为我国危险废物处理工作的重中之重，也成为我国页岩气开采的严重负担，是当前页岩气开发持续推进必须解决的紧迫问题。

目前，油基岩屑的处理处置技术主要有物理、化学方法，但其存在处理成本高、能耗大、容易引起环境二次污染问题等问题而面临技术革新。而微生物处理主要利用微生物的新陈代谢活动将有毒有害的石油烃污染物分解成二氧化碳和水或转化成无害物质，具有修复成本低、不产生二次环境污染的特点，是一种从根本上消除石油烃污染的资源化利用技术，被认为是处理油基钻屑石油烃污染的理想修复方法，被国内外研究者广泛关注。中国专利CN106801025A公开了一株油基泥浆钻井岩屑降解功能菌及其应用，其公开了一株枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilistrain.)，在优化条件下，能将含油量为0.1％的油基泥浆在30天内的降解率达到46.1％。CN110747141A公开了一株油基钻屑降解菌及其应用，其发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)WJ2019，在45天内对油含量为0.12％的油基钻屑组分降解率可达到48.8％以上。

在以上专利中提供的菌株对油基岩屑具有一定降解效果，但使用范围仅限于经过物理、化学方法进行前期处理后，其含油量降到0.3％及以下的一般固废的生物降解，而对于仅经过预处理回收，油含量在2％-5％的高浓度油基岩屑，目前鲜有生物资源能对其直接降解。因此，亟需开发一种能够对高浓度页岩气油基岩屑具备高效降解效率的生物资源，以实现利用生物技术对油基岩屑实现就地处置。

发明内容

本发明意在提供一种高浓度页岩气油基钻屑高效降解菌株的筛选及其应用，以解决现有技术中针对高浓度油基钻屑降解菌株匮乏的问题，同时解决降解周期长、降解效率低的问题，为油基钻屑污染生物修复技术提供新思路和技术储备。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种高浓度页岩气油基钻屑高效降解菌株，其为红球菌Rhodococcus pedocola UC12，生物保藏编号为CCTCC NO：M 2022453。

另一方面，本技术方案提供一种高浓度页岩气油基钻屑高效降解菌株在页岩气油基钻屑降解中的应用。

优选的，作为一种改进，菌株的16S rDNA序列号如SEQ ID NO.1所示。

优选的，作为一种改进，菌株为革兰氏阳性菌，菌体呈短杆状，菌落呈圆形且边缘呈波形，白色不透明。

优选的，作为一种改进，一种高浓度页岩气油基钻屑高效降解菌株的筛选，包括如下步骤：

步骤一、将页岩气井场采集的油基岩屑分别加入到含油的无机盐培养基、MS培养基，培养，稀释后转入相同培养基，重复操作2次，得到液体培养液；

步骤二、将无机盐培养液和MS培养液混匀，用无菌水梯度稀释后分别涂布于无机盐平板培养基、无机盐+1/10LB平板培养基和MS平板培养基上，划线分离培养，得到油基钻屑高效降解单菌落；

步骤三、挑选上述单菌于1/2MSM+1/2LB培养基中，培养1～5天后离心分离，弃上清液，将收集的细胞用生理盐水洗涤后重悬于生理盐水中，得到培养菌悬液。

优选的，作为一种改进，步骤一中，培养条件为28℃，180rpm的密闭条件下恒温进行，每次培养时间为1-5天。

优选的，作为一种改进，降解菌的接种量为2％。

优选的，作为一种改进，降解体系的pH为6～9，降解体系的盐度为0.1～3％。

优选的，作为一种改进，降解温度为20～40℃，降解体系N/P摩尔比为0.3～10％。

优选的，作为一种改进，可降解的油基岩屑为经过预处理对油进行回收后的样品，含油量为2％-5％。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1.本技术方案提供的油基钻屑高效降解菌株为重庆市某页岩气开采井分离筛选得到的本土菌株，红球菌Rhodococcus pedocola UC12。该菌株可在常温环境条件下以油基岩屑返排油为唯一碳源进行生长代谢，以降解油基钻屑中的石油烃组分。在不添加任何碳源和氮源的基础上，63天内对含油量为5％的油基钻屑降解率可达到72.75％以上。能实现在常规条件下，直接利用本发明的方法对经过回收处理后的，高浓度的油基岩屑实施就地处置，以降低二次转运及其他物理、化学方法处置所带来的二次污染风险。此外，该方法且具有降解效率高、周期短等显著优势，具有很好的开发应用前景。

2.本技术方案提供的油基钻屑高效降解剂，具有制备简单，成本低，对油基钻屑修复效果良好，不造成二次环境污染且能够从源头彻底解决油基钻屑环境污染的问题，工业化应用潜力高，具有较高的经济价值和应用前景，为实现油基岩屑污染生物修复技术产业化提供技术支撑。

附图说明

图1为菌株Rhodococcus pedocola NC-17的菌落形态图；

图2为菌株Rhodococcus pedocola NC-17的系统发育进化树；

图3为菌株Rhodococcus pedocola NC-17在不同pH条件下对柴油降解效果示意图；

图4为菌株Rhodococcus pedocola NC-17在不同盐度条件下对柴油降解效果示意图；

图5为菌株Rhodococcus pedocola NC-17在不同温度条件下对柴油降解效果示意图；

图6为菌株Rhodococcus pedocola NC-17在不同柴油浓度条件下对柴油降解效果示意图；

图7为菌株Rhodococcus pedocola NC-17在不同N/P摩尔比下对柴油降解效果示意图；

图8为菌株Rhodococcus pedocola NC-17的63天降解曲线示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施方式所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1

一种高浓度页岩气油基钻屑高效降解菌株，其为红球菌Rhodococcus pedocolaUC12，菌株编号为Rhodococcus pedocola NC-17，保藏地址中国典型培养物保藏中心，保藏时间2022年4月21日，保藏编号CCTCC NO：M 2022453。其16S rDNA序列号如SEQ ID NO.1所示。

一种高浓度页岩气油基钻屑高效降解菌株的筛选方法，包括如下步骤：

步骤一、将重庆市某页岩气井场采集的油基岩屑分别加入到含油的无机盐培养基、MS培养基，培养，分别稀释10倍后转入相同培养基，重复操作2次，得到液体培养液；本实施例中，培养条件为28℃，180rpm的密闭条件下恒温进行，每次培养时间为1-5天。

步骤二、将同一样品来源的无机盐培养液和MS培养液混匀，用无菌水梯度稀释，取10

步骤三、挑选上述获得菌于1/2MSM+1/2LB培养基中，培养1～5天，5000rpm离心分离，弃上清液，将收集的细胞用生理盐水洗涤3次，最后重悬于生理盐水中，得到培养菌悬液。

培养基成分说明：

1、无机盐培养基：2g/L KH

2、MS培养基：4.4g/L MS，溶解完全后于121℃灭菌20min。

3、1/2MSM+1/2LB培养基：2.2g/L MSM，5g/L蛋白胨，2.5g/L酵母粉，5g/L NaCl，15g/L琼脂，调节pH至7.25，121℃灭菌20min，冷却，倒平板。

4、无机盐+1/10LB平板：2g/L KH

5、无机盐平板(含糖)：2g/L KH

6、MS平板(含糖)：4.4g/L MS，15g/L琼脂，121℃灭菌20min，30ml 50％葡萄糖溶液，混匀，倒平板。

实施例2菌株16S rDNA鉴定

根据通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对菌株NC-17进行PCR扩增。

PCR扩增体系：预混合的PCR反应液(Green Taq Mix)12.5μL，正向引物(27F,10μM)1μL，反向引物(1492R 10μM)1μL，模板(DNA)1μL，无菌水补足至25μL。

PCR反应程序：94℃，5min；30个循环(94℃，30sec；55℃30sec；72℃，2min)；72℃，8min。

获得PCR产物委托上海美吉生物工程有限公司进行测序，所得基因序列通过EzBioCloud数据库进行同源性比较，确定其分类地位。

菌株16S rDNA测序结果如SEQ ID NO.1所示，结果表明其基因序列长度约为1031bp，用MEGA(7.0)中的邻接法(Neighbor-Joining)对其构建系统发育进化树(图2)，表明其与模式菌株Rhodococcus pedocola UC12的同源相似度达到99％。因此，鉴定该菌株为红球菌Rhodococcus pedocola UC12。

实施例3菌株形态学及生理生化鉴定：

形态学鉴定：参照《伯杰细菌鉴定手册》在培养后对平皿上生长的细菌菌落形态进行观察，并对细菌进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌体形态。

革兰氏染色步骤如下：

①取少量菌涂布于载玻片上，风干，快速通过火焰3-5次，进行固定；

②初染：滴加结晶紫溶液覆盖涂布区，染色1min，用水冲洗；

③媒染：滴加碘液覆盖涂布区1min，用水冲洗；

④脱色：倾斜载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出液不现紫色为止，大约30s，随即水洗；

⑤复染：滴加番红溶液覆盖涂布区1min，用水冲洗，待自然干燥，镜检。革兰氏阳性呈紫色，革兰氏阴性呈红色。

经观察其革兰染色呈阳性，菌体呈短杆状，菌落呈圆形，白色不透明，菌落表面较干燥粗糙，边缘呈波形(图1)。

生理生化鉴定：参照《伯杰细菌鉴定手册》中的生理生化鉴定指标，对本发明实施例提供的菌株NC-17进行生理生化鉴定。该菌为好氧细菌，硝酸盐还原实验阳性，柠檬酸利用实验阳性，葡萄糖产酸阳性，淀粉水解实验阴性，明胶液化实验阴性，吲哚实验阴性。

结果表明本发明NC-17菌株在分类学上属于红球菌(Rhodococcus pedocolaUC12)，符合红球菌的形态学和生理生化特征。

实施例4菌株NC-17降解柴油的条件优化

1、pH对菌株降解柴油的影响

实验方法：挑取优势菌落于100ml 1/2MSM+1/2LB培养基中，30℃，180rpm培养1-5天，5000rpm离心5min，用生理盐水洗涤3次，最后重悬于生理盐水并调节OD

实验结果：结果如图3所示，该菌株在pH为6～9范围内，都可高效降解柴油，且降解率先升高后稳定。当pH为8～9时，降解效果最好。

2、盐度对菌株降解柴油的影响

实验方法：挑取优势菌落于100ml 1/2MSM+1/2LB培养基中，30℃，180rpm培养1-5天，5000rpm离心5min，用生理盐水洗涤3次，最后重悬于生理盐水并调节OD

实验结果：结果如图4所示，该菌株在0.1％～3％盐度范围内都可高效降解柴油。当盐度高于0.5％时，降解率随盐度升高而降低。当盐度为0.5％时，该菌株降解柴油的效果最好。

3、温度对菌株降解柴油的影响

实验方法：挑取菌落于100ml 1/2MSM+1/2LB培养基中，30℃，180rpm培养1-5天，5000rpm离心5min，用生理盐水洗涤3次，最后重悬于生理盐水并调节OD

实验结果：结果如图5所示，该菌株在温度为20℃～40℃，柴油降解率先升高再降低。当温度为25℃时，柴油降解效果最好。

4、N/P摩尔比对菌株降解柴油的影响

实验方法：挑取菌落于100ml 1/2MSM+1/2LB培养基中，30℃，180rpm培养1-5天，5000rpm离心5min，用生理盐水洗涤3次，最后重悬于生理盐水并调节OD

实验结果：结果如图7所示，该菌株在N/P摩尔比为0.3～10范围内，降解率先略微增加再降低，降解柴油的最适N/P摩尔比为1。

5、不同柴油浓度对菌株降解柴油的影响

实验方法：挑取菌落于100ml 1/2MSM+1/2LB培养基中，30℃，180rpm培养1-5天，5000rpm离心5min，用生理盐水洗涤3次，最后重悬于生理盐水并调节OD

实验结果：结果如图6所示，柴油降解率随柴油浓度增加而降低，当柴油浓度为6g/L时，菌株降解柴油效果最好。

实施例5降解菌株对油基钻屑的修复效果

实验方法：本发明的降解菌株于1/2MSM+1/2LB培养基培养至生长期，5000rpm离心5min，用生理盐水洗涤3次，最后重悬于生理盐水并调节OD

实验结果：结果如图8所示，随着降解时间的增加，降解体系中油基钻屑含油量明显降低。且63天基本达到最高降解效果，该菌株对油基钻屑石油烃污染物的降解率达72.75％。本发明菌株NC-17在63天内对石油烃含量为5％的油基钻屑降解率可达到72.75％以上，其中钻屑残留油含量为1.4％，达到了《页岩气勘探开发油基岩屑处理方法及控制指标》(GB/T41518-2022)资源化利用要求(含油率≤2％)，适用于高浓度油基钻屑的生物修复。

序列1：SEQ ID NO.1(5’-3’)16S rDNA的核苷酸序列，长1391bp。

GTGCTTACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCCTTTCGGGGGTACACGAGCGGC GAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCAAAGGCTGCATGGCTTTTGGTGGAAAGGTTTACTGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAAACCAGCAGCTCAACTGCTGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATATACCGGAAAGCCGTAGAGATACGGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGGACTCGCAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGG。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。